薛淼，王娜，2，通信作者，何新益，2

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HPLC法測(cè)定茶葉中5種水溶性維生素

薛淼1，王娜1，2，通信作者，何新益1，2

（1.天津農(nóng)學(xué)院食品科學(xué)與生物工程學(xué)院，天津 300384；2.天津市農(nóng)副產(chǎn)品深加工技術(shù)工程中心，天津300384）

比較不同茶類(lèi)水溶性維生素的含量，通過(guò)優(yōu)化茶樣預(yù)處理方法和色譜技術(shù)，建立一種RP-HPLC檢測(cè)方法，測(cè)定5種不同水溶性維生素。結(jié)果表明，飽和醋酸鉛溶液沉淀處理茶樣溶液，在C18柱（4.6 mm×150.0 mm，5 μm），檢測(cè)波長(zhǎng)為266 nm，流速為1 mL/min，流動(dòng)相為甲醇和0.03 mol/L乙酸鈉-乙酸緩沖液（pH＝5.5）混合，梯度洗脫的HPLC色譜條件下，茶樣中VB1、VB2、VB6、Vc和煙酸5種維生素分離效果好。紅茶中維生素C、維生素B1和維生素B2的含量較多，分別為3.69、2.92和5.18 μg/g。綠茶中維生素B6的含量較多，為2.30 μg/g。青茶和綠茶中未檢出維生素B1，4種茶葉中均未檢出煙酸。該檢測(cè)方法有效地檢測(cè)了4種茶葉中的5種水溶性維生素含量，可為茶葉品質(zhì)控制提供參考。

茶葉；水溶性維生素；HPLC

茶葉作為日常飲品，含有豐富的茶多酚、蛋白質(zhì)、氨基酸、糖類(lèi)、礦物元素和多種水溶性維生素。水溶性維生素分為維生素C和B族維生素。不同茶類(lèi)由于加工工藝不同，維生素含量差異明顯。水溶性維生素常用的測(cè)定方法有：紫外分光光度法、分子熒光法和HPLC[1]，此外還有毛細(xì)管電泳法[2-3]。司雄元等[2]建立了毛細(xì)管電泳法同時(shí)測(cè)定茶葉中多種水溶性維生素的方法，并對(duì)茶樹(shù)頂芽和葉片中7種水溶性維生素進(jìn)行對(duì)比，結(jié)果表明茶樹(shù)芽頂中的水溶性維生素含量最高。吳艷艷等[4]應(yīng)用HPLC法建立以草酸為流動(dòng)相的等比洗脫測(cè)定鐵觀音茶葉和茶莖中維生素C的含量，結(jié)果表明鐵觀音中維生素C的含量高于茶莖中維生素C的含量。郭玉華等[5]采用HPLC梯度洗脫，以磷酸二氫鉀為流動(dòng)相測(cè)定茶葉中5種水溶性維生素，結(jié)果表明普洱和毛尖中維生素C的含量最高，其中煙酸未檢出。紫外分光光度法干擾嚴(yán)重，不能實(shí)現(xiàn)同時(shí)測(cè)定，需要合適的樣品前處理。分子熒光法測(cè)定維生素的靈敏度相對(duì)較高，但應(yīng)用范圍窄。毛細(xì)管電泳法成本雖低但分離度較差，并且設(shè)備投資大。用HPLC法進(jìn)行定量分析時(shí)，一次可測(cè)多種組份的含量，具有分析速度快、分離效能高、靈敏度高的特點(diǎn)[6-10]。

中國(guó)按加工工藝將茶葉分為6大茶系，分別為綠茶、青茶、紅茶、黑茶、白茶和黃茶。近幾年來(lái)，茶葉中水溶性維生素的檢測(cè)報(bào)道主要集中在綠茶和黑茶，對(duì)青茶和紅茶的測(cè)定報(bào)道較少。不同地域的飲茶習(xí)慣不同，北方地區(qū)日常消費(fèi)較多的4大茶類(lèi)為綠茶、青茶、紅茶和黑茶。本文以綠茶、青茶、紅茶和黑茶為研究對(duì)象，通過(guò)對(duì)茶樣預(yù)處理方法和色譜條件進(jìn)行優(yōu)化，利用HPLC法測(cè)定4種茶葉中5種水溶性維生素，為不同加工工藝對(duì)茶葉中水溶性維生素的影響提供一種快速、有效的檢測(cè)方法和參考。

1 材料與方法

1.1 原料與試劑

綠茶、青茶、紅茶、黑茶，購(gòu)于天津市南開(kāi)區(qū)華苑茶城。

鹽酸、醋酸鉛、無(wú)水乙酸鈉、冰乙酸均為分析純；甲醇為特優(yōu)級(jí)品，購(gòu)于天津康巢科技開(kāi)發(fā)有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

電子天平：FA1104A型，上海精密科學(xué)儀器有限公司；pH計(jì)：PHS-3C型，廣州市新英電器有限公司；數(shù)控超聲波清洗器：KQ-500DE型，昆山市超聲儀器有限公司；數(shù)顯鼓風(fēng)干燥箱：GZX-9076 MBE型，上海博迅實(shí)業(yè)有限公司；半制備液相色譜：Agilent 1200型，Agilent公司；電熱恒溫水浴鍋：HHS型，天津市華北實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；高速冷凍離心機(jī)：Z323K型，Hermle公司；移液針：D12-B3827型，Agilent公司；移液槍?zhuān)篠A714A10006型，北京東林昌盛生物科技有限公司；Prevail C18：Female（B），Grace公司；C18柱（4.6 mm×150.0 mm，5 μm）。

1.3 維生素標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液的配制

分別吸取0.05、0.10、0.30、0.50、0.80 mL的100 μg/mLVB1、VB6、VC、煙酸儲(chǔ)備液和0.05、0.10、0.20、0.40、0.50 mL的20 μg/mLVB2儲(chǔ)備液于10 mL容量瓶中，用0.01 mol/L鹽酸定容，作為混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。

1.4 樣品預(yù)處理

青茶、綠茶、紅茶和黑茶用高速萬(wàn)能粉碎機(jī)粉碎至40目，備用。準(zhǔn)確稱(chēng)取1 g的茶樣于試管中，加入10 mL的0.01 mol/L的鹽酸溶液搖勻浸泡，超聲波振蕩10 min。取上層清液于離心管內(nèi)，加入飽和醋酸鉛溶液靜置30 min，使樣品充分反應(yīng)，沉淀，用離心機(jī)以3 000 r/min離心10 min，取上層清液。用0.22 μm有機(jī)系微孔濾膜過(guò)濾。

1.5 色譜條件的選擇試驗(yàn)

1.5.1 洗脫方式的選擇

采用乙酸鈉-乙酸緩沖液，測(cè)試了2種洗脫方式，以青茶作為測(cè)試樣，其中流動(dòng)相A為0.03 mol/L乙酸鈉-乙酸緩沖液（pH＝5.5），流動(dòng)相B為甲醇。測(cè)試條件見(jiàn)表1。

表1 洗脫方式的測(cè)試條件

1.5.2 流動(dòng)相組成的選擇

采用1.5.1中梯度洗脫的方法測(cè)試了3種流動(dòng)相，以青茶作為測(cè)試樣，測(cè)試條件見(jiàn)表2。

表2 流動(dòng)相的測(cè)試條件

1.5.3 茶樣維生素的計(jì)算

本文采用外標(biāo)法[11]對(duì)茶樣中水溶性維生素的含量進(jìn)行計(jì)算。每個(gè)試樣測(cè)定3次，取平均值。

2 結(jié)果與分析

2.1 流動(dòng)相對(duì)分離效果的影響

本文考察了甲醇/草酸和甲醇/磷酸二氫鉀作為流動(dòng)相，其中草酸流動(dòng)相的分離色譜圖出現(xiàn)倒峰，不利于計(jì)算。磷酸二氫鉀流動(dòng)相的分離效果好，但由于環(huán)境原因，易析出結(jié)晶，堵塞色譜柱，其保留時(shí)間與維生素C的保留時(shí)間幾乎相同，使誤差增大[12]。乙酸鈉-乙酸緩沖液為酸性溶液，不會(huì)電離并抑制拖尾，同時(shí)流動(dòng)相的分離效果及峰形較好，不易析出結(jié)晶，隨時(shí)可用。故選擇0.03 mol/L乙酸鈉-乙酸作為流動(dòng)相。

2.2 洗脫條件對(duì)分離效果的影響

測(cè)試等比洗脫條件，14 min時(shí)出現(xiàn)連峰，分離效果較差，測(cè)試過(guò)程中多數(shù)色譜圖出現(xiàn)連峰現(xiàn)象。因此，研究采用流動(dòng)相體系A(chǔ)為0.03 mol/L乙酸鈉-乙酸緩沖液（pH＝5.5），B為甲醇，從進(jìn)樣時(shí)90%的A經(jīng)10 min線性變化到80%的A，然后再經(jīng)過(guò)20 min線性變化為20%的A，梯度洗脫條件下的分離情況較好，未出現(xiàn)連峰。試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖1、圖2。

圖1 等比洗脫分離色譜圖

圖2 梯度洗脫分離色譜圖

2.3 5種維生素的回歸方程及相關(guān)系數(shù)

標(biāo)準(zhǔn)維生素混標(biāo)的色譜圖如圖3所示。

圖3 標(biāo)準(zhǔn)維生素混標(biāo)色譜圖

以標(biāo)準(zhǔn)維生素混標(biāo)的一系列濃度，按上述色譜條件將每種濃度進(jìn)樣5 μL，水溶性維生素混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的出峰順序依次為維生素C、煙酸、維生素B6、維生素B1和維生素B2，且22 min內(nèi)5種水溶性維生素完全分離。

對(duì)混合標(biāo)準(zhǔn)溶液分離檢測(cè)，得到以峰面積對(duì)標(biāo)準(zhǔn)維生素的濃度的線性回歸分析，建立回歸方程、相關(guān)系數(shù)和殘留標(biāo)準(zhǔn)誤差（表3），結(jié)果顯示線性關(guān)系良好。

表3 5種水溶性維生素的回歸方程、相關(guān)系數(shù)和殘留標(biāo)準(zhǔn)誤差

2.4 樣品分析

在優(yōu)化后的色譜條件下，對(duì)4種茶葉中5種水溶性維生素的含量進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 不同茶葉中五種水溶性維生素的含量 μg/g

注：ND表示未檢出

從表4中可以看出，紅茶中維生素C、維生素B1、維生素B2的含量均高于其他3類(lèi)茶葉，而綠茶中維生素B6的含量最高，青茶和綠茶中未檢出維生素B1，4種茶葉中均未檢出煙酸。賈林艷等[12]測(cè)定花茶和綠茶中煙酸、維生素C、B1、B2、B6的實(shí)驗(yàn)中，花茶和綠茶中均含有煙酸和維生素C，花茶中維生素B2的含量最高，含量為2.88%，維生素B1和維生素B6未檢出。本試驗(yàn)結(jié)果與賈林艷等的試驗(yàn)結(jié)果存在顯著差異，維生素含量存在差異主要與試驗(yàn)方法、儀器、茶葉的加工工藝、生產(chǎn)年份和貯藏條件等條件有關(guān)。

3 結(jié)論

本文以4種不同茶類(lèi)的茶葉為材料，采用甲醇和0.03 mol/L乙酸鈉-乙酸為流動(dòng)相，梯度洗脫條件下實(shí)現(xiàn)5種水溶性維生素含量的測(cè)定，具有分離效果好、檢測(cè)速度快、操作簡(jiǎn)便的優(yōu)點(diǎn)。結(jié)果顯示不同品種茶葉中水溶性維生素的含量明顯不同。研究為不同茶類(lèi)之間水溶性維生素含量存在顯著差異提供佐證，為茶葉加工品質(zhì)控制及研究維生素在茶葉加工過(guò)程中的變化提供一種檢測(cè)方法。

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責(zé)任編輯：張愛(ài)婷

HPLC Determination of Five Water-soluble Vitamins in Tea

XUE Miao1, WANG Na1,2,Corresponding Author, HE Xin-yi1,2

（1. Colloge of Food Science and Biological Engineering, Tianjin Agricaltural Univercity, Tianjin300384, China；2. Tianjin Engineering Research Center Agricultural Products Processing, Tianjin 300384, China)

A HPLC method was established to determine five kinds of water-soluble vitamins content in different tea. Optimization of tea pretreatment and chromatographic conditions were obtained. Experiments showed that treatment of tea samples solution pretreated with saturated lead acetate solution. The chromatographic separation was achieved by using a C18column with dimension of 4.6 mm×150.0 mm and particle size of 5 μm. A mixture of methanol and NaAC-HAC buffer solution（pH＝5.5）was used as mobile phase. The effluent was monitored at 266 nm, with flow rate of 1 mL/min and gradient elution. The results showed that the separation of VB1, VB2, VB6, Vc and nicotinic acid was the best in the condition of in HPLC samples, the content of vitamin C, vitamin B1 and vitamin B2 in black tea was more, were 3.69、2.92 and 5.18 μg/g. The content of vitamin B6in green tea was more, was 2.30 μg/g. Green tea and Oolong were not detected in vitamin B1. And four kinds of tea were not detected niacin. The method can detect the content of water-soluble vitamins in four kinds of tea, and provide the reference for the quality control of tea.

tea; water-soluble vitamin; HPLC

1008-5394（2017）03-0069-04

Q946.889

A

2017－02－20

科技部科技人員服務(wù)企業(yè)行動(dòng)項(xiàng)目“傲綠公司有機(jī)糙米茶飲料研發(fā)項(xiàng)目”（2009GJA10032）

薛淼（1993－），女，河北唐山人，碩士在讀，主要從事農(nóng)產(chǎn)品加工研究。E-mail：709274003@qq.com。

王娜（1977－），女，天津市人，高級(jí)實(shí)驗(yàn)師，碩士，主要從事農(nóng)產(chǎn)品加工研究。E-mail：18575553@qq.com。