郭安鵲 張星星 張予林 董 鑫 陳力維

(西北農(nóng)林科技大學(xué)葡萄酒學(xué)院，陜西楊凌 712100)

葡萄酒中總鐵和Fe2+的改良菲洛嗪法快速測(cè)定

郭安鵲 張星星 張予林 董 鑫 陳力維

(西北農(nóng)林科技大學(xué)葡萄酒學(xué)院，陜西楊凌 712100)

通過優(yōu)化菲洛嗪法測(cè)定葡萄酒中總鐵的檢測(cè)條件，以及探討Fe3+共存時(shí)菲洛嗪用量對(duì)Fe2+測(cè)定的影響，建立一種簡(jiǎn)易可靠、能夠直接測(cè)定葡萄酒中總鐵和Fe2+的方法。結(jié)果顯示：改良菲洛嗪法測(cè)定葡萄酒中的總鐵，在0.25～2.00 mg/L質(zhì)量濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，檢測(cè)限為0.011 5 mg/L，加標(biāo)回收率為94.31%～104.34%，變異系數(shù)范圍為0.95%～2.43%；然而，共存的Fe3+會(huì)影響對(duì)葡萄酒中Fe2+的測(cè)定，適合的顯色劑用量是菲洛嗪與總鐵摩爾比為7，在此條件下，F(xiàn)e2+質(zhì)量濃度的擬合準(zhǔn)確度為101.98%～113.50%。利用該法測(cè)定葡萄酒樣品的結(jié)果表明，葡萄酒中以Fe2+為主，其在紅葡萄酒中的百分比相對(duì)較高?？傊倪M(jìn)的方法簡(jiǎn)單易行、準(zhǔn)確可靠，能夠滿足葡萄酒中鐵價(jià)態(tài)的快速定量測(cè)定，適于在葡萄酒生產(chǎn)中推廣應(yīng)用。

葡萄酒； 菲洛嗪法； 總鐵； Fe2+； 快速測(cè)定

引言

葡萄酒氧化機(jī)制的研究表明，葡萄酒的氧化主要表現(xiàn)為酚類物質(zhì)的氧化，銅、鐵離子特別是后者在引發(fā)和延伸氧化反應(yīng)中起著關(guān)鍵的催化作用[1-3]。隨著不銹鋼罐的廣泛應(yīng)用，葡萄酒中的鐵含量大幅下降，成品酒中鐵的質(zhì)量濃度為0.5～5.0 mg/L[4]。然而，近年來的大量研究結(jié)果顯示，葡萄酒中鐵的離子形態(tài)及其分布是其催化氧化作用的關(guān)鍵所在，即使是微量的鐵仍能引起葡萄酒的氧化褐變，嚴(yán)重影響酒的感官質(zhì)量[5-8]。

眾所周知，因所處的還原環(huán)境及酸度條件，葡萄酒中的鐵以Fe2+為主[7,9]。目前，通過固相萃取技術(shù)進(jìn)行樣品前處理，然后利用原子吸收光譜法、電感耦合等離子體光譜法(ICP-OES)等檢測(cè)葡萄酒中鐵的離子存在形態(tài)[10-11]，以及利用電化學(xué)方法測(cè)定葡萄酒中的鐵價(jià)態(tài)[12]，國(guó)內(nèi)外均有文獻(xiàn)報(bào)道。但上述方法操作復(fù)雜，檢測(cè)成本高，不適于在葡萄酒生產(chǎn)中推廣應(yīng)用。尤其是，樣品在前處理過程中，很容易因酒樣與空氣長(zhǎng)時(shí)間接觸、pH值調(diào)整等問題改變Fe2+/Fe3+氧化還原電子對(duì)的平衡，影響鐵形態(tài)測(cè)定的準(zhǔn)確度和精確度。相比之下，分光光度法操作簡(jiǎn)單、成本低，是測(cè)定葡萄酒中鐵形態(tài)的常用方法。

基于不同顯色劑與Fe2+或Fe3+作用形成特定有色絡(luò)合物的原理，利用分光光度計(jì)能夠很容易測(cè)定溶液中的Fe2+或Fe3+，由此出現(xiàn)了大量測(cè)定鐵形態(tài)的顯色劑。研究結(jié)果表明，由于測(cè)定Fe3+的顯色劑受限于所測(cè)溶液中氯、焦磷酸等離子的濃度要求，有關(guān)Fe2+顯色劑的研究越來越受到重視[13]。其中，菲洛嗪(Ferrozine)已經(jīng)成為實(shí)踐中定量測(cè)定Fe2+應(yīng)用最廣的物質(zhì)[13-15]。目前，已有利用菲洛嗪法測(cè)定葡萄酒中鐵形態(tài)的研究報(bào)道[10,13]。近年來，DANILEWICZ[7]在研究白葡萄酒中的Fe2+/Fe3+比和氧化還原狀態(tài)時(shí)，以菲洛嗪分光光度法為基礎(chǔ)，在不改變樣品pH值的條件下，借助外推法確定葡萄酒中Fe2+的含量，很有借鑒意義。然而，與Fe3+共存時(shí)，菲洛嗪法測(cè)定Fe2+往往會(huì)受到干擾，干擾程度與Fe3+濃度及顯色劑用量有關(guān)[15-17]。ANASTCIO等[17]認(rèn)為，F(xiàn)e3+可與菲洛嗪作用形成絡(luò)合物，該絡(luò)合物在光照下會(huì)被還原為Fe2+-菲洛嗪，直接導(dǎo)致Fe2+定量檢測(cè)的結(jié)果偏高。IM等[15]在研究中則發(fā)現(xiàn)，即使在避光條件下，F(xiàn)e3+也會(huì)干擾對(duì)Fe2+的測(cè)定，且干擾作用隨時(shí)間呈線性遞增趨勢(shì)；Fe3+濃度越高，干擾作用越明顯。在利用菲洛嗪法測(cè)定葡萄酒中鐵含量的文獻(xiàn)中，很少見到Fe3+對(duì)Fe2+測(cè)定影響的研究報(bào)道。

因此，本文通過在模擬葡萄酒中優(yōu)化菲洛嗪法的檢測(cè)條件和方法評(píng)價(jià)，建立一種簡(jiǎn)單易行、準(zhǔn)確可靠、直接適于葡萄酒中總鐵測(cè)定的方法；以總鐵測(cè)定為基礎(chǔ)，通過優(yōu)化Fe3+共存時(shí)測(cè)定Fe2+所需的菲洛嗪用量，借助多項(xiàng)式曲線擬合，利用外推法獲得葡萄酒中的Fe2+含量，最后通過差減法計(jì)算Fe3+的含量。

1 材料與方法

1.1 供試酒樣

模擬酒、成品白葡萄酒和紅葡萄酒。

1.2 主要供試試劑

Fe2+標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液(1.79 mmol/L)：準(zhǔn)確稱取49.78 mg FeSO4·6H2O(純度99.0%以上)，置于燒杯中溶解，迅速轉(zhuǎn)移至100 mL容量瓶，模擬酒定容至刻線。

抗壞血酸母液(1.79 mmol/L)：準(zhǔn)確稱取31.54 mg抗壞血酸(純度99.7%)，置于燒杯中溶解，快速轉(zhuǎn)移至100 mL棕色容量瓶，模擬酒定容至刻線。

菲洛嗪母液(10.74 mmol/L)：準(zhǔn)確稱取52.92 mg菲洛嗪(純度99.7%以上)，置于燒杯中溶解，迅速轉(zhuǎn)移至10 mL棕色容量瓶，模擬酒定容至刻線。

每次使用前，上述儲(chǔ)備液和母液均為新鮮配制，避光保存。所有化學(xué)試劑均為分析純，實(shí)驗(yàn)用水為去離子水，所有實(shí)驗(yàn)均在室溫(20℃)下進(jìn)行。

1.3 儀器與設(shè)備

主要設(shè)備：UV-2450型紫外-可見光分光光度計(jì)(日本島津公司)；PHS-3C型pH計(jì)(上海精密科學(xué)儀器有限公司)；BT25S型十萬分之一天平(德國(guó)Startorius公司)；PinAAcle500型原子吸收光譜儀(美國(guó)PE公司)；Mutiwave PRO型微波消解儀(奧地利安東帕公司)。

所有玻璃和塑料器材，均置于10%(體積分?jǐn)?shù))硝酸溶液中至少浸泡24 h，用去離子水清洗3次后，晾干，備用。

1.4 原理與方法

1.4.1總鐵測(cè)定原理

在酸性條件下，菲洛嗪與Fe2+反應(yīng)生成穩(wěn)定的紫色絡(luò)合物[Fe(Ferrozine)3]2+，在562 nm波長(zhǎng)處有最大光吸收，其吸光度與Fe2+質(zhì)量濃度成正比[14,18]。通過加入還原劑抗壞血酸(C6H8O6)，可將葡萄酒中的Fe3+還原為Fe2+，據(jù)此測(cè)定葡萄酒中的總鐵濃度。反應(yīng)式為

1.4.2模擬酒的配制及通氮?dú)馓幚?/p>

參照GUO等[8]的方法，將7 mmol/L酒石酸和11 mmol/L酒石酸氫鉀溶解到體積分?jǐn)?shù)12%的乙醇溶液中，利用1.0 mol/L氫氧化鈉和1.0 mol/L鹽酸調(diào)節(jié)溶液的pH值為3.20。使用前，對(duì)模擬酒進(jìn)行通氮?dú)馓幚?，密封后于室溫下避光放置?/p>

1.4.3標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

分別用移液槍吸取0、25、40、80、50、100、200 μL Fe2+標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液于10 mL棕色容量瓶，立即用模擬酒定容至刻線，配制0、0.25、0.40、0.50、0.80、1.00、2.00 mg/L 7個(gè)不同質(zhì)量濃度梯度的Fe2+標(biāo)準(zhǔn)溶液。然后分別向各容量瓶中加入適量的抗壞血酸母液和菲洛嗪母液。最后，混勻靜置30 min后，注入10 mm石英比色皿中，以空白做參比溶液，利用分光光度計(jì)于波長(zhǎng)562 nm處測(cè)定吸光度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。每個(gè)質(zhì)量濃度重復(fù)3次。

1.4.4葡萄酒中總鐵的測(cè)定

室溫下，葡萄酒開瓶后，快速吸取1 mL酒樣并移至10 mL棕色容量瓶中；向容量瓶中添加模擬酒至刻線(即酒樣被稀釋10倍，簡(jiǎn)稱“稀釋樣”)；依次加入適量的抗壞血酸母液和菲洛嗪母液，混勻，避光放置30 min后，以稀釋樣代替樣品做空白，并以此為參比樣測(cè)定波長(zhǎng)562 nm處的吸光度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算總鐵含量。每個(gè)酒樣重復(fù)3次。

1.4.5葡萄酒中Fe2+的測(cè)定

室溫下，葡萄酒一開瓶，就立即吸取1 mL酒樣加入事先通氮?dú)馓幚淼?0 mL棕色容量瓶中，添加模擬酒至刻線。隨后，直接加入適量的菲洛嗪，混勻后立即倒入比色皿中，以稀釋樣為參比，利用分光光度計(jì)于波長(zhǎng)562 nm處每隔1 min測(cè)定一次吸光度。最后，對(duì)前10 min內(nèi)的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行多項(xiàng)式曲線擬合，獲得擬合曲線方程的常數(shù)項(xiàng)A0(截距)，即反應(yīng)時(shí)間為0時(shí)絡(luò)合物所對(duì)應(yīng)的吸光度。利用總鐵標(biāo)準(zhǔn)曲線，通過反推法計(jì)算Fe2+的含量。每個(gè)酒樣重復(fù)3次。

1.4.6葡萄酒中Fe3+的計(jì)算

總鐵含量減去Fe2+的含量即為Fe3+的含量。

圖2 菲洛嗪和抗壞血酸用量對(duì)總鐵測(cè)定的影響Fig.2 Effects of ferrozine and ascorbic acid on total iron determination in model wine

1.4.7數(shù)據(jù)處理方法

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的ANOVA(Duncan新復(fù)極差法)分析采用軟件SPSS Statistics 21.0處理，每個(gè)處理重復(fù)3次，其結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。

2 結(jié)果與討論

2.1 菲洛嗪法測(cè)定葡萄酒中總鐵的條件優(yōu)化

2.1.1檢測(cè)波長(zhǎng)的確定

配制不同質(zhì)量濃度的Fe2+標(biāo)準(zhǔn)溶液，按照實(shí)驗(yàn)方法，利用分光光度計(jì)在400～700 nm(掃描間距為1.0 nm)波長(zhǎng)范圍內(nèi)掃描Fe2+與菲洛嗪形成的絡(luò)合物。由不同體系的吸收光譜(圖1)可以看出，曲線在波長(zhǎng)562 nm處均有最大吸收，且吸光度最大，與已有的文獻(xiàn)報(bào)道一致[14,19]，故檢測(cè)波長(zhǎng)選擇562 nm。

圖1 菲洛嗪與Fe2+絡(luò)合物的光吸收曲線Fig.1 Absorption spectra of Fe2+-ferrozine complex in model wine

摩爾吸光系數(shù)是衡量分光光度測(cè)定方法靈敏度的一個(gè)重要指標(biāo)，在模擬酒中，菲洛嗪的摩爾吸光系數(shù)是1,10-鄰菲啰啉摩爾吸光系數(shù)的2.4倍(表1)，表明菲洛嗪是較1,10-鄰菲啰啉更為靈敏的顯色劑。

表1 顯色劑菲洛嗪與1,10-鄰菲啰啉的摩爾吸光系數(shù)Tab.1 Molar absorptivity of ferrozine and 1,10-phenanthroline in model wine

注：同行上角不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)，下同。

2.1.2顯色劑和還原劑用量的確定

在含不同鐵形態(tài)的模擬酒中，首先加入過量的抗壞血酸，然后選擇添加不同用量的顯色劑菲洛嗪，混勻后反應(yīng)30 min，測(cè)定562 nm處吸光度，結(jié)果如圖2a所示。由結(jié)果分析可知，菲洛嗪與總鐵摩爾比為2～4時(shí)，由于菲洛嗪用量不足，測(cè)定結(jié)果偏低；當(dāng)摩爾比為6～12時(shí)，測(cè)定結(jié)果較為穩(wěn)定，說明在模擬酒中適宜的顯色劑用量是菲洛嗪與總鐵摩爾比為6，而且顯色劑過量對(duì)測(cè)定結(jié)果無顯著影響(P>0.05)。

選擇不同用量的還原劑抗壞血酸，然后加入顯色劑(菲洛嗪與總鐵摩爾比為6)，混勻后反應(yīng)30 min，測(cè)定吸光度。結(jié)果如圖2b所示，當(dāng)抗壞血酸與Fe3+摩爾比為0.5時(shí)(即兩者反應(yīng)的理論比值)，F(xiàn)e3+的還原并不完全，測(cè)定結(jié)果偏低；當(dāng)摩爾比不低于1時(shí)，反應(yīng)完全且測(cè)定結(jié)果非常穩(wěn)定，說明適宜的還原劑用量為抗壞血酸與Fe3+摩爾比為1。

2.1.3反應(yīng)時(shí)間的確定

按照實(shí)驗(yàn)方法，以及已經(jīng)確定的還原劑、菲洛嗪用量，選擇不同的反應(yīng)時(shí)間0、5、10、15、20、25、30、35、40 min，測(cè)定吸光度。結(jié)果如圖3所示，在反應(yīng)前5 min，吸光度快速上升，5～10 min內(nèi)仍緩慢增加，說明菲洛嗪和Fe2+的反應(yīng)開始很快，但并未達(dá)到平衡；10～40 min內(nèi)吸光度非常穩(wěn)定，變化不顯著，說明10 min時(shí)反應(yīng)達(dá)到平衡，且在隨后的30 min內(nèi)非常穩(wěn)定。

圖3 反應(yīng)時(shí)間對(duì)總鐵測(cè)定的影響Fig.3 Effect of reaction time on total iron determination in model wine

關(guān)于菲洛嗪與Fe2+形成紫色穩(wěn)定絡(luò)合物進(jìn)行比色之前的反應(yīng)時(shí)間，在最初的文獻(xiàn)報(bào)道中為1 min[20]；在改良方法中，也有反應(yīng)30 min的報(bào)道[15]。這主要取決于溶液的組成和內(nèi)部環(huán)境條件。在葡萄酒中，由于酒石酸、酚類物質(zhì)、蛋白質(zhì)等大分子物質(zhì)均能夠與鐵形成絡(luò)合物[11,21]，影響鐵與菲洛嗪的絡(luò)合，反應(yīng)達(dá)到平衡所需要的時(shí)間就相對(duì)要長(zhǎng)。因此，考慮到葡萄酒構(gòu)成的復(fù)雜性，反應(yīng)時(shí)間選擇30 min。

2.1.4pH值和共存金屬離子對(duì)總鐵測(cè)定的影響

溶液的酸度直接影響金屬離子的存在狀態(tài)和絡(luò)合物的穩(wěn)定性[22-23]，共存金屬離子則通過電子交換影響葡萄酒中的鐵形態(tài)[6, 24]。因此，在模擬酒中研究了共存金屬離子和pH值對(duì)總鐵測(cè)定的影響，共存金屬離子及其質(zhì)量濃度的選擇參照GUO等[8]的文獻(xiàn)，包括0.48 mg/L Al3+、0.98 mg/L Mn2+、1.17 mg/L Zn2+和1.14 mg/L Cu2+。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，pH值和其他共存金屬離子對(duì)總鐵質(zhì)量濃度測(cè)定均無顯著影響(表2、3)，因而優(yōu)化后的菲洛嗪法可直接用于測(cè)定葡萄酒中總鐵。

表2 pH值對(duì)總鐵測(cè)定(吸光度)的影響Tab.2 Effect of pH values on total iron determination in model wine

表3 共存金屬離子對(duì)總鐵測(cè)定(吸光度)的影響Tab.3 Effect of coexisting metal ions on total iron determination in model wine

2.2 總鐵測(cè)定方法的評(píng)價(jià)

2.2.1標(biāo)準(zhǔn)曲線和方法檢測(cè)限

按照改良后的菲洛嗪法，以空白為參比，測(cè)定0.25～2.00 mg/L 6個(gè)質(zhì)量濃度梯度的Fe2+標(biāo)準(zhǔn)溶液。以Fe2+質(zhì)量濃度(mg/L)為橫坐標(biāo)、562 nm處吸光度為縱坐標(biāo)，得到總鐵測(cè)定的標(biāo)準(zhǔn)曲線為y=0.522 5x-0.022 3，決定系數(shù)R2為0.997 9，說明鐵在0.25～2.00 mg/L質(zhì)量濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

按照美國(guó)環(huán)保總局計(jì)算檢測(cè)限的估計(jì)方法[25]：配制8份以標(biāo)準(zhǔn)曲線估計(jì)的檢測(cè)限質(zhì)量濃度的3倍即0.128 mg/L Fe2+加入空白樣品的Fe2+溶液，以改良菲洛嗪法測(cè)定，該方法檢出限的計(jì)算公式為

MDL=St(n-1,1-α)

式中S——加標(biāo)樣品測(cè)試結(jié)果的標(biāo)準(zhǔn)偏差

t——自由度為n-1時(shí)的Student’s值，當(dāng)n=8時(shí)，在99%置信區(qū)間(α=0.01)下，t=3.499

n——加標(biāo)樣品數(shù)量，n=8

經(jīng)計(jì)算，檢測(cè)限為0.011 5 mg/L。

2.2.2方法的準(zhǔn)確度和精密度

以模擬酒、白葡萄酒和紅葡萄酒為實(shí)驗(yàn)酒樣，利用改良菲洛嗪法和原子吸收光譜法分別測(cè)定加標(biāo)(加入Fe2+標(biāo)準(zhǔn)液)前后酒樣中的總鐵濃度，各重復(fù)3次，計(jì)算方法的回收率。結(jié)果如表4所示，改良菲洛嗪法與原子吸收光譜法的測(cè)定結(jié)果相差很小，并且方法回收率范圍為94.31%～104.34%，說明方法的準(zhǔn)確度很好。

表4 葡萄酒樣品中總鐵測(cè)定的回收率和方法比較Tab.4 Recovery rates of total iron determination in wine samples and comparison of two methods

選擇0.25、0.50、1.00 mg/L的Fe2+標(biāo)準(zhǔn)溶液和紅、白葡萄酒各1款，利用菲洛嗪法重復(fù)測(cè)定6次，結(jié)果表明，總鐵測(cè)定結(jié)果的變異系數(shù)范圍為0.95%～2.43%，說明方法的精密度良好。

目前，鄰菲啰啉比色法為國(guó)標(biāo)中推薦測(cè)定葡萄酒中鐵的方法。然而，該法必須進(jìn)行酒樣的消化前處理，過程非常繁瑣、耗時(shí)。而且，有研究顯示，當(dāng)水質(zhì)中總鐵質(zhì)量濃度低于1 mg/L時(shí)，其測(cè)定的精密度和準(zhǔn)確度較低[26-27]。相比之下，改良菲洛嗪法在測(cè)定葡萄酒總鐵含量方面優(yōu)勢(shì)明顯：不僅避免了繁雜的樣品前處理過程，而且準(zhǔn)確度和精密度高。

2.3菲洛嗪用量對(duì)葡萄酒中Fe2+測(cè)定的影響

按照實(shí)驗(yàn)方法，在總鐵為1.0 mg/L(Fe2+與Fe3+摩爾比為4)的模擬酒中，加入不同濃度的菲洛嗪，研究Fe3+共存時(shí)菲洛嗪用量對(duì)Fe2+測(cè)定的影響。

圖4a顯示了不同溶液的吸光度隨反應(yīng)時(shí)間(前10 min)的變化及其多項(xiàng)式擬合曲線(圖中僅列出了摩爾比為7時(shí)的擬合曲線方程，A0為曲線截距)。結(jié)果表明，隨著菲洛嗪添加量的增加，F(xiàn)e2+質(zhì)量濃度所對(duì)應(yīng)的吸光度增大，而R2卻在不斷減?。惶貏e是當(dāng)摩爾比為8時(shí)，曲線的R2已經(jīng)很差。圖4b為利用外推法獲得的Fe2+質(zhì)量濃度與實(shí)際值(0.8 mg/L，圖4b中的橫向虛線部分)的平均擬合準(zhǔn)確度，由結(jié)果分析可知，當(dāng)摩爾比為7時(shí)，測(cè)定Fe2+濃度與實(shí)際值最為接近，擬合準(zhǔn)確度為105.87%。而且，該比例下擬合曲線的R2很好(圖4a)，說明菲洛嗪的添加量最為適合。由此可見，在Fe3+共存條件下，存在一個(gè)最適合的菲洛嗪用量：過少或過多都會(huì)影響對(duì)葡萄酒中Fe2+的測(cè)定。

圖4 不同菲洛嗪用量對(duì)Fe2+測(cè)定的影響Fig.4 Effect of ferrozine on Fe2+ determination in model wine

為了確保菲洛嗪用量的準(zhǔn)確性和適用性，實(shí)驗(yàn)隨后在含有不同F(xiàn)e2+與Fe3+摩爾比的模擬酒中(總鐵質(zhì)量濃度為1.0 mg/L)，加入菲洛嗪(菲洛嗪與總鐵摩爾比為7)，依據(jù)Fe2+的測(cè)定方法，計(jì)算Fe2+質(zhì)量濃度。結(jié)果表明，4階多項(xiàng)式擬合曲線的R2均在0.95以上，擬合的準(zhǔn)確度在101.98%～113.50%之間(表5)；這說明：在Fe3+共存條件下，選擇菲洛嗪與總鐵摩爾比為7時(shí)，對(duì)葡萄酒中Fe2+的測(cè)定效果最好。另外，不難發(fā)現(xiàn)，隨著Fe2+與Fe3+摩爾比的降低，即Fe3+濃度的增加，擬合曲線的R2在下降，F(xiàn)e2+的擬合準(zhǔn)確度持續(xù)偏高(表5)，說明共存Fe3+的濃度越大對(duì)Fe2+的測(cè)定影響越大，雖然葡萄酒中的鐵主要以Fe2+存在。

因此，F(xiàn)e3+的存在會(huì)影響對(duì)葡萄酒中Fe2+的定量測(cè)定，影響程度與菲洛嗪用量和Fe3+濃度有關(guān)，這與ANASTCIO等[17]的研究結(jié)果一致。然而，在葡萄酒條件下，相比于Fe3+濃度的影響，菲洛嗪用量的影響更大。尤其是加入的菲洛嗪過量時(shí)，會(huì)過高估計(jì)葡萄酒中Fe2+的實(shí)際濃度(圖4b)。這可能是因?yàn)榉坡遴杭尤牒髸?huì)優(yōu)先與酒中的Fe2+絡(luò)合，F(xiàn)e3+/Fe2+氧化還原電勢(shì)升高[28]，F(xiàn)e3+成為較強(qiáng)的氧化劑，在氧化多酚等物質(zhì)的同時(shí)被還原為Fe2+；而過量的菲洛嗪與還原的Fe2+絡(luò)合，吸光度增加[7,28]。

表5 Fe3+共存時(shí)菲洛嗪法測(cè)定的Fe2+質(zhì)量濃度Tab.5 Concentration of Fe2+ determined by ferrozine assay in model wine containing Fe3+

2.4 樣品測(cè)定

利用改良菲洛嗪法測(cè)定成品葡萄酒中的總鐵和Fe2+含量。結(jié)果顯示，紅葡萄酒中的總鐵質(zhì)量濃度(平均值3.89 mg/L)明顯高于白葡萄酒中的總鐵質(zhì)量濃度(平均值1.80 mg/L)(圖5a)，這可能與測(cè)試的葡萄酒樣品有關(guān)，對(duì)此結(jié)果仍需擴(kuò)大酒樣數(shù)量進(jìn)行深入研究；葡萄酒中的鐵以Fe2+為主(圖5b)，紅葡萄酒中的Fe2+百分比(平均值82.15%)高于白葡萄酒中的Fe2+百分比(平均值77.00%)(圖5b)，這與DANILEWICZ[7]的研究結(jié)果一致。這可能與紅葡萄酒中含有較豐富的酚類物質(zhì)有關(guān)。

圖5 改良菲洛嗪法測(cè)定的葡萄酒中總鐵、Fe2+和Fe3+Fig.5 Determination of total iron, Fe2+ and Fe3+ in wines by the modified ferrozine assay

3 結(jié)論

(1)新建立的改良菲洛嗪法，能夠直接、快速測(cè)定葡萄酒中的總鐵和Fe2+含量，避免了繁雜的樣品前處理過程及其對(duì)Fe2+測(cè)定結(jié)果準(zhǔn)確性的干擾，方法簡(jiǎn)單易行、準(zhǔn)確度和精密度高，適于在葡萄酒生產(chǎn)中推廣應(yīng)用。

(2)葡萄酒中共存的Fe3+能夠影響對(duì)Fe2+的準(zhǔn)確測(cè)定，其影響程度主要取決于顯色劑菲洛嗪的用量和Fe3+的濃度，而過量添加菲洛嗪會(huì)導(dǎo)致Fe2+測(cè)定結(jié)果的偏高，適合的顯色劑用量是菲洛嗪與總鐵摩爾比為7。

(3)葡萄酒中的鐵主要以Fe2+形態(tài)存在，而與白葡萄酒相比，紅葡萄酒中含有的Fe2+百分比較高。

1 DANILEWICZ J C.Review of reaction mechanisms of oxygen and proposed intermediate reduction products in wine: central role of iron and copper[J].American Journal of Enology and Viticulture, 2003, 54(2): 73-85.

2 LI H, GUO A, WANG H.Mechanisms of oxidative browning of wine[J].Food Chemistry, 2008, 108(1): 1-13.

3 OLIVEIRA C M, FERREIRA A C S, DE FREITAS V, et al.Oxidation mechanisms occurring in wines[J].Food Research International, 2011, 44(5): 1115-1126.

5 KREITMAN G Y, CANTU A, WATERHOUSE A L, et al.Effect of metal chelators on the oxidative stability of model wine[J].Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2013, 61(39): 9480-9487.

6 KREITMAN G Y, DANILEWICZ J C, JEFFERY D W, et al.Reaction mechanisms of metals with hydrogen sulfide and thiols in model wine.Part 2: iron-and copper-catalyzed oxidation[J].Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2016, 64(20): 4105-4113.

7 DANILEWICZ J C.Fe(II):Fe(III) ratio and redox status of white wines[J].American Journal of Enology and Viticulture, 2016,67(2): 146-152.

8 GUO A, KONTOUDAKIS N, SCOLLARY G R, et al.Production and isomeric distribution of xanthylium cation pigments and their precursors in wine-like conditions: impact of Cu(II), Fe(II), Fe(III), Mn(II), Zn(II), and Al(III)[J].Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2017,65(11): 2414-2425.

9 李湘利, 劉靜.葡萄酒鐵破敗的發(fā)病機(jī)理及綜合性防治技術(shù)[J].釀酒, 2007, 34(6): 73-74.

LI Xiangli, LIU Jing.Mechanism of casse and integrated prevention and control on wine ferric casse[J].Liquor Making, 2007, 34(6): 73-74.(in Chinese)

10 POHL P, PRUSISZ B.Application of tandem column solid phase extraction and flame atomic absorption spectrometry for the determination of inorganic and organically bound forms of iron in wine[J].Talanta, 2009, 77(5): 1732-1738.

11 ROUSSEVA M, KONTOUDAKIS N, SCHMIDTKE L M, et al.Impact of wine production on the fractionation of copper and iron in Chardonnay wine: implications for oxygen consumption[J].Food Chemistry, 2016, 203: 440-447.

14 劉球英, 駱艷娥.改進(jìn)Ferrozine法測(cè)定溶液中的二價(jià)鐵, 三價(jià)鐵及總鐵[J].科學(xué)技術(shù)與工程, 2016, 16(10): 85-88.

LIU Qiuying, LUO Yan’e.Determination of Fe2+, Fe3+and total iron ion with improved ferrozine UV-spectrophotometry[J].Science Technology and Engineering, 2016, 16(10): 85-88.(in Chinese)

15 IM J, LEE J, L?FFLER F E.Interference of ferric ions with ferrous iron quantification using the ferrozine assay[J].Journal of Microbiological Methods, 2013, 95(3): 366-367.

16 孫靜嫻, 丁煜, 李清曼.與Fe(III)共存的Fe (II)分光光度法測(cè)定[J].土壤, 2011, 43(4): 662-668.

SUN Jingxian, DING Yu, LI Qingman.Accurate spectrometric determination of Fe(II) co-existing with Fe(III) in soils using 2,2′-Dipyridine or Ferrozine[J].Soils, 2011, 43(4): 662-668.(in Chinese)

18 VIOLLIER E, INGLETT P W, HUNTER K, et al.The ferrozine method revisited: Fe(II)/Fe(III) determination in natural waters[J].Applied Geochemistry, 2000, 15(6): 785-790.

19 CARPENTER C E, WARD R E.Iron determination by ferrozine method[M]∥Food Analysis Laboratory Manual.Springer International Publishing, 2017: 157-159.

20 STOOKEY L L.Ferrozine—a new spectrophotometric reagent for iron[J].Analytical Chemistry, 1970, 42(7): 779-781.

21 KONTOUDAKIS N, GUO A, SCOLLARY G R, et al.The impact of aging wine in high and low oxygen conditions on the fractionation of Cu and Fe in Chardonnay wine[J].Food Chemistry, 2017, 229: 319-328.

22 JANSEN B, NIEROP K G J, VERSTRATEN J M.Influence of pH and metal/carbon ratios on soluble organic complexation of Fe (II), Fe(III) and Al(III) in soil solutions determined by diffusive gradients in thin films[J].Analytica Chimica Acta, 2002, 454(2): 259-270.

23 KNOCKAERT D, RAES K, STRUIJS K, et al.Influence of microbial conversion and change in pH on iron-gallic acid complexation during lactobacillus fermentation[J].LWT—Food Science and Technology, 2014, 55(1): 335-340.

24 GRYGO-SZYMANKO E, TOBIASZ A, WALAS S.Speciation analysis and fractionation of manganese: a review[J].TrAC Trends in Analytical Chemistry, 2016, 80: 112-124.

25 王艷潔, 那廣水, 王震, 等.檢出限的涵義和計(jì)算方法[J].化學(xué)分析計(jì)量, 2012, 21(5): 85-88.

WANG Yanjie, NA Guangshui, WANG Zhen, et al.Connotation and calculation methods of detection limit[J].Chemical Analysis and Meterage, 2012, 21(5): 85-88.(in Chinese)

26 尚爾坤, 田然, 馬麗媛, 等.4 種分光光度法測(cè)定鐵含量的對(duì)比分析[J].食品工業(yè), 2013,34(10): 223-225.

SHANG Erkun, TIAN Ran, MA Liyuan, et al.Comparative analysis of the four spectrophotometric determination of iron content[J].The Food Industry, 2013,34(10): 223-225.(in Chinese)

27 李媛, 陳奇洲.菲咯嗪分光光度法測(cè)定水中的總鐵[J].解放軍預(yù)防醫(yī)學(xué)雜志, 2003, 21(1): 30-32.

LI Yuan, CHEN Qizhou.Determination of total iron content in water by the ferrozine spectrophotometric method[J].Journal of Preventive Medicine of Chinese People’s Liberation Army, 2003, 21(1): 30-32.(in Chinese)

28 DANILEWICZ J C.Reactions involving iron in mediating catechol oxidation in model wine[J].American Journal of Enology and Viticulture, 2013, 64(3): 316-324.

RapidDeterminationofTotalIronandFerrousIoninWinebyModifiedFerrozineAssay

GUO Anque ZHANG Xingxing ZHANG Yulin DONG Xin CHEN Liwei

(CollegeofEnology,NorthwestA&FUniversity,Yangling,Shaanxi712100,China)

More and more recent literatures have shown that iron and copper, especially iron plays critical roles in the initiation and propagation of wine oxidation, which seems to depend not only on the total concentration of iron, but also more on the speciation of iron in wine.A rapid method for directly accurate determination of total iron and ferrous ion (Fe2+) in wine was developed by optimizing the ferrozine-based assay for total iron detection, and the effects of ferric ion (Fe3+) and ferrozine levels on the quantification of Fe2+under wine conditions were also investigated.The results showed that the modified ferrozine assay was established for the direct determination of total iron in wine, the standard curve exhibited a good linear relationship between absorbance and iron concentration from 0.25 mg/L to 2.00 mg/L (R2=0.997 9) and the method detection limit was 0.011 5 mg/L, with the recovery rate of 94.31%～104.34%.Moreover, the total iron concentration determined by the modified ferrozine assay was in good accordance with that measured by the atomic absorption spectroscopy (AAS) in different wine samples.However, the presence of Fe3+seriously interfered with the accurate measurement of Fe2+in wine, and the optimized molar ratio of ferrozine to total iron was 7, with fitting accuracy ranging from 101.98% to 113.50% for Fe2+determination.The assay was applied to some commercial bottled wines, and it was confirmed that Fe2+was the dominant iron in wine, although the percentage of Fe2+in red wines was much higher than that in white ones.In brief, the modified ferrozine assay was simple, accurate and reliable to determine total iron and Fe2+in wine rapidly, and it can be widely used in the wine industry in future.

wine; ferrozine assay; total iron; ferrous ion; rapid determination

10.6041/j.issn.1000-1298.2017.10.043

TS262.6

A

1000-1298(2017)10-0338-07

2017-07-11

2017-08-05

中央高校基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)資金項(xiàng)目(Z109021702)和“十二五”國(guó)家科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目(2012BAD31B00)

郭安鵲(1976—)，男，講師，博士，主要從事葡萄酒氧化機(jī)制研究，E-mail：guoanque@nwsuaf.edu.cn