嚴(yán) 翠，孫玉英，*，劉丹丹，柳 婷，劉斌彬，王淑軍

（1.淮海工學(xué)院 海洋學(xué)院，江蘇 連云港 222005；2.江蘇省海洋資源開發(fā)研究院，江蘇 連云港 222005）

產(chǎn)纖溶酶菌株L21的鑒定與發(fā)酵條件研究

嚴(yán) 翠1，孫玉英1，2*，劉丹丹1，柳 婷1，劉斌彬1，王淑軍2

（1.淮海工學(xué)院 海洋學(xué)院，江蘇 連云港 222005；2.江蘇省海洋資源開發(fā)研究院，江蘇 連云港 222005）

利用纖維蛋白平板法從海參體內(nèi)腸道中篩選到一株產(chǎn)纖溶酶活力較高的菌株L21，通過16S rDNA序列測(cè)定比對(duì)分析，初步鑒定菌株L21為交替假單胞菌（Pseudoalteromonassp.）。采用單因素試驗(yàn)、Plackett-Burman試驗(yàn)及響應(yīng)面法對(duì)菌株L21的發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化，結(jié)果表明，菌株L21最佳發(fā)酵工藝條件為NaCl 1 g/L，CaCl21.03 g/L，MgSO40.8 g/L，初始pH 7.40。在此工藝條件下，菌株L21纖溶酶活力達(dá)到399.86 U/mL，較優(yōu)化前（86.09 U/mL）提高了4.64倍。體外溶血實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明該菌株具有作為安全性溶栓劑的潛力。

交替假單胞菌；纖溶酶；Plackett-Burman試驗(yàn)；響應(yīng)面法

血栓性疾病是嚴(yán)重威脅人類健康的心腦血管疾病，治療血栓性疾病最為有效、安全的手段主要是采用纖溶酶或纖溶酶原激活劑進(jìn)行的溶栓療法[1]。通過溶解過剩的纖維蛋白，使血栓溶解，從而達(dá)到血液循環(huán)通暢的目的[2]。微生物在自然界中種類多、易培養(yǎng)、繁殖快，而且發(fā)酵工業(yè)相對(duì)完善發(fā)達(dá)，可短期內(nèi)得到大量目的產(chǎn)物[3]，及其纖溶酶在口服給藥的血栓疾病中有一定的優(yōu)勢(shì)。因此，微生物纖溶酶的研究在近幾十年中已經(jīng)引起了廣大醫(yī)療工作者的興趣。但是長(zhǎng)期以來也受以下兩個(gè)問題的制約：其一，發(fā)酵法產(chǎn)酶活力較低，有待于進(jìn)一步提高；其二，多數(shù)已報(bào)道的微生物纖溶酶最佳條件和人類生理?xiàng)l件不一致，存在安全性問題，從而使得進(jìn)一步研究受到限制。如對(duì)芽孢桿菌HQS-3粗酶液的體外溶血實(shí)驗(yàn)[4]的研究可知，將其開發(fā)為溶栓藥物的風(fēng)險(xiǎn)會(huì)增加；從Alteromonas piscicida中提取的纖溶酶在人體血漿中孵育后[5]，酶活力完全受到了抑制，使其應(yīng)用范圍受到限制。

有研究認(rèn)為，海水的化學(xué)性質(zhì)接近人的血漿，可以提供新的代謝產(chǎn)物，特別是酶，具有較低或沒有毒副作用，可以用于治療血栓[6]。海洋微生物經(jīng)過漫長(zhǎng)的環(huán)境適應(yīng)，其作為產(chǎn)酶資源具有突出的特點(diǎn)和優(yōu)勢(shì)。目前，海洋微生物中只有少數(shù)幾種纖溶酶已經(jīng)被鑒定及純化，包括Alteromonas piscicida[5]、Bacillus subtilis[7-8]、Bacillus amyloliquefaciens[9]等。因此，海洋資源具有很大的開發(fā)潛力。

本實(shí)驗(yàn)室從海參腸道中分離出一株纖溶酶活性較高的海洋菌株L21，其粗酶在體外不引起溶血反應(yīng)，是一株很有潛力被開發(fā)為安全、有效的溶栓藥物的細(xì)菌。本研究采用單因素試驗(yàn)對(duì)菌株L21產(chǎn)纖溶酶所需的碳源、氮源進(jìn)行篩選，采用Plackett-Burman法挑選對(duì)產(chǎn)酶影響較大的因素，然后以纖溶酶酶活為響應(yīng)值，采用響應(yīng)面分析法對(duì)該菌株產(chǎn)纖溶酶的發(fā)酵條件進(jìn)一步優(yōu)化，以期提高該菌株的產(chǎn)酶能力。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株

菌種L21：本實(shí)驗(yàn)室從海參腸道中篩選得到的產(chǎn)纖溶酶活性較高的海洋菌株。

1.1.2 主要試劑

羧甲基纖維素鈉、酪蛋白、NaCl、CaCl2、FeCl3、MgSO4（均為化學(xué)純）、酪氨酸、瓊脂糖、瓊脂粉（均為生化試劑）：國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；蛋白胨、酵母提取物（均為生化試劑）：英國(guó)OXOID公司。

1.1.3 培養(yǎng)基

Luria-Bertani（LB）固體培養(yǎng)基：酵母提取物5 g/L，蛋白胨10 g/L，NaCl 10 g/L，瓊脂粉20 g/L，pH 7.0。

血瓊脂平板：蛋白胨10 g/L，牛肉膏3 g/L，NaCl 5 g/L，瓊脂粉20 g/L，雞血50～100 mL。

種子培養(yǎng)基：酵母提取物5 g/L，蛋白胨10 g/L，NaCl 10 g/L，pH 7.0。

初始發(fā)酵培養(yǎng)基：羧甲基纖維素鈉5 g/L，酵母提取物5 g/L，酪蛋白2 g/L，NaCl 2 g/L，CaCl20.5 g/L，F(xiàn)eCl30.8 g/L，MgSO40.5 g/L，pH 7.0。

1.2 儀器與設(shè)備

SPX-250B-Z型生化培養(yǎng)箱：上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；CR22G高速冷凍離心機(jī)：日本日立公司；5418小型臺(tái)式高速離心機(jī)：德國(guó)艾本德股份公司；T6系列紫外可見分光光度計(jì)：北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；DK-8D型電熱恒溫水槽：上海一恒科技有限公司；T100梯度PCR儀：美國(guó)伯樂公司；ZWY-211C恒溫培養(yǎng)振蕩器：上海智城分析儀器制造有限公司；DYY-2C型電泳儀：北京市六一儀器廠。

1.3 方法

1.3.1 菌株L21的種子液制備及發(fā)酵

將菌株L21在LB固體培養(yǎng)基上活化后，從單菌落中挑取一環(huán)接種于裝液量為50 mL/250 mL種子培養(yǎng)基中，在30℃、160 r/min條件下?lián)u床培養(yǎng)24 h后作為種子液。將4%的菌株L21種子液接種于初始發(fā)酵培養(yǎng)基中，于30℃發(fā)酵培養(yǎng)60 h。

1.3.2 纖溶酶酶活力的測(cè)定

參照VIJAYARAGHAVAN P等[10]的方法有所改進(jìn)。將發(fā)酵液在4℃條件下6 000 r/min離心20 min，上清液即為粗酶液。于25 mL比色管中加2 mL 2.5%的纖維蛋白溶液，再加2 mL 0.1 mol/L的Tris-HCl（含有0.01 mol/L的CaCl2，pH 7.8），然后加1 mL粗酶液，37 ℃孵育30 min后，加入5 mL 0.11mol/L的三氯乙酸（含有0.22mol/L的乙酸鈉和0.33mol/L的乙酸）終止反應(yīng)，10000r/min離心20min，取上清液在波長(zhǎng)280 nm處測(cè)定吸光度值。并用酪氨酸標(biāo)準(zhǔn)品繪制酪氨酸與吸光度值的標(biāo)準(zhǔn)曲線，線性回歸方程為：y=0.0004x+0.0235（相關(guān)系數(shù)R2=0.993 4）。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)回歸方程計(jì)算樣品中酪氨酸的含量。酶活力單位定義：在37℃條件下，每分鐘水解纖維蛋白生成1 μg酪氨酸所需的酶量為一個(gè)酶活力單位（U/mL）。

1.3.3 菌株鑒定及系統(tǒng)進(jìn)化樹分析

16S rDNA序列擴(kuò)增與測(cè)序：從菌株L21的單菌落中挑取一環(huán)于0.1 mL無菌ddH2O中并吹吸混勻后煮沸5 min，以此為模板進(jìn)行聚合酶鏈反應(yīng)（polymerasechainreaction，PCR）擴(kuò)增。引物序列：27f（5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′）和1492r（5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′），由北京六合華大基因科技股份有限公司合成。PCR反應(yīng)體系為50μL，反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性5min，95℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸l min，共30個(gè)循環(huán)，然后72℃延伸10 min。用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR擴(kuò)增結(jié)果，并用試劑盒純化產(chǎn)物。PCR產(chǎn)物送北京六合華大基因科技股份有限公司測(cè)序，序列用BLAST程序與數(shù)據(jù)庫(kù)中核酸序列進(jìn)行同源性搜索，采用ClustalX 1.81進(jìn)行序列比對(duì)，通過MEGA 6.06軟件，采用鄰接法（Neighbor-Joining）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.3.4 單因素試驗(yàn)

通過單因素試驗(yàn)，以10 g/L的添加量從羧甲基纖維素鈉、殼聚糖、蔗糖、幾丁質(zhì)、麥芽糖、果糖、葡萄糖和淀粉中篩選出最優(yōu)碳源，以10 g/L的添加量從酪蛋白、牛肉膏、硝酸鈉、蛋白胨、尿素、硫酸銨、魚粉和豆粕粉中篩選出最優(yōu)氮源。

1.3.5 Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)[11]

本實(shí)驗(yàn)采用Plackett-Burman（PB）試驗(yàn)設(shè)計(jì)，對(duì)羧甲基纖維素鈉（X1）、酪蛋白（X2）、酵母粉（X3）、NaCl（X4）、CaCl2（X5）、FeCl3（X6）、MgSO4（X7）、接種量（X8）、溫度（X9）、裝液量（X10）、初始pH（X11）和發(fā)酵時(shí)間（X12）這12個(gè)因素進(jìn)行考察，從而選出對(duì)纖溶酶酶活力影響顯著的因子。

1.3.6 響應(yīng)面分析[12]

根據(jù)PB試驗(yàn)的結(jié)果，選取對(duì)酶活力具有顯著性影響的因素，以NaCl（A）、CaCl2（B）、MgSO4（C）和初始pH（D）為影響因素，纖溶酶活力（Y）為響應(yīng)值，進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)，試驗(yàn)因素與水平見表1。

表1 菌株L21發(fā)酵條件優(yōu)化響應(yīng)面試驗(yàn)因素與水平Table 1 Factors and levels of response surface experiments for fermentation conditions optimization of strain L21

1.3.7 體外溶血實(shí)驗(yàn)

參照HUANG S等[13]的方法有所修改。將50 μL粗酶液置于打孔的血瓊脂平板上，于37℃孵育3 d，觀察是否有透明圈。以枯草芽孢桿菌ATCC6633的粗酶液作為參考。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株鑒定及系統(tǒng)進(jìn)化樹分析

圖1 基于菌株L21 16S rDNA序列的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.1 Phylogenetic tree of strain L21 based on 16S rDNA sequence

經(jīng)PCR擴(kuò)增并對(duì)其產(chǎn)物進(jìn)行序列測(cè)定，得到一段長(zhǎng)度為1 498 bp的序列（GenBank accession：KM229514），對(duì)其進(jìn)行同源性序列比對(duì)，并下載與該菌株同源性較高的具有代表性的菌株序列，利用ClustalX1.81軟件進(jìn)行序列匹配比對(duì)，通過MEGA 6.06軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果見圖1。由圖1可知，菌株L21與交替假單胞菌聚成一群，菌株的序列相似性達(dá)到98%以上，綜合其顯微形態(tài)特征，可初步確定該菌株為交替假單胞菌（Pseudoalteromonassp.）的一個(gè)株系，把菌株命名為Pseudoalteromonassp.L21。

2.2 單因素試驗(yàn)

2.2.1 不同碳源對(duì)酶活力的影響

考察不同碳源對(duì)菌種L21纖溶酶酶活力的影響，結(jié)果見表2。

由表2可知，以羧甲基纖維素鈉作為碳源時(shí)，菌株L21產(chǎn)纖溶酶酶活力最高，為98.56 U/mL，殼聚糖和蔗糖次之，其余碳源產(chǎn)纖溶酶酶活力均低于初始發(fā)酵產(chǎn)酶活力（86.09 U/mL），因此，選羧甲基纖維素鈉為最優(yōu)碳源。

表2 不同碳源對(duì)纖溶酶酶活的影響Table 2 Effect of different carbon sources on the fibrinolytic enzyme activity

2.2.2 不同氮源對(duì)酶活力的影響

表3 不同氮源對(duì)纖溶酶酶活的影響Table 3 Effect of different nitrogen sources on the fibrinolytic enzyme activity

由表3可知，以酪蛋白為氮源時(shí)，產(chǎn)纖溶酶酶活力最高，且高于初始纖溶酶酶活力（86.09 U/mL），其余氮源產(chǎn)纖溶酶酶活力均低于初始發(fā)酵產(chǎn)酶活力，因此選酪蛋白為最優(yōu)氮源。

2.3 PB試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

利用Design-Expert 8.0.6.1軟件，選用N=19進(jìn)行PB試驗(yàn)設(shè)計(jì)，每個(gè)因素取高水平（+1）和低水平（-1）兩個(gè)水平。以纖溶酶酶活為響應(yīng)值，每組試驗(yàn)設(shè)置3個(gè)平行，試驗(yàn)因素和水平見表4，試驗(yàn)結(jié)果與分析見表5，主效應(yīng)分析結(jié)果見表6。

由表6中的P值可知，NaCl、CaCl2、MgSO4和初始pH對(duì)纖溶酶酶活影響最大，因此選擇NaCl、CaCl2、MgSO4和初始pH為自變量進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)。

表4 Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素與水平Table 4 Factors and levels of Plackett-Burman experiments design

表5 Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Table 5 Design and results of Plackett-Burman experiments

表6 Plackett-Burman試驗(yàn)各因素主效應(yīng)分析Table 6 Main effects analysis of each factor of Plackett-Burman experiments

2.4 響應(yīng)面分析試驗(yàn)結(jié)果

根據(jù)PB試驗(yàn)結(jié)果，利用中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)（central composite design，CCD）對(duì)這4個(gè)影響顯著的因素NaCl（A）、CaCl2（B）、MgSO4（C）和初始pH（D）進(jìn)一步優(yōu)化，其中NaCl的添加量和pH值對(duì)纖溶酶酶活力的影響為正效應(yīng)，MgSO4和CaCl2的添加量對(duì)纖溶酶酶活力的影響為負(fù)效應(yīng)，因此，為了提高纖溶酶酶活力，需要增加NaCl的添加量，提高pH值，并降低MgSO4和CaCl2的添加量。中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果見表7。

表7 中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Table 7 Design and results of central composite experiments

續(xù)表

運(yùn)用Design-Expert 8.0.6.1軟件對(duì)表7中的數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸分析，方差分析結(jié)果見表8。對(duì)各因素進(jìn)行二次多元回歸擬合后，得到回歸方程：

表8 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果方差分析Table 8 Variance analysis of response surface experiments results

決定系數(shù)R2=0.937 7，修正相關(guān)系數(shù)R2Adj=0.879 6，表明方程的擬合度很好，可以代替真實(shí)試驗(yàn)點(diǎn)結(jié)果進(jìn)行分析。由表8可知，該回歸模型的P＜0.000 1，該模型的影響極顯著，失擬項(xiàng)不顯著（P=0.214 7＞0.05），表明模型擬合度高，一次項(xiàng)A、B、C、D和交互項(xiàng)AB、CD對(duì)響應(yīng)值的影響極顯著（P＜0.01），交互項(xiàng)BC對(duì)響應(yīng)值顯著影響（P＜0.05），說明該模型可以用于該菌株產(chǎn)纖溶酶發(fā)酵優(yōu)化的理論預(yù)測(cè)[14]。

各因素交互作用的響應(yīng)面分析結(jié)果見圖2。

圖2 NaCl、CaCl2、MgSO4和初始pH的交互作用對(duì)纖溶酶活力影響的響應(yīng)面與等高線Fig.2 Response surface and contour line of the effects of interaction between NaCl,CaCl2,MgSO4and initial pH on fibrinolytic enzyme activity

由圖2可知，3個(gè)響應(yīng)面中只有一個(gè)是開口向下的凸形曲線，說明存在極大值，但最優(yōu)條件并不都在于所設(shè)計(jì)的因素水平范圍內(nèi)。在回歸方程中二次項(xiàng)系數(shù)A2、C2、D2系數(shù)為正數(shù)，B2的系數(shù)為負(fù)數(shù)，表明響應(yīng)面極值點(diǎn)可能不止一個(gè)，不能直接從該響應(yīng)面上找出最佳工藝。因此需要使用Design-Expert軟件對(duì)工藝條件進(jìn)行優(yōu)化，在模型取值范圍內(nèi)選擇最低點(diǎn)為起始點(diǎn)，進(jìn)行快速上升法優(yōu)化[15]。

經(jīng)響應(yīng)面分析得出菌株L21產(chǎn)纖溶酶最佳發(fā)酵條件為：NaCl1g/L，CaCl21.03g/L，MgSO40.8g/L，初始pH7.40，在此條件下進(jìn)行3次驗(yàn)證試驗(yàn)，纖溶酶酶活力達(dá)到399.86U/mL，與預(yù)測(cè)值（408.82 U/mL）相符，較優(yōu)化前纖溶酶活力（86.09 U/mL）提高了4.64倍。

2.5 體外溶血試驗(yàn)

圖3 菌株L21體外溶血試驗(yàn)結(jié)果Fig.3 Results ofin vitrohemolysis experiments of strain L21

由圖3可知，目的菌株L21（左）的粗酶液在血瓊脂平板上沒有形成透明圈，但對(duì)照（右）卻在平板上形成了透明圈，說明目的菌株L21通過發(fā)酵培養(yǎng)并沒有產(chǎn)生導(dǎo)致紅細(xì)胞破裂溶解而引起溶血現(xiàn)象的物質(zhì)，菌株L21在體外無溶血作用，可作為一種比較安全的溶栓劑，有開發(fā)為注射劑或藥物制劑的潛力。

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)從海參腸道內(nèi)篩選出一株產(chǎn)纖溶活力較強(qiáng)的菌株L21，通過16S rDNA序列分析，初步鑒定菌株L21為交替假單胞菌（Pseudoalteromonassp.），并采用響應(yīng)面分析法對(duì)菌株L21產(chǎn)酶發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化。結(jié)果表明，菌株L21產(chǎn)酶的最佳條件分別為NaCl 1 g/L，CaCl21.03 g/L，MgSO40.8 g/L，初始pH 7.40。在此條件下，菌株L21發(fā)酵產(chǎn)纖溶酶酶活為399.86 U/mL，較優(yōu)化前纖溶酶活力（86.09 U/mL）提高了4.64倍。因此用響應(yīng)面法優(yōu)化菌株L21產(chǎn)纖溶酶發(fā)酵條件是有效可行的。體外溶血試驗(yàn)結(jié)果表明，菌株L21在體外不引起溶血反應(yīng)，說明它是一個(gè)潛在的安全性較高的溶栓劑。此外，本課題組還研究了該菌株的部分酶學(xué)性質(zhì)，發(fā)現(xiàn)該菌株粗酶液的最適pH值為7.5，最適作用溫度為35℃，接近人體溫度，說明它能在人體內(nèi)發(fā)揮很好的療效，對(duì)其開發(fā)為溶栓藥物有重要的價(jià)值，也對(duì)拓展海洋溶栓藥物的來源是一個(gè)有益的探索。

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Identification of fibrinolytic enzyme-producing strain L21 and its fermentation conditions

YAN Cui1,SUN Yuying1,2*,LIU Dandan1,LIU Ting1,LIU Binbin1,WANG Shujun2
(1.College of Marine Science,Huaihai Institute of Technology,Lianyungang 222005,China;2.Marine Resources Development Institute of Jiangsu,Lianyungang,222005,China)

A high activity fibrinolytic enzyme-producing strain L21 was isolated from the intestinal tract of sea cucumbers by fibrinogen plate method.Strain L21 was identified asPseudoalteromonassp.by 16S rDNA sequence determination and analysis.The single factor experiments,Plackett-Burman experiments and response surface methodology were applied to optimize the fermentation conditions of strain L21.The results showed that the optimum fermentation process conditions of strain L21 were NaCl 1 g/L,CaCl21.03 g/L,MgSO40.8 g/L and initial pH 7.40.Under the conditions,the fibrinolytic enzyme activity of strain L21 was up to 399.86 U/ml,which was 4.64 times higher than that of before optimization(86.09 U/mL).The results ofin vitrohemolysis experiments indicated that strain L21 had potential as a safe-soluble suppository.

Pseudoalteromonassp.;fibrinolytic enzyme;Plackett-Burman experiments;response surface methodology

Q815

0254-5071（2017）10-0076-06

10.11882/j.issn.0254-5071.2017.10.017

2017-06-15

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（41306165）；碳谷-江蘇海資院海洋先進(jìn)材料聯(lián)合研究中心（TG-201402）；江蘇省海洋生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開放課題（2009HS001）

嚴(yán) 翠（1993-），女，碩士研究生，研究方向?yàn)楹Ｑ笪⑸锛捌浠钚晕镔|(zhì)。

*通訊作者：孫玉英（1974-），女，副教授，博士，研究方向?yàn)楹Ｑ笪⑸锩讣夹g(shù)。