劉云++王琳+賈保軍

微生物絮凝劑是利用微生物技術(shù)，通過(guò)生物發(fā)酵、抽提、精制而得到的一種具有生物分解性和較高安全性的新型、高效、無(wú)毒的廉價(jià)水處理劑，目前國(guó)內(nèi)外研究者已經(jīng)篩選到了許多能夠產(chǎn)生絮凝劑的微生物。產(chǎn)生絮凝劑菌分布廣泛，在土壤與污水中分布較多，且種類(lèi)繁多。目前對(duì)微生物絮凝劑的研究還多局限于實(shí)驗(yàn)室水平的菌種篩選及特性研究。 獲得高活性微生物絮凝劑產(chǎn)生菌， 研究其培養(yǎng)條件， 降低生產(chǎn)成本是后續(xù)研究和開(kāi)發(fā)應(yīng)用的基礎(chǔ)。

本文通過(guò)對(duì)污水處理廠活性污泥的分離篩選，得到4株具有較高絮凝活性的菌株，并分析其最優(yōu)的培養(yǎng)條件，為高活性微生物絮凝劑的產(chǎn)生及其實(shí)際應(yīng)用提供了基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

材料與方法

菌種的來(lái)源。本研究以某污水處理廠的活性污泥為對(duì)象，篩選得到4株具有絮凝活性的微生物絮凝劑產(chǎn)生菌，并對(duì)其最佳培養(yǎng)條件進(jìn)行優(yōu)化實(shí)驗(yàn)。

菌種的分離與篩選。（1）篩選培養(yǎng)基（GC液體培養(yǎng)基）：葡萄糖20g，酵母浸膏0.5g，脲0.5g，K2HP04 5g，KH2P04 2g，NaCl 0.1g， （NH4）2S04 0.2g，水l000mL，pH =8.0，121℃滅菌20min；（2）分離與篩選 采用倒平板法和分離劃線(xiàn)法進(jìn)行菌種的分離。對(duì)培養(yǎng)2-3d的培養(yǎng)皿進(jìn)行觀察，根據(jù)形態(tài)和顏色的差異，分離得到較純的微生物菌株。將分離得到的菌株接種到篩選培養(yǎng)基中，于32±0.5℃，150r/min培養(yǎng)72h，對(duì)發(fā)酵液進(jìn)行初步絮凝活性的檢測(cè)，得到絮凝活性較高的菌株。

絮凝活性的測(cè)定。在50mL具塞比色試管中加入2mLl%CaCl2溶液，0.2g高嶺土，定容，調(diào)節(jié)pH值為9，再加入3mL培養(yǎng)液搖勻，靜置10min，吸取上清夜于比色皿中，于紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)在660nm處測(cè)定上清夜的吸光度（OD660），以不加發(fā)酵液的培養(yǎng)基為對(duì)照。通過(guò)計(jì)算確定其絮凝活性。

絮凝率（%）=（A-B）/A×100%

式中：A——對(duì)照在660nm處的吸光度

B—樣品在660nm處的吸光度

培養(yǎng)條件的優(yōu)化。對(duì)篩選出來(lái)的四株菌株， 分別改變培養(yǎng)條件， 如培養(yǎng)基的成分及初始pH值、培養(yǎng)溫度、搖床轉(zhuǎn)速等因素，測(cè)定培養(yǎng)液的絮凝活性， 以確定微生物產(chǎn)絮凝劑的最優(yōu)培養(yǎng)條件。

結(jié)果與分析

分離篩選結(jié)果。通過(guò)菌種的分離，并將純化后的菌株經(jīng)初篩和復(fù)篩后共獲得4株具有較強(qiáng)絮凝活性的菌株，初步確定并將其編號(hào)為1#細(xì)菌，2#放線(xiàn)菌，3#霉菌，4#酵母菌。

影響微生物生長(zhǎng)及其絮凝活性的條件分析。（1）碳源濃度對(duì)菌株的影響。碳源能夠供給微生物生長(zhǎng)、繁殖和活動(dòng)的能量，并且是微生物細(xì)胞合成的主要物質(zhì)構(gòu)成。本實(shí)驗(yàn)選擇葡萄糖作為微生物培養(yǎng)的碳源，將篩選出的四株菌株轉(zhuǎn)到優(yōu)化培養(yǎng)基中，通過(guò)改變葡萄糖的濃度，控制在150r/min ，32℃條件下培養(yǎng)72h，測(cè)定4株菌株的絮凝率，分析培養(yǎng)基中最佳的碳源濃度。其濃度不同對(duì)產(chǎn)絮凝劑的影響如表1所示。

由圖1可以看出，在以葡萄糖為主要碳源，經(jīng)相同培養(yǎng)條件，測(cè)定1#細(xì)菌、2#放線(xiàn)菌、3#霉菌及4#酵母菌的絮凝率最高分別為81.27%、85.62%、82.17%和87.55% ，而且葡萄糖濃度對(duì)絮凝活性的有較大的影響，碳源濃度過(guò)低，則不能為微生物提供足夠的生長(zhǎng)能量，但是濃度過(guò)高不僅對(duì)絮凝率沒(méi)有很大的提高，反而會(huì)由于碳氮比過(guò)高而造成營(yíng)養(yǎng)比例失衡，影響微生物的生長(zhǎng)。通過(guò)實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析，本實(shí)驗(yàn)的1#細(xì)菌、2#放線(xiàn)菌、3#霉菌及4#酵母菌的碳源濃度分別為7g/L、10g/L、9g/L、15g/L。

（2）（NH4）2SO4的濃度對(duì)絮凝率的影響。在微生物培養(yǎng)的過(guò)程中，氮源是構(gòu)成微生物體的蛋白質(zhì)、核酸等化合物的重要原材料，對(duì)微生物的生長(zhǎng)發(fā)育有著重要作用。有研究表明，氮源中的酵母膏和（NH4）2SO4過(guò)量或者不足對(duì)微生物生長(zhǎng)及其絮凝劑的產(chǎn)生影響最大。因此控制最佳碳源濃度條件下，培養(yǎng)基中（NH4）2SO4的濃度對(duì)微生物的影響，結(jié)果如圖2所示。

由圖2可以看出，四株菌在不同的（NH4）2SO4濃度下，絮凝活性有較大幅度的變化，并且由圖可以看出1#細(xì)菌、2#放線(xiàn)菌、3#霉菌及4#酵母菌在（NH4）2SO4濃度分別為0.26 g/L、0.3 g/L、0.36 g/L、0.24 g/L條件下，絮凝率分別可達(dá)86.47%、82.76%、89.29%、73.57%，其中3#霉菌的絮凝率最高，可達(dá)89%以上。

（3）培養(yǎng)液的初始pH值的影響。pH值通過(guò)改變生物體的表面電荷，影響生物酶的活性和有機(jī)化合物的離子化程度，與微生物的代謝活動(dòng)有密切的影響。在最優(yōu)葡萄糖濃度、（NH4）2SO4濃度，控制不同pH值，于32℃、150r/min條件下培養(yǎng)72h，測(cè)定培養(yǎng)液的絮凝活性，分析pH值對(duì)微生物生長(zhǎng)的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖3。

由圖3可以看出，當(dāng)pH位置在6～8范圍內(nèi)時(shí)，1#細(xì)菌、2#放線(xiàn)菌和3#霉菌微生物的培養(yǎng)發(fā)酵液有較高絮凝活性，當(dāng)pH大于8時(shí)，絮凝活性迅速下降。而4#酵母菌最佳pH值在7左右，絮凝率隨pH的變化不明顯，因此具有有較好的酸堿穩(wěn)定度。

（4）搖床轉(zhuǎn)速的影響。在最優(yōu)葡萄糖濃度、（NH4）2SO4濃度以及最佳pH值條件下，控制不同轉(zhuǎn)速于32℃進(jìn)行振蕩培養(yǎng)72h，并測(cè)定相應(yīng)培養(yǎng)液的絮凝活性，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖4所示。

搖床轉(zhuǎn)速的大小直接影響微生物生長(zhǎng)所需的通氧量。轉(zhuǎn)速過(guò)低，不能為菌體的生長(zhǎng)提供足夠的氧氣而影響其生長(zhǎng)。而轉(zhuǎn)速過(guò)高，導(dǎo)致通氣量大，微生物的生長(zhǎng)繁殖過(guò)快，及早進(jìn)入衰亡階段，絮凝劑的產(chǎn)量降低。因此在實(shí)際應(yīng)用中要充分考慮合適的通氧量，保證菌體的生長(zhǎng)和絮凝劑的合成。 由圖4實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，搖床轉(zhuǎn)速控制在160r/min時(shí)，4株菌株都具有交到的絮凝率，最高可達(dá)90%以上。

（5）培養(yǎng)溫度對(duì)絮凝劑產(chǎn)生菌的影響。微生物的培養(yǎng)溫度是微生物生長(zhǎng)和存活的重要因素之一。微生物絮凝劑的主要成分為蛋白質(zhì)、核酸、糖類(lèi)等，其中蛋白質(zhì)、核酸等對(duì)溫度具有較高的敏感性，過(guò)高或過(guò)低的溫度會(huì)對(duì)機(jī)體產(chǎn)生嚴(yán)重影響，因此，需要分析不同的微生物對(duì)溫度的適應(yīng)范圍，通過(guò)控制最佳的葡萄糖濃度、（NH4）2SO4濃度、pH值以及最佳的轉(zhuǎn)速，設(shè)定不同的培養(yǎng)溫度，振蕩培養(yǎng)72h，測(cè)定培養(yǎng)液對(duì)高嶺土懸液的絮凝活性，結(jié)果見(jiàn)圖5。

由圖5可知，培養(yǎng)溫度34℃時(shí)4#酵母菌的絮凝率為92.21%，1#細(xì)菌和2#放線(xiàn)菌在30℃時(shí)，其絮凝率最高，達(dá)到87.58%和82.58%， 3#霉菌在32℃的絮凝率達(dá)83.45%，遠(yuǎn)高于其它溫度時(shí)的絮凝率，因此本實(shí)驗(yàn)所用的4株菌株的最佳培養(yǎng)溫度應(yīng)控制在30℃～34℃范圍內(nèi)。

本文通過(guò)菌種的篩分得到4株具有較高絮凝活性的菌株，確定為1#細(xì)菌、2#放線(xiàn)菌、3#霉菌、4#酵母菌。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，1#細(xì)菌、2#放線(xiàn)菌、3#霉菌、4#酵母菌的最佳培養(yǎng)條件分別為：葡萄糖濃度為7g/L， 10 g/L， 15 g/L， 9 g/L，（NH4）2SO4的濃度分別為0.26 g/L、0.3 g/L、0.36 g/L、0.24 g/L，培養(yǎng)液的初始pH值為8、7、7、7.5，最佳搖床轉(zhuǎn)速控制在160r/min，最佳培養(yǎng)溫度為30℃、30℃、34℃、32℃。并且在其各自最佳培養(yǎng)條件下，其絮凝活性最高可達(dá)85%～90%以上。

基金項(xiàng)目：河南省教育廳自然科學(xué)基金項(xiàng)目（2011A610008），河南理工大學(xué)博士基金項(xiàng)目（648206）。

作者簡(jiǎn)介：

賈保軍（1974-），男，河南新鄉(xiāng)人，博士，副教授，研究方向：水污染控制。endprint