劉云++王琳+賈保軍
微生物絮凝劑是利用微生物技術(shù),通過(guò)生物發(fā)酵、抽提、精制而得到的一種具有生物分解性和較高安全性的新型、高效、無(wú)毒的廉價(jià)水處理劑,目前國(guó)內(nèi)外研究者已經(jīng)篩選到了許多能夠產(chǎn)生絮凝劑的微生物。產(chǎn)生絮凝劑菌分布廣泛,在土壤與污水中分布較多,且種類(lèi)繁多。目前對(duì)微生物絮凝劑的研究還多局限于實(shí)驗(yàn)室水平的菌種篩選及特性研究。 獲得高活性微生物絮凝劑產(chǎn)生菌, 研究其培養(yǎng)條件, 降低生產(chǎn)成本是后續(xù)研究和開(kāi)發(fā)應(yīng)用的基礎(chǔ)。
本文通過(guò)對(duì)污水處理廠活性污泥的分離篩選,得到4株具有較高絮凝活性的菌株,并分析其最優(yōu)的培養(yǎng)條件,為高活性微生物絮凝劑的產(chǎn)生及其實(shí)際應(yīng)用提供了基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。
材料與方法
菌種的來(lái)源。本研究以某污水處理廠的活性污泥為對(duì)象,篩選得到4株具有絮凝活性的微生物絮凝劑產(chǎn)生菌,并對(duì)其最佳培養(yǎng)條件進(jìn)行優(yōu)化實(shí)驗(yàn)。
菌種的分離與篩選。(1)篩選培養(yǎng)基(GC液體培養(yǎng)基):葡萄糖20g,酵母浸膏0.5g,脲0.5g,K2HP04 5g,KH2P04 2g,NaCl 0.1g, (NH4)2S04 0.2g,水l000mL,pH =8.0,121℃滅菌20min;(2)分離與篩選 采用倒平板法和分離劃線(xiàn)法進(jìn)行菌種的分離。對(duì)培養(yǎng)2-3d的培養(yǎng)皿進(jìn)行觀察,根據(jù)形態(tài)和顏色的差異,分離得到較純的微生物菌株。將分離得到的菌株接種到篩選培養(yǎng)基中,于32±0.5℃,150r/min培養(yǎng)72h,對(duì)發(fā)酵液進(jìn)行初步絮凝活性的檢測(cè),得到絮凝活性較高的菌株。
絮凝活性的測(cè)定。在50mL具塞比色試管中加入2mLl%CaCl2溶液,0.2g高嶺土,定容,調(diào)節(jié)pH值為9,再加入3mL培養(yǎng)液搖勻,靜置10min,吸取上清夜于比色皿中,于紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)在660nm處測(cè)定上清夜的吸光度(OD660),以不加發(fā)酵液的培養(yǎng)基為對(duì)照。通過(guò)計(jì)算確定其絮凝活性。
絮凝率(%)=(A-B)/A×100%
式中:A——對(duì)照在660nm處的吸光度
B—樣品在660nm處的吸光度
培養(yǎng)條件的優(yōu)化。對(duì)篩選出來(lái)的四株菌株, 分別改變培養(yǎng)條件, 如培養(yǎng)基的成分及初始pH值、培養(yǎng)溫度、搖床轉(zhuǎn)速等因素,測(cè)定培養(yǎng)液的絮凝活性, 以確定微生物產(chǎn)絮凝劑的最優(yōu)培養(yǎng)條件。
結(jié)果與分析
分離篩選結(jié)果。通過(guò)菌種的分離,并將純化后的菌株經(jīng)初篩和復(fù)篩后共獲得4株具有較強(qiáng)絮凝活性的菌株,初步確定并將其編號(hào)為1#細(xì)菌,2#放線(xiàn)菌,3#霉菌,4#酵母菌。
影響微生物生長(zhǎng)及其絮凝活性的條件分析。(1)碳源濃度對(duì)菌株的影響。碳源能夠供給微生物生長(zhǎng)、繁殖和活動(dòng)的能量,并且是微生物細(xì)胞合成的主要物質(zhì)構(gòu)成。本實(shí)驗(yàn)選擇葡萄糖作為微生物培養(yǎng)的碳源,將篩選出的四株菌株轉(zhuǎn)到優(yōu)化培養(yǎng)基中,通過(guò)改變葡萄糖的濃度,控制在150r/min ,32℃條件下培養(yǎng)72h,測(cè)定4株菌株的絮凝率,分析培養(yǎng)基中最佳的碳源濃度。其濃度不同對(duì)產(chǎn)絮凝劑的影響如表1所示。
由圖1可以看出,在以葡萄糖為主要碳源,經(jīng)相同培養(yǎng)條件,測(cè)定1#細(xì)菌、2#放線(xiàn)菌、3#霉菌及4#酵母菌的絮凝率最高分別為81.27%、85.62%、82.17%和87.55% ,而且葡萄糖濃度對(duì)絮凝活性的有較大的影響,碳源濃度過(guò)低,則不能為微生物提供足夠的生長(zhǎng)能量,但是濃度過(guò)高不僅對(duì)絮凝率沒(méi)有很大的提高,反而會(huì)由于碳氮比過(guò)高而造成營(yíng)養(yǎng)比例失衡,影響微生物的生長(zhǎng)。通過(guò)實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析,本實(shí)驗(yàn)的1#細(xì)菌、2#放線(xiàn)菌、3#霉菌及4#酵母菌的碳源濃度分別為7g/L、10g/L、9g/L、15g/L。
(2)(NH4)2SO4的濃度對(duì)絮凝率的影響。在微生物培養(yǎng)的過(guò)程中,氮源是構(gòu)成微生物體的蛋白質(zhì)、核酸等化合物的重要原材料,對(duì)微生物的生長(zhǎng)發(fā)育有著重要作用。有研究表明,氮源中的酵母膏和(NH4)2SO4過(guò)量或者不足對(duì)微生物生長(zhǎng)及其絮凝劑的產(chǎn)生影響最大。因此控制最佳碳源濃度條件下,培養(yǎng)基中(NH4)2SO4的濃度對(duì)微生物的影響,結(jié)果如圖2所示。
由圖2可以看出,四株菌在不同的(NH4)2SO4濃度下,絮凝活性有較大幅度的變化,并且由圖可以看出1#細(xì)菌、2#放線(xiàn)菌、3#霉菌及4#酵母菌在(NH4)2SO4濃度分別為0.26 g/L、0.3 g/L、0.36 g/L、0.24 g/L條件下,絮凝率分別可達(dá)86.47%、82.76%、89.29%、73.57%,其中3#霉菌的絮凝率最高,可達(dá)89%以上。
(3)培養(yǎng)液的初始pH值的影響。pH值通過(guò)改變生物體的表面電荷,影響生物酶的活性和有機(jī)化合物的離子化程度,與微生物的代謝活動(dòng)有密切的影響。在最優(yōu)葡萄糖濃度、(NH4)2SO4濃度,控制不同pH值,于32℃、150r/min條件下培養(yǎng)72h,測(cè)定培養(yǎng)液的絮凝活性,分析pH值對(duì)微生物生長(zhǎng)的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖3。
由圖3可以看出,當(dāng)pH位置在6~8范圍內(nèi)時(shí),1#細(xì)菌、2#放線(xiàn)菌和3#霉菌微生物的培養(yǎng)發(fā)酵液有較高絮凝活性,當(dāng)pH大于8時(shí),絮凝活性迅速下降。而4#酵母菌最佳pH值在7左右,絮凝率隨pH的變化不明顯,因此具有有較好的酸堿穩(wěn)定度。
(4)搖床轉(zhuǎn)速的影響。在最優(yōu)葡萄糖濃度、(NH4)2SO4濃度以及最佳pH值條件下,控制不同轉(zhuǎn)速于32℃進(jìn)行振蕩培養(yǎng)72h,并測(cè)定相應(yīng)培養(yǎng)液的絮凝活性,實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖4所示。
搖床轉(zhuǎn)速的大小直接影響微生物生長(zhǎng)所需的通氧量。轉(zhuǎn)速過(guò)低,不能為菌體的生長(zhǎng)提供足夠的氧氣而影響其生長(zhǎng)。而轉(zhuǎn)速過(guò)高,導(dǎo)致通氣量大,微生物的生長(zhǎng)繁殖過(guò)快,及早進(jìn)入衰亡階段,絮凝劑的產(chǎn)量降低。因此在實(shí)際應(yīng)用中要充分考慮合適的通氧量,保證菌體的生長(zhǎng)和絮凝劑的合成。 由圖4實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知,搖床轉(zhuǎn)速控制在160r/min時(shí),4株菌株都具有交到的絮凝率,最高可達(dá)90%以上。
(5)培養(yǎng)溫度對(duì)絮凝劑產(chǎn)生菌的影響。微生物的培養(yǎng)溫度是微生物生長(zhǎng)和存活的重要因素之一。微生物絮凝劑的主要成分為蛋白質(zhì)、核酸、糖類(lèi)等,其中蛋白質(zhì)、核酸等對(duì)溫度具有較高的敏感性,過(guò)高或過(guò)低的溫度會(huì)對(duì)機(jī)體產(chǎn)生嚴(yán)重影響,因此,需要分析不同的微生物對(duì)溫度的適應(yīng)范圍,通過(guò)控制最佳的葡萄糖濃度、(NH4)2SO4濃度、pH值以及最佳的轉(zhuǎn)速,設(shè)定不同的培養(yǎng)溫度,振蕩培養(yǎng)72h,測(cè)定培養(yǎng)液對(duì)高嶺土懸液的絮凝活性,結(jié)果見(jiàn)圖5。
由圖5可知,培養(yǎng)溫度34℃時(shí)4#酵母菌的絮凝率為92.21%,1#細(xì)菌和2#放線(xiàn)菌在30℃時(shí),其絮凝率最高,達(dá)到87.58%和82.58%, 3#霉菌在32℃的絮凝率達(dá)83.45%,遠(yuǎn)高于其它溫度時(shí)的絮凝率,因此本實(shí)驗(yàn)所用的4株菌株的最佳培養(yǎng)溫度應(yīng)控制在30℃~34℃范圍內(nèi)。
本文通過(guò)菌種的篩分得到4株具有較高絮凝活性的菌株,確定為1#細(xì)菌、2#放線(xiàn)菌、3#霉菌、4#酵母菌。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,1#細(xì)菌、2#放線(xiàn)菌、3#霉菌、4#酵母菌的最佳培養(yǎng)條件分別為:葡萄糖濃度為7g/L, 10 g/L, 15 g/L, 9 g/L,(NH4)2SO4的濃度分別為0.26 g/L、0.3 g/L、0.36 g/L、0.24 g/L,培養(yǎng)液的初始pH值為8、7、7、7.5,最佳搖床轉(zhuǎn)速控制在160r/min,最佳培養(yǎng)溫度為30℃、30℃、34℃、32℃。并且在其各自最佳培養(yǎng)條件下,其絮凝活性最高可達(dá)85%~90%以上。
基金項(xiàng)目:河南省教育廳自然科學(xué)基金項(xiàng)目(2011A610008),河南理工大學(xué)博士基金項(xiàng)目(648206)。
作者簡(jiǎn)介:
賈保軍(1974-),男,河南新鄉(xiāng)人,博士,副教授,研究方向:水污染控制。endprint