孫鑫，文柳瓔，尹鵬嘉，羅成剛，樊文強(qiáng),3，任民

1 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院煙草研究所，中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院煙草遺傳改良與生物技術(shù)重點(diǎn)開放實(shí)驗(yàn)室,山東青島科苑經(jīng)四路11號(hào) 266101；2 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院研究生院，北京海淀中關(guān)村南大街12號(hào) 100081；3 蒼溪縣扶貧互助社管理辦公室，四川蒼溪?jiǎng)⒓蚁?號(hào) 628400

烤煙煙堿含量的全基因組關(guān)聯(lián)分析

孫鑫1,2，文柳瓔1，尹鵬嘉1,2，羅成剛1，樊文強(qiáng)1,3，任民1

1 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院煙草研究所，中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院煙草遺傳改良與生物技術(shù)重點(diǎn)開放實(shí)驗(yàn)室,山東青島科苑經(jīng)四路11號(hào) 266101；2 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院研究生院，北京海淀中關(guān)村南大街12號(hào) 100081；3 蒼溪縣扶貧互助社管理辦公室，四川蒼溪?jiǎng)⒓蚁?號(hào) 628400

煙堿是煙草屬特有的一類生物堿，為加深對(duì)煙堿遺傳調(diào)控機(jī)制的解析，充分挖掘高煙堿優(yōu)異等位。本研究選取219份烤煙品種開展了RAD重測(cè)序研究，獲得了384,904個(gè)高質(zhì)量SNP位點(diǎn)的群體分型數(shù)據(jù)。同時(shí)在四川西昌和山東諸城2個(gè)試驗(yàn)點(diǎn)，于2012—2015年相同栽培管理?xiàng)l件下對(duì)供試品種的煙葉煙堿含量進(jìn)行了表型鑒定。利用全基因組關(guān)聯(lián)分析的策略，共發(fā)掘到2個(gè)與煙堿含量顯著關(guān)聯(lián)的SNP位點(diǎn)，分別位于1號(hào)染色體的69,912,063bp處和2號(hào)染色體的81,115,794bp處?；谏鲜鯯NP位點(diǎn)預(yù)測(cè)到2個(gè)候選基因，并將目標(biāo)SNP位點(diǎn)轉(zhuǎn)化3對(duì)可通過PCR檢測(cè)的功能標(biāo)記。通過以上研究，加深了煙堿遺傳調(diào)控機(jī)制的解析，為高煙堿優(yōu)異等位基因型的發(fā)掘和高煙堿新品種的分子標(biāo)記輔助選擇提供了可用的標(biāo)記和基因資源。

煙草；煙堿；全基因組關(guān)聯(lián)分析；重測(cè)序；單核苷酸多態(tài)性

煙堿即尼古丁（nicotine），是煙草生物堿中的主要成分，約占生物堿總含量的90%~95%[1]。其含量高低是煙草和卷煙工業(yè)中重要的品質(zhì)指標(biāo)[2]。同時(shí)，煙堿在醫(yī)學(xué)上也可用于阿爾茨海默氏病和帕金森綜合癥的治療[2-3]；在農(nóng)業(yè)上，可作為綠色農(nóng)藥用于生產(chǎn)殺蟲劑、除草劑和植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑[4]；此外，煙堿在動(dòng)物疾病防治等方面也有著一定的用途[2]。

煙堿在煙草根部合成，最終轉(zhuǎn)運(yùn)至葉部細(xì)胞液泡內(nèi)進(jìn)行貯存積累[5]。煙堿含量屬于典型的數(shù)量性狀，雖然受到多種因素的影響[6]，但遺傳因素是決定品種間含量差異的基礎(chǔ)[5,7]。因此可利用分子標(biāo)記直接從基因水平上檢測(cè)高、低煙堿基因型，并可有效避免常規(guī)表型鑒定中存在的周期長(zhǎng)、成本高、易受環(huán)境影響等問題，進(jìn)而提高檢測(cè)效率，降低研究成本。近年來，已有研究對(duì)煙草煙堿含量進(jìn)行了QTL分析、關(guān)聯(lián)分析以及相關(guān)代謝途徑的基因功能解析，定位到多個(gè)QTL位點(diǎn)，明確了部分基因在合成代謝途徑中的作用[8-13]。但是,仍然存在著定位區(qū)間較大，功能基因遺傳多樣性對(duì)品種煙堿含量表型變異的影響不明確等的局限性[14]，需要進(jìn)一步開展品種間遺傳差異解析和基因發(fā)掘研究。

近年來，隨著高通量測(cè)序技術(shù)即二代測(cè)序技術(shù)[15](Next-generation sequencing, NGS)的快速發(fā)展。限制性酶切位點(diǎn)相關(guān)DNA（Restriction-site associated DNA, RAD）測(cè)序成為當(dāng)前簡(jiǎn)化基因組測(cè)序策略中運(yùn)用較為廣泛的測(cè)序技術(shù)，具有基因組覆蓋均勻、成本低、周期短等特點(diǎn)[16]。與全基因組關(guān)聯(lián)分析(genome-wide association study, GWAS)[17-18]方法結(jié)合可以取得較高的研究效率，在數(shù)量遺傳性狀研究方面潛力巨大。本研究對(duì)219份烤煙品種開展了RAD重測(cè)序，采用全基因組關(guān)聯(lián)分析的方法，發(fā)掘與煙堿含量變異顯著關(guān)聯(lián)的單核苷酸多態(tài)性(Singlenucleotide polymorphism, SNP)位點(diǎn)，并預(yù)測(cè)候選基因，開發(fā)功能標(biāo)記，為煙草高煙堿品種的選育，提供可用的標(biāo)記資源及相應(yīng)的理論支持。

1 材料與方法

1.1 供試材料的構(gòu)建

本研究所用219份烤煙品種(見附表1，因版面原因不在紙質(zhì)版刊登，詳見電子版)由國家煙草種質(zhì)資源中期庫提供。從2012—2015年連續(xù)在四川西昌和山東諸城2個(gè)實(shí)驗(yàn)基地開展了田間種植和制樣。采用隨機(jī)區(qū)組實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，每個(gè)品種種植2行，3次重復(fù)。每行20株，行距1.0 m，株距0.5m。西昌和諸城實(shí)驗(yàn)點(diǎn)的栽培管理措施一致，待煙葉成熟后，采收煙株中部葉片，三重復(fù)混收。經(jīng)烘烤調(diào)制制備煙葉樣品，烘烤方法參照楊立均等[19]的方法。

1.2 供試材料煙堿含量的測(cè)定

烤后煙葉樣品煙堿含量測(cè)定由農(nóng)業(yè)部煙草產(chǎn)業(yè)產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)測(cè)試中心進(jìn)行。檢測(cè)的儀器為SAN++連續(xù)流動(dòng)分析儀（荷蘭SKALAR公司）和410型火焰光度計(jì)（英國Sherwood公司）。檢測(cè)方法參照行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)《YC/T 217—2007》。

1.3 簡(jiǎn)化基因組重測(cè)序（RAD-Seq）及SNP鑒定

采用TIANGENE? Plant Genomic DNA Kit（天根生化科技（北京）有限公司）提取供試品種的全基因組DNA，并用1.0%的瓊脂糖凝膠電泳和NanoDrop 2000 分光光度計(jì)對(duì)DNA 質(zhì)量進(jìn)行檢測(cè)。RAD簡(jiǎn)化基因組重測(cè)序及SNP鑒定與華大基因有限公司合作開展，采用EcoR I限制性內(nèi)切酶對(duì)供試品種DNA進(jìn)行酶切并隨機(jī)打斷，電泳回收目標(biāo)DNA片段，加上接頭后進(jìn)行cluster制備，最后上機(jī)測(cè)序，測(cè)序儀器為IlluminaHiseq 2000；從測(cè)序后Clean Data數(shù)據(jù)中采用GATK-3.2-2流程（https://www.broadinstitute.org/gatk/）進(jìn)行SNP鑒定。

1.4 數(shù)據(jù)分析

1.4.1 表型數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

對(duì)供試材料8個(gè)環(huán)境點(diǎn)的煙堿含量檢測(cè)數(shù)據(jù)進(jìn)行整理后，利用SAS 9.3[20]軟件計(jì)算各品種的煙堿含量最佳無偏預(yù)測(cè)值（BLUP）[21]，代表每個(gè)供試品種的煙堿表型變異。表型差異顯著性檢驗(yàn)采用SPSS 18.0[20,22-23]軟件的one-way ANOVA進(jìn)行分析。

1.4.2 群體遺傳學(xué)分析

利用MEGA 7.0[24]軟件依據(jù)Maximum Composite Likelihood模型計(jì)算供試品種間的遺傳相似性，并用Neighbor-Joining[25]法繪制供試群體聚類樹。采用DnaSP 5.0[26]計(jì)算供試群體的核苷酸多態(tài)性（Nucleotide Polymorphism）π值和 π(JC)值。SNP間的連鎖不平衡（LD，Linkage Disequilibrium）分析采用Haploview 4.2[27]軟件，SNP位點(diǎn)間距小于500kb，忽略缺失率超過50%的個(gè)體。

1.4.3 全基因組關(guān)聯(lián)分析

全基因組關(guān)聯(lián)分析采用TASSEL V5.0[28]的混合線性模型MLM (PCA+K)進(jìn)行，統(tǒng)計(jì)模型為 y = marker e ff ect + PCA + K + residual。依次過濾掉稀有等位頻率（MAF）≤5.0%、無多態(tài)性和缺失率高于10.0%的SNP位點(diǎn)。PCA分析設(shè)置Components為5。家系關(guān)系分析（K）Kinship method為Centered_IBS，Max Alleles為6。MLM 模型的Compression Level為 Optimum Level，Variance Component Estimation選擇了P3D。關(guān)聯(lián)位點(diǎn)顯著性閾值的判別采用基于FWER (Family-Wise Error Rate)標(biāo)準(zhǔn)的Bonferroni校正法，p = a / n (a = 0.05，n為實(shí)際用到的SNP位點(diǎn)數(shù) )。

1.5 候選基因預(yù)測(cè)

基于關(guān)聯(lián)結(jié)果，借助煙草基因組數(shù)據(jù)庫（http://218.28.140.17/），將關(guān)聯(lián)位點(diǎn)定位到煙草連鎖群上，確定其物理位置，繼而確定關(guān)聯(lián)位點(diǎn)上下游相鄰基因。借助煙草基因組數(shù)據(jù)庫及tair網(wǎng)站（http://www.arabidopsis.org/）相應(yīng)基因的功能注釋，進(jìn)行候選基因預(yù)測(cè)。

1.6 SNP標(biāo)記轉(zhuǎn)化

得到目標(biāo)SNP位點(diǎn)后，首先利用煙草基因組數(shù)據(jù)庫（http://218.28.140.17/），截取SNP位點(diǎn)上下游各300bp的序列；然后通過WASP[29]網(wǎng)站（http://bioinfo.biotec.or.th/WASP）設(shè)計(jì)AS-PCR引物，并合成引物；最后用1.0%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)以確定實(shí)際擴(kuò)增效果。

2 結(jié)果與分析

2.1 煙草種質(zhì)煙堿含量的表型變異統(tǒng)計(jì)分析

對(duì)供試品種8個(gè)年點(diǎn)的煙堿含量表型變異進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果顯示各年點(diǎn)的變異系數(shù)均表現(xiàn)出較高的幅度，表明品種間表型變異豐富（表1）。進(jìn)而根據(jù)8個(gè)年點(diǎn)的表型變異數(shù)據(jù)，計(jì)算每個(gè)供試品種的煙堿含量最佳無偏預(yù)測(cè)值（BLUP），以代表每個(gè)供試品種的煙堿含量表型變異水平。煙堿含量表型變異BLUP值平均為3.087，變幅從1.196到5.732（圖1A），經(jīng)w檢驗(yàn)符合正態(tài)分布（圖1B）。煙堿含量最高的5個(gè)品種為福泉朝天立、8022、開陽團(tuán)魚葉、畢金一號(hào)和長(zhǎng)葛柳葉，其BLUP值分別達(dá)到4.442、4.512、4.546、4.563和 5.732；最低的 5個(gè)品種為大柳條、9201、OX2028、福泉高腳黃和TI1112，其 BLUP值 分 別 為 1.196、1.366、1.636、1.639和1.651。

表1 各年點(diǎn)煙堿含量的描述統(tǒng)計(jì)Tab.1 Descriptive statistics of nicotine content of different years/at different sites

圖 1 供試材料各年點(diǎn)煙堿含量表型變異分析圖Fig.1 Variation analysis of nicotine content from the tested materials of different years/at different sites

2.2 供試群體簡(jiǎn)化基因組重測(cè)序

通過簡(jiǎn)化基因組（RAD）重測(cè)序在供試群體上一共檢測(cè)到1,935,878個(gè)SNP位點(diǎn)，其中定位到染色體序列上的有1,167,614個(gè)SNP位點(diǎn)，在染色體序列上平均SNP間距2,738 bp。從上述SNP數(shù)據(jù)中進(jìn)一步過濾得到了384,904個(gè)有高質(zhì)量分型的SNP位點(diǎn)，平均間距8,311 bp，占發(fā)掘到SNP位點(diǎn)的33%。分析了24條染色體上SNP的密度分布情況，發(fā)現(xiàn)在17號(hào)染色體上SNP的密度較高，高密度的部分主要集中在17號(hào)染色體的前半部（圖2）?；蛐蛄蠸NP的突變類型中錯(cuò)義突變11142個(gè)，占59.567%，無義突變654個(gè)，占3.496%，同義突變6909個(gè)，占36.937%。

圖2 24條染色體的SNP密度分布熱圖Fig.2 SNP density heat mapof 24 chromosomes

2.3 供試群體遺傳多樣性分析

通過計(jì)算供試群體的核苷酸多態(tài)性（Nucleotide Polymorphism）可知，總?cè)后w的π值為：0.04051，π(JC)值為：0.04051；國內(nèi)育成品種的π值為：0.05868，π(JC)值為：0.06217；國外引進(jìn)品種的π值為：0.04231，π(JC)值為：0.04501；國內(nèi)地方品種的π值為：0.02574，π(JC)值為：0.02653。表明，供試群體中國內(nèi)育成品種和國外引進(jìn)品種的遺傳多樣性較高，國內(nèi)地方品種的遺傳多樣性較低。供試品種的NJ聚類分析（圖3）也反映出上述結(jié)論，國內(nèi)育成品種和國外引進(jìn)品種的聚類關(guān)系更加發(fā)散，而國內(nèi)地方品種則集中在少數(shù)分枝。并且從圖3中還可以發(fā)現(xiàn)國內(nèi)育成品種和國外引進(jìn)品種在多個(gè)聚類分枝上互相交錯(cuò)，表明有一定的基因交流。上述現(xiàn)象與我國當(dāng)前育種中大量采用優(yōu)異引進(jìn)品種作親本材料的育種實(shí)踐是相符的。但國內(nèi)地方品種與育成品種的交錯(cuò)較少，上述現(xiàn)象與其他作物有較大區(qū)別。

圖3 供試群體的N-J聚類樹Fig.3 Neighbor-joining cluster of the tested materials

2.4 供試群體SNP變異位點(diǎn)與煙堿含量的全基因組關(guān)聯(lián)分析

在依據(jù)材料與方法1.4.3的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行了數(shù)據(jù)處理后，將供試群體的煙堿含量表型數(shù)據(jù)與SNP數(shù)據(jù)進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析。實(shí)際進(jìn)入關(guān)聯(lián)分析運(yùn)算的SNP位點(diǎn)共274,652處。根據(jù)Bonferroni[30]法可知，關(guān)聯(lián)位點(diǎn)的顯著性p-value應(yīng)當(dāng)?shù)陀?.82×10-7，即本研究的顯著性閾值應(yīng)為6.7（-log10p-value）。據(jù)此閾值共發(fā)掘到2個(gè)關(guān)聯(lián)SNP位點(diǎn)（圖4），分別位于1號(hào)和2號(hào)染色體。其中1號(hào)染色體上的SNP位點(diǎn)位于該染色體的69,912,063bp處（C1_69,912,063），-log10p-value= 9.667，能夠解釋24.5%的表型變異，2號(hào)染色體上的SNP位點(diǎn)位于2號(hào)染色體的81,115,794bp處（C2_81,115,794），-log10p-value= 7.198，能夠解釋17.92%的表型變異。

2.5 高煙堿含量?jī)?yōu)異等位變異的篩選

對(duì)關(guān)聯(lián)到的SNP位點(diǎn)進(jìn)行了不同基因型間煙堿含量的統(tǒng)計(jì)分析。結(jié)果表明，SNP位點(diǎn)C1_69,912,063在群體中的等位變異為A和C。A基因型煙堿含量平均BLUP值為3.502，C基因型BLUP值為2.768。方差分析結(jié)果表明，該SNP不同等位變異間煙堿含量差異達(dá)到極顯著水平（圖5A），A基因型煙堿含量高，為該位點(diǎn)的優(yōu)異等位變異，占供試品種總數(shù)的36.1%；SNP位點(diǎn)C2_81,115,794，在群體中的等位變異為T和C，T基因型煙堿含量平均BLUP值為3.413，C基因型BLUP值為2.736。方差分析結(jié)果表明，該SNP不同等位變異間煙堿含量差異達(dá)到極顯著水平（圖5B），T基因型煙堿含量高，為該位點(diǎn)的優(yōu)異等位變異，占供試品種總數(shù)的44.7%。

圖4 煙堿含量全基因組關(guān)聯(lián)分析Fig. 4 Manhattan plot for genome-wide association analysis of nicotine contento

圖5 不同SNP位點(diǎn)基因型所對(duì)應(yīng)的煙堿含量Fig.5 Different average nicotine content between two alleles

2.6 煙堿含量相關(guān)候選基因預(yù)測(cè)

通過中國煙草基因組數(shù)據(jù)庫分析了上述2個(gè)關(guān)聯(lián)位點(diǎn)上下游的基因注釋、功能預(yù)測(cè)，同時(shí)結(jié)合關(guān)聯(lián)區(qū)段的連鎖不平衡（LD）分析，進(jìn)行了煙堿含量相關(guān)候選基因的預(yù)測(cè)。依據(jù)與關(guān)聯(lián)位點(diǎn)處于同一個(gè)LD區(qū)段，基因的功能注釋可能與煙堿代謝調(diào)控相關(guān)等原則，在緊鄰關(guān)聯(lián)位點(diǎn)的位置預(yù)測(cè)到2個(gè)煙堿含量候選基因，編號(hào)分別為Ntab0691660和Ntab0574880。編號(hào)為Ntab0691660的基因位于關(guān)聯(lián)位點(diǎn)C1_69,912,063的下游28kb處，該基因與擬南芥ATCYS6基因同源。在擬南芥中，ATCYS6編碼具有半胱氨酸蛋白酶抑制劑活性的蛋白質(zhì)，過度表達(dá)可增加對(duì)非生物脅迫因素的耐受能力，故推測(cè)Ntab0691660可能通過調(diào)控生物脅迫抗受能力相關(guān)通路參與了煙堿合成代謝的調(diào)控；候選基因Ntab0574860位于關(guān)聯(lián)位點(diǎn)C2_81,115,794的下游約19kb處（圖6），該基因與關(guān)聯(lián)位點(diǎn)共同位于一個(gè)單體型（Haplotype）中，與水稻中的OSJMJ706基因同源。JMJ706基因編碼一個(gè)異染色質(zhì)相關(guān)的去甲基化酶，有較弱的去甲基化酶的活性，相關(guān)位點(diǎn)的甲基化修飾與轉(zhuǎn)錄抑制相關(guān)，功能缺失突變體表現(xiàn)為甲基化修飾程度積累，影響小穗及花發(fā)育[31-32]。推測(cè)在煙草中，Ntab0574860可能與煙堿合成關(guān)鍵酶腐胺N-甲基轉(zhuǎn)移酶[1]（PMT，putrescine-N-methyltransferase）相關(guān)基因的表達(dá)調(diào)控有關(guān)，從而影響了最終煙堿含量的表型變異。

圖6 高煙堿含量候選基因預(yù)測(cè)Fig. 6 Candidate genes prediction of high nicotine content

2.7 SNP位點(diǎn)的功能標(biāo)記開發(fā)

針對(duì)關(guān)聯(lián)位點(diǎn)和候選基因設(shè)計(jì)了相應(yīng)的等位變異特異PCR(AS-PCR)[33]標(biāo)記，相關(guān)序列見表2。關(guān)聯(lián)位點(diǎn)C1_69,912,063篩選到1個(gè)可用的標(biāo)記AP014，實(shí)際擴(kuò)增檢驗(yàn)表明，其擴(kuò)增帶型清晰，分型結(jié)果與測(cè)序一致（圖7）。以供試材料41和8分別為A、C等位變異的對(duì)照品種，依據(jù)擴(kuò)增帶型可方便快捷的鑒定供試材料在該位點(diǎn)上的堿基類型。

SNP位點(diǎn)C2_81,134,669緊鄰關(guān)聯(lián)位點(diǎn)C2_81,115,794，位于候選基因Ntab0574860的上游5Kb以內(nèi)的調(diào)控區(qū)域，由于和關(guān)聯(lián)位點(diǎn)C2_81,115,794同處于一個(gè)緊密的LD區(qū)間（見圖6），因而對(duì)煙堿含量的選擇有著相同的效率。該位點(diǎn)在供試群體上等位變異為T和G，分別占供試群體的40.0%和60.0%。從該位點(diǎn)上篩選到2組擴(kuò)增帶型清晰的AS-PCR標(biāo)記(圖7)：AP068和AP072，均以供試材料41和8為T、C等位變異的對(duì)照品種。

圖7 SNP位點(diǎn)的功能標(biāo)記開發(fā)Fig.7 Functional markers development of SNP loci

表2 引物序列Tab.2 AS-PCR primer sequences

3 討論與結(jié)論

3.1 煙堿含量定位結(jié)果比較分析

本研究通過全基因組關(guān)聯(lián)分析策略，在煙草基因組內(nèi)定位到2個(gè)與煙堿含量變異顯著關(guān)聯(lián)的位點(diǎn)或區(qū)段，峰值SNP分別在1號(hào)染色體的69,912,063 bp處（C1_69,912,063），和2號(hào)染色體的81,115,794 bp處（C2_81,115,794）。在已有的報(bào)道[9-10,12,34-35]中，主要通過構(gòu)建分離群體的方法定位到了若干煙堿含量QTL位點(diǎn)，數(shù)量從2到8個(gè)不等。所用分子標(biāo)記主要為以PCR為基礎(chǔ)的第二代標(biāo)記技術(shù)，包括了RAPD、SRAP、ISSR、AFLP和SSR等。與以往研究相比，得益于近年來快速發(fā)展的高通量測(cè)序技術(shù)，本研究實(shí)現(xiàn)了更高密度的基因組覆蓋，同時(shí)通過SNP位點(diǎn)直接將目標(biāo)性狀的QTL區(qū)段定位到物理圖譜，在以下2個(gè)方面取得了顯著的優(yōu)勢(shì)，首先，關(guān)聯(lián)SNP位點(diǎn)有唯一的物理位置，方便了今后不同研究之間的比較和補(bǔ)充；其次，自然群體攜帶了更多的染色體交換事件[36]，加之高密度的SNP位點(diǎn)，可以獲得更加精細(xì)的遺傳定位信息，從而為下一步的基因發(fā)掘和分子育種應(yīng)用奠定了更好的基礎(chǔ)。

3.2 關(guān)聯(lián)位點(diǎn)在煙草分子育種中的應(yīng)用

鑒于通過高通量測(cè)序得到的SNP位點(diǎn)難以直接用于煙草分子育種，本研究還開展了SNP到AS-PCR標(biāo)記轉(zhuǎn)化的研究。AS-PCR標(biāo)記是基于PCR技術(shù)的新型分子標(biāo)記，通過2條競(jìng)爭(zhēng)性引物，可對(duì)模板DNA中目標(biāo)SNP位點(diǎn)的堿基組成進(jìn)行特異檢測(cè)[37-38]。本研究針對(duì)2個(gè)關(guān)聯(lián)位點(diǎn)，設(shè)計(jì)出了3組可用的ASPCR標(biāo)記。上述標(biāo)記的特異性強(qiáng)，擴(kuò)增條帶易于識(shí)別，方便應(yīng)用于煙草分子育種。研究加深了對(duì)煙堿含量相關(guān)基因遺傳變異的理解，為優(yōu)異基因的聚合提供了實(shí)驗(yàn)證據(jù)，為高煙堿材料的選育提供了分子依據(jù)。

3.3 問題與展望

在開展煙葉成熟期煙堿含量表型鑒定的過程中，由于煙草植株大，生長(zhǎng)周期長(zhǎng)，導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)用地面積大，研究成本高，限制了供試群體規(guī)模的擴(kuò)大。下一步，擬開展苗期的表型鑒定研究，以降低研究成本，方便擴(kuò)大供試群體規(guī)模。同時(shí)，擬增加表型鑒定的范圍，從煙堿含量的檢測(cè)擴(kuò)大到相關(guān)基因的表達(dá)分析，即表達(dá)基因組關(guān)聯(lián)分析[39](expression genome-wide association study, eGWAS)研究。通過表達(dá)基因相關(guān)位點(diǎn)的關(guān)聯(lián)分析，進(jìn)一步挖掘煙堿含量相關(guān)位點(diǎn)，繼而開展基于表達(dá)基因的SNP位點(diǎn)發(fā)掘及候選基因預(yù)測(cè)等后續(xù)研究。

另外，下一步對(duì)預(yù)測(cè)的候選基因還將繼續(xù)開展功能驗(yàn)證，比如進(jìn)行過表達(dá)[40]和CRISPR/CAS9敲除[41]等，進(jìn)一步分析明確候選基因功能，為高煙堿品種的選育提供堅(jiān)實(shí)的理論依據(jù)。

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附表 1 本研究所用的219份供試品種Supplementary Table1 219 tested materials in this study

續(xù)表

續(xù)表

：SUN Xin, WEN Liuying, YIN Pengjia, et al. Genome-wide association study of nicotine content in fl ue-cured tobacco [J]. Acta Tabacaria Sinica, 2017, 23(1)

*Corresponding author. Email：renmin@caas.cn

Genome-wide association study of nicotine content in fl ue-cured tobacco

SUN Xin1,2, WEN Liuying1, YIN Pengjia1,2, LUO Chenggang1, FAN Wenqiang3, REN Min1*
1 Tobacco Research Institute, Chinese Academy of Agricultural Sciences/ Key Laboratory of Tobacco Genetic Improvement and Biotechnology, Qingdao 266101, Shandong, China;2 Post Graduate School, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing 100081, China;3 Poverty Alleviation and Mutual Aid Cooperative Management Office, Cangxi County, Cangxi 628400, Sichuan, China

Nicotine is a species-speci fi c alkaloid in Nicotiana.219 fl ue-cured tobacco varieties were selected as tested materials and a high quality SNP genotyping dataset of 384,904 loci were obtained via whole genome RAD resequencing. For phenotyping of nicotine content of cured leaves, all varieties studied were planted in 2 di ff erent experimental sites (Xichang of Sichuan province and Zhucheng of Shandong province) under same cultivation and management conditions from 2012 to 2015. Genome-wide association study showed that there were 2 peak SNPs signi fi cantly correlated with nicotine content (p<0.000001) which was located on 69,912,063 bp of chromosome 1 (C1_69,912,063) and 81,115,794 bp of chromosome 2 (C2_81,115,794) respectively. Based on the above mentioned SNPs, 2 candidate genes were predicted and 3 novel Allele-Speci fi c PCR markers were veri fi ed. This study gave a comprehensive understanding of nicotine genetic variation and provided available gene and molecular marker resources for the high-nicotine tobacco varieties breeding.

tobacco; nicotine; genome wide association study; resequencing; single nucleotide polymorphism

孫鑫，文柳瓔，尹鵬嘉，等. 烤煙煙堿含量的全基因組關(guān)聯(lián)分析[J]. 中國煙草學(xué)報(bào)，2016,23（1）

中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院科技創(chuàng)新工程(ASTIP-TRIC01) ；國家煙草專賣局煙草基因組計(jì)劃重大專項(xiàng) (110201301008)；中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院煙草研究所青年科學(xué)基金（2015A01）

孫鑫（1992—），碩士，主要從事煙草煙堿含量遺傳變異研究，Tel：18563934302，Email：sunxincaas@163.com

任民（1979—），Tel：0532-88702209，Email：renmin@caas.cn

2016-09-12；< class="emphasis_bold">網(wǎng)絡(luò)出版日期：

日期：2017-01-25