張 眾，顧沛雯，張軍翔，*，金 剛

（1.寧夏大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，寧夏 銀川 750021；2.寧夏大學(xué) 葡萄酒學(xué)院，寧夏 銀川 750021）

葡萄酒病害相關(guān)酵母的分離與鑒定

張 眾1，顧沛雯1，張軍翔1，2*，金 剛2

（1.寧夏大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，寧夏 銀川 750021；2.寧夏大學(xué) 葡萄酒學(xué)院，寧夏 銀川 750021）

利用3種培養(yǎng)基和3種分離方法，從賀蘭山東麓葡萄酒產(chǎn)區(qū)發(fā)生葡萄酒病害的5款酒樣中分離獲得23株酵母菌株。經(jīng)形態(tài)學(xué)鑒定，初步將所分離的酵母菌歸為4種培養(yǎng)類型；26S rDNA D1/D2區(qū)序列分析結(jié)果表明，4種培養(yǎng)類型的酵母分屬于3個屬3個種，分別為釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）、葡萄汁有孢漢遜酵母（Hanseniaspora uvarum）和乳酪隱球酵母（Cryptococcus friedmannii）。

葡萄酒病害；酵母菌；形態(tài)學(xué)鑒定；26S rDNA D1/D2

葡萄酒的釀造離不開微生物的作用，但葡萄酒中有些微生物的活動也可能導(dǎo)致葡萄酒病害的發(fā)生[1]。醋酸菌、乳酸菌、酵母菌和霉菌等都能引發(fā)葡萄酒的微生物病害[2]。其中酵母菌既可以發(fā)酵葡萄（汁），在控制不當(dāng)?shù)那闆r下又可能給葡萄酒或發(fā)酵汁帶來一系列問題，從而引發(fā)葡萄酒的酵母病害[3]。如酒香酵母（Brettanomyces）能夠產(chǎn)生大量的揮發(fā)性酚類物質(zhì)，給葡萄酒帶來類似于馬廄味的異味[3]；接合酵母（Zygosaccharomyces）的生長容易使葡萄酒變渾濁或產(chǎn)生沉淀[3]；酵母屬（Saccharomyces）或類酵母（Saccharomycodes）都能利用酒中的殘?zhí)且鹧b瓶酒的再發(fā)酵[4]，使酒體變渾濁，甚至有瓶塞沖出或酒瓶爆炸的危險。

寧夏賀蘭山東麓葡萄酒產(chǎn)區(qū)是中國優(yōu)質(zhì)的葡萄酒產(chǎn)地，擁有著先進(jìn)的葡萄栽培技術(shù)和葡萄酒釀造技術(shù)，但在葡萄酒微生物病害和致病微生物的分離鑒定等方面的研究報道較少，相關(guān)研究多集中于釀酒微生物的多樣性分析與菌種選育等領(lǐng)域[5-8]。本研究利用3種培養(yǎng)基和3種分離方法，從取自于賀蘭山東麓產(chǎn)區(qū)的5款發(fā)生葡萄酒病害的酒樣中分離酵母，并利用形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)相結(jié)合的方法進(jìn)行菌種鑒定，以便為實(shí)際生產(chǎn)中葡萄酒酵母病害的診斷和預(yù)防提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 酒樣

從賀蘭山東麓產(chǎn)區(qū)共收集到5款產(chǎn)生葡萄酒病害的酒樣，其癥狀表述見表1。

表1 產(chǎn)生葡萄酒病害的酒樣特征Table 1 Symptoms of spoiled wine samples

1.1.2 培養(yǎng)基

馬鈴薯葡萄糖瓊脂（potatodextroseagar，PDA）培養(yǎng)基：北京陸橋技術(shù)有限責(zé)任公司；酵母浸出粉胨葡萄糖（yeast peptone dextrose，YPD）瓊脂培養(yǎng)基、孟加拉紅培養(yǎng)基、WL營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基：青島高科園海博生物技術(shù)有限公司。

1.1.3 試劑

Biospin真菌基因組DNA提取試劑盒：杭州博日科技有限公司；2×EcoTaqPCR SuperMix（+dye）、10 000×GelStain核酸染料：北京全式金生物技術(shù)有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

MJX-100B-Z型霉菌培養(yǎng)箱：上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；OLYMPUS顯微鏡：奧林巴斯（中國）有限公司；BIO-RAD聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）擴(kuò)增儀：時代聯(lián)想生物科技有限公司；DYY-6C型電泳儀：北京市六一儀器廠；c200凝膠成像系統(tǒng)、SIGMA小型臺式離心機(jī)：北京元業(yè)伯樂科技發(fā)展有限公司。

1.3 方法

1.3.1 接種液的稀釋

無菌條件下采集酒樣25 mL于滅菌的試管中（標(biāo)記為樣品100）。吸取2.5 mL樣品100加入裝有22.5 mL的無菌蒸餾水的試管中，混勻，制成10-1稀釋樣。按照此方法制成10-1～10-6共6個濃度梯度的稀釋樣。

1.3.2 培養(yǎng)基的篩選

根據(jù)各個酒樣適當(dāng)?shù)南♂尡稊?shù)，在制備好的YPD平板、PDA平板以及孟加拉紅平板上分別接種5個酒樣，重復(fù)3次，25～26℃培養(yǎng)7～10 d（因酒樣A1中可能存在酒香酵母，故需要培養(yǎng)7 d以上[9]），觀察并計(jì)數(shù)菌落數(shù)。

1.3.3 接種方法的比較

采用稀釋涂布法[10]、傾注平板法[10]和劃線法[10]3種方法，對適當(dāng)稀釋倍數(shù)的酒樣進(jìn)行接種，重復(fù)3次，25～26℃培養(yǎng)5～7 d，觀察并計(jì)數(shù)菌落數(shù)。具體如下：

稀釋涂布法：吸取0.1 mL稀釋液點(diǎn)樣在平板上，用涂布棒涂布均勻，培養(yǎng)，計(jì)數(shù)。

傾注平板法：吸取1 mL稀釋液于培養(yǎng)皿，待滅菌培養(yǎng)基冷卻至45～50℃時，倒入平板，輕輕晃動，待培養(yǎng)基凝固，培養(yǎng)，計(jì)數(shù)。

劃線法：將培養(yǎng)基平板分成1/2、1/4、1/4的3個區(qū)，用接種環(huán)蘸取1環(huán)接種液，先“S”形劃線在第1區(qū)（1/2），火焰燈滅菌接種環(huán)，再從第1區(qū)拉線“S”形劃線在第2區(qū)（1/4），如此，直至劃完第3區(qū)（1/4），培養(yǎng)，計(jì)數(shù)第3區(qū)菌落數(shù)。

1.3.4 菌種純化

在3種不同的培養(yǎng)基平板上，選取所有不同培養(yǎng)特征的酵母菌菌落，共23個，用接種環(huán)從菌落邊緣挑取少許酵母菌，直接劃線接種在YPD培養(yǎng)基上，25～26℃培養(yǎng)5～7 d后，再用相同方法挑取單菌落邊緣，劃線，培養(yǎng)，純化3次后，單菌落用于鑒定。

1.3.5 形態(tài)學(xué)鑒定

將分離純化的酵母劃線接種于WL培養(yǎng)基上，25～26℃培養(yǎng)5～7 d。通過觀察WL培養(yǎng)基上酵母菌落的顏色及形態(tài)特征，結(jié)合顯微鏡下酵母細(xì)胞的形態(tài)特征與生殖方式類型，對篩選的酵母菌株進(jìn)行形態(tài)學(xué)的鑒定[8]。根據(jù)形態(tài)學(xué)的初步鑒定結(jié)果，合并菌落特征和細(xì)胞特征相同的類型，從每一種類型選取代表性菌株，共11株，進(jìn)行后續(xù)的分子生物學(xué)鑒定。

1.3.6 分子生物學(xué)鑒定

酵母26SrDNAD1/D2區(qū)擴(kuò)增正反向引物序列為[11]：NL1（正向引物）：（5′-GCATATCAATAAGCGGAGGAAAAG-3′）；NL4（反向引物）：（5′-GGTCCGTGTTTCAAGACGG-3′）。

反應(yīng)體系：10ng/μL～1μg/μL模板DNA2μL；10μmol/L NL1和NL4各1 μL；2×EcoTaqPCR SuperMix（+dye）25 μL；最后添加ddH2O定容至50 μL。PCR擴(kuò)增反應(yīng)程序：95℃預(yù)變性5 min；94℃變性1 min，55℃退火1 min，72℃延伸1 min 20 s，循環(huán)36次；72℃延伸8 min。取3 μL 上樣液點(diǎn)樣于1%的瓊脂糖凝膠（1×TAE緩沖液，提前加入10 000×GelStain核酸染料），在120 V電壓條件下電泳，電泳結(jié)果在C200凝膠成像儀下觀察并拍照。PCR產(chǎn)物送往武漢昆泰銳生物技術(shù)有限責(zé)任公司進(jìn)行純化和測序。

登錄http：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi進(jìn)行同源序列搜索，運(yùn)用Sequin軟件向Genbank提交序列。將11組供試菌株序列和下載的模式菌株序列用ClustalX2.0軟件進(jìn)行序列比對，以假絲酵母屬的Candida zemplinina的26SrDNA D1/D2區(qū)序列為外群，用MEGA4.1軟件運(yùn)用鄰接（Neighbor-Joining，N-J）法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，其中Boostrap值的計(jì)算根據(jù)1 000次隨機(jī)抽樣進(jìn)行。

2 結(jié)果與分析

2.1 培養(yǎng)基的篩選

按照各酒樣合適的稀釋倍數(shù)，在YPD培養(yǎng)基、PDA培養(yǎng)基以及孟加拉紅培養(yǎng)基上接種酒樣，培養(yǎng)結(jié)果見表2。

表2 3種培養(yǎng)基的培養(yǎng)結(jié)果Table 2 Culture results of 3 types of culture mediums

續(xù)表

由表2可知，平板1#、3#、4#、6#、7#、9#、10#、12#、13#、15#上菌落的出現(xiàn)時間早于平板2#、5#、8#、11#、14#。同一酒樣的相同稀釋倍數(shù)的接種液，平板1#、4#、7#、10#、13#上出現(xiàn)的菌落數(shù)最多，說明相比于其他兩種培養(yǎng)基，使用YPD培養(yǎng)基可以從病害葡萄酒中分離得到更多的酵母菌。平板11#上發(fā)現(xiàn)霉菌污染，平板3#、6#、9#、12#、15#上的菌落均被染色（對于計(jì)數(shù)影響不大，但是影響菌落觀察）。綜上，YPD培養(yǎng)基為本實(shí)驗(yàn)培養(yǎng)酵母的最佳培養(yǎng)基。

2.2 分離方法的比較

用稀釋涂布法、傾注平板法和劃線法3種方法接種A1、A2和B1 3個酒樣于YPD培養(yǎng)基，培養(yǎng)結(jié)果見表3。

表3 3種分離方法的培養(yǎng)結(jié)果Table 3 Culture results of 3 isolation methods

由表3可知，平板21#、24#、27#上的菌落數(shù)均與真實(shí)值差距較大，其中，平板21#、27#上都未培養(yǎng)出菌落。這是由于使用劃線法接種時，接種環(huán)蘸取接種液的量較少，而酒樣中酵母含量低，所以酵母的接種量不能夠得到保證。稀釋涂布法相對于傾注平板法，更易形成均勻分布的單菌落，方便計(jì)數(shù)；平板19#、22#、25#上的菌落數(shù)分別多于平板20#、23#、26#，表明稀釋涂布法比傾注平板法的培養(yǎng)結(jié)果更接近于真實(shí)值。綜上，稀釋涂布法為本實(shí)驗(yàn)最為理想的酒樣中酵母的分離方法。

2.3 形態(tài)學(xué)鑒定結(jié)果

通過WL培養(yǎng)基的培養(yǎng)，對照顯微鏡下酵母細(xì)胞的形態(tài)特征與生殖類型，合并菌落特征和細(xì)胞特征相同的菌株，將23株酵母菌株初步分成4種類型，結(jié)果見表4。將表4的描述與張春芝等[8，12]的研究進(jìn)行對比，可以初步認(rèn)為，類型Ⅰ是釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae），類型Ⅱ是葡萄汁有孢漢遜酵母（Hanseniaspora uvarum），而類型Ⅲ和類型Ⅳ均未確定種。

表4 WL培養(yǎng)基上酵母菌落特征和顯微鏡下酵母細(xì)胞特征的描述Table 4 Characteristic description of yeast colonies on WL culture medium and yeast cells under microscope

2.4 PCR擴(kuò)增與測序結(jié)果

從每一種類型選取代表性菌株，共11株，進(jìn)行分子生物學(xué)鑒定。11株代表性菌株P(guān)CR產(chǎn)物的電泳檢測見圖1。其中來自于類型Ⅰ的有：菌株A103、A104、A201、A304、B101；來自于類型Ⅱ的有：菌株B103、B201、B205；來自于類型Ⅲ的是菌株A303；來自于類型Ⅳ的有：菌株A202、A301。

圖1 供試菌株26S rDNA D1/D2區(qū)PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.1 Results of PCR amplification for 26S r DNA D1/D2 domain of tested strains

由圖1可知，11株酵母菌株的擴(kuò)增條帶均非常明顯，26S rDNA D1/D2區(qū)基因序列大小均落在570 bp左右，與目標(biāo)片段大小相符，可以進(jìn)行測序。

經(jīng)BLAST分析及序列相似性比較，Genbank中與供試菌株26S rDNA D1/D2區(qū)基因序列相似性最高的相關(guān)模式菌株見表5。由表5可知，供試菌株與模式菌株的26S rDNA D1/D2區(qū)基因相似性均介于99%～100%，符合同種內(nèi)不同菌株間該區(qū)間基因差異不超過1%的標(biāo)準(zhǔn)[13-14]。分子生物學(xué)鑒定結(jié)果表明，類型Ⅰ是釀酒酵母（Saccharomycescerevisiae），類型Ⅱ是葡萄汁有孢漢遜酵母（Hanseniaspora uvarum），類型Ⅲ是乳酪隱球酵母（Cryptococcus friedmannii），類型Ⅳ為釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）。

表5 11株供試菌株與相應(yīng)模式菌株的序列比對Table 5 Sequence comparison of 11 tested strains and corresponding type strains

2.5 系統(tǒng)發(fā)育分析

利用Mega4.1軟件構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹見圖2。由圖2可以看出，系統(tǒng)發(fā)育樹的聚類結(jié)果與序列比對結(jié)果相一致，所有供試菌株均與其相應(yīng)模式菌株聚為一枝，11株供試菌株共聚為2大主枝3個分枝。其中釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）與葡萄汁有孢漢遜酵母（Hanseniaspora uvarum）聚在一個主枝上，其bootstrap支持率為99%，具有很高的同源性。綜上，11株代表菌株分別歸屬于已知的3個不同的酵母屬和3個不同的酵母菌種群。

圖2 11株供試菌株基于26S rDNA D1/D2區(qū)序列的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.2 Phylogenetic tree of 11 tested strains based on 26S rDNA D1/D2 domain gene

2.6 討論

CAVAZZA A等[15]發(fā)現(xiàn)，可以使用WL培養(yǎng)基來區(qū)分葡萄酒相關(guān)酵母的種類；ROMANCINO D P等[16]用WL培養(yǎng)基對意大利西西里島染菌葡萄醪中分離的酵母菌進(jìn)行了形態(tài)學(xué)的鑒定，效果明顯。本實(shí)驗(yàn)在鑒定酵母菌種的過程中，首先使用WL培養(yǎng)基進(jìn)行酵母菌落的分類，并配合酵母細(xì)胞光學(xué)顯微鏡觀察進(jìn)行形態(tài)學(xué)鑒定，共歸為4種類型，再從每一種類型挑選代表性菌株（共11株）進(jìn)行分子生物學(xué)鑒定。此方法不需要對全部菌株都進(jìn)行基因片段的PCR擴(kuò)增和測序，因此具有一定的實(shí)用性。

葡萄酒裝瓶以后，釀酒酵母（Saccharomycescerevisiae）能夠利用殘?zhí)窃俅螁影l(fā)酵[4]。因此，為防止殘?zhí)呛扛叩钠咸丫蒲b瓶后再發(fā)酵，灌裝之前要對葡萄酒進(jìn)行嚴(yán)格的除菌處理。ROJAS V等[17-18]的研究表明，葡萄汁有孢漢遜酵母（Hanseniaspora uvarum）能夠產(chǎn)生乙酸乙酯從而影響葡萄酒的風(fēng)味。因此，在接種發(fā)酵啟動后，要盡快促使釀酒酵母占據(jù)優(yōu)勢，并合理使用SO2控制部分野生酵母的數(shù)量。一些隱球酵母屬（Cryptococcus）酵母也屬于葡萄酒敗壞性酵母[19-20]，能夠使葡萄酒變黏稠[4]。本實(shí)驗(yàn)從一款有焦化味并且酒液黏稠的葡萄酒樣品中分離獲得了乳酪隱球酵母（Cryptococcus friedmannii），而王曉昌等[12，21-22]均未從賀蘭山東麓葡萄酒產(chǎn)區(qū)分離出該種酵母。因此，本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)的乳酪隱球酵母（Cryptococcus friedmannii）具有一定的研究價值。

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)從賀蘭山東麓產(chǎn)區(qū)發(fā)生葡萄酒病害的5款酒樣中共分離鑒定出3種酵母：釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）、葡萄汁有孢漢遜酵母（Hanseniaspora uvarum）和乳酪隱球酵母（Cryptococcus friedmannii）。所使用的3種分離方法和3種培養(yǎng)基中，采用稀釋涂布法在YPD固體培養(yǎng)基上接種適當(dāng)稀釋濃度的酒樣，于25～26℃條件下培養(yǎng)5～7d進(jìn)行活菌計(jì)數(shù)效果最佳。結(jié)合使用WL培養(yǎng)基與細(xì)胞顯微鏡觀察的形態(tài)學(xué)分類方法和26S rDNA D1/D2區(qū)序列分析的分子生物學(xué)方法來鑒定酵母菌種，結(jié)果可信度高。

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Isolation and identification of yeasts related to wine spoilage

ZHANG Zhong1,GU Peiwen1,ZHANG Junxiang1,2*,JIN Gang2
(1.School of Agriculture,Ningxia University,Yinchuan 750021,China;2.School of Wine,Ningxia University,Yinchuan 750021,China)

Using 3 culture mediums and 3 isolation methods,23 yeast strains were isolated from 5 spoiled wine samples collected from Helan Mountain East Wine Region.These yeast strains were initially classified into 4 cultured types based on morphological identification.The sequence analysis for 26S rDNA D1/D2 domain gene showed that representative strains from these 4 cultured types belonged to 3 genus and 3 species:Saccharomyces cerevisiae,Hanseniaspora uvarumandCryptococcus friedmannii.

wine spoilage;yeast;morphological identification;26S rDNA D1/D2

TS261.1

0254-5071（2017）10-0056-05

10.11882/j.issn.0254-5071.2017.10.013

2017-04-11

寧夏自治區(qū)“十三五”重大科技項(xiàng)目（2016BZ06）

張 眾（1995-），男，碩士研究生，研究方向?yàn)槠咸雅c葡萄酒工程。

*通訊作者：張軍翔（1971-），男，教授，博士，研究方向?yàn)槠咸言耘嗪推咸丫漆勗臁?/p>