樊曉盼，仇泓博，馬儷珍

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響應(yīng)面法優(yōu)化牛骨肉蛋白液酶解工藝條件

樊曉盼，仇泓博，馬儷珍通信作者

（天津農(nóng)學(xué)院食品科學(xué)與生物工程學(xué)院天津市農(nóng)副產(chǎn)品深加工技術(shù)工程中心，天津300384）

以高壓浸提后的牛骨肉蛋白液（蛋白含量2.15%）為研究對(duì)象，通過單因素和響應(yīng)面法優(yōu)化試驗(yàn)，分別研究風(fēng)味蛋白酶和復(fù)合蛋白酶的酶解條件對(duì)酶解液水解度和氨基態(tài)氮含量的影響，進(jìn)而優(yōu)選出兩種酶單獨(dú)添加時(shí)的最佳酶解工藝條件。結(jié)果表明：風(fēng)味蛋白酶的最佳酶解條件為酶解溫度45℃、酶解時(shí)間4.3 h、酶添加量50 LAPU/g蛋白質(zhì)，在此條件下水解度為15.88%；復(fù)合蛋白酶的最佳酶解條件為酶解溫度45℃、酶解時(shí)間4.5 h、酶添加量15 000 U/g，在此條件下水解度達(dá)到12.78%。

牛骨肉；酶解工藝；風(fēng)味蛋白酶；復(fù)合蛋白酶；水解度

我國(guó)是畜牧業(yè)大國(guó)，豬、牛、羊等畜禽肉平均年產(chǎn)量可達(dá)8 454×104t，以畜禽骨占胴體10%估算，我國(guó)每年可產(chǎn)生845×104t[1-4]。骨中含有豐富的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，包括蛋白質(zhì)、脂肪、氨基酸、骨膠原、粘多糖、軟骨素以及礦物質(zhì)等多種人體所需的營(yíng)養(yǎng)素，是一種營(yíng)養(yǎng)全面的天然資源[5-7]。但由于人們消費(fèi)觀念的影響以及我國(guó)加工技術(shù)水平的制約，大部分畜禽骨未能被充分加工利用或僅加工成附加值很低的產(chǎn)品[8-10]。

骨中蛋白質(zhì)含量豐富，且骨蛋白生物學(xué)效價(jià)高，屬于一種優(yōu)質(zhì)蛋白，然而我國(guó)蛋白質(zhì)資源十分緊張，因此充分開發(fā)利用骨副產(chǎn)物中的蛋白質(zhì)對(duì)緩解我國(guó)蛋白資源緊張具有重要意義[11-12]。目前，國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)骨蛋白的研究主要集中于通過酶解技術(shù)，將骨蛋白降解為小分子物質(zhì)進(jìn)行利用。余杰[13]等利用中性蛋白酶和木瓜蛋白酶，對(duì)鰻魚頭酶解條件進(jìn)行優(yōu)化，再經(jīng)脫苦脫色處理后研制出一種高級(jí)海鮮風(fēng)味調(diào)料。朱瀛等[14]等采用中性蛋白酶對(duì)雞骨泥進(jìn)行酶解，通過優(yōu)化酶解條件最終制得一種具有抗氧化性的雞骨短肽。Suroukat等[15]采用胃蛋白酶對(duì)雞頭骨蛋白進(jìn)行酶解，確定了最佳酶解條件，并檢測(cè)到酶解液中含有豐富的氨基酸，為肉味香料的制備提供前體物質(zhì)。

目前我國(guó)每年要從國(guó)外進(jìn)口大量的冷凍畜禽胴體，在用電鋸進(jìn)行分割過程中，會(huì)產(chǎn)生大量的牛骨肉鋸末（簡(jiǎn)稱牛骨肉），經(jīng)檢測(cè)，這種牛骨肉中含有豐富的蛋白質(zhì)（16.51%）、脂肪（8.71%）等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)[16]。在前期優(yōu)化高壓浸提牛骨肉蛋白條件的基礎(chǔ)上，本研究以高壓浸提的牛骨肉蛋白液為底物，以水解度和氨基態(tài)氮含量為評(píng)價(jià)指標(biāo)，通過單因素和響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)，研究風(fēng)味蛋白酶和復(fù)合蛋白酶單獨(dú)添加時(shí)的最佳酶解條件，為美拉德反應(yīng)制備肉味香料提供最佳酶解方式和充分的前體物質(zhì)，進(jìn)而為工業(yè)化精深加工牛骨肉提供理論和數(shù)據(jù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

牛骨肉，由頂興（天津）食品科技發(fā)展有限公司提供；風(fēng)味蛋白酶（活力：500 LAPU/g）、復(fù)合蛋白酶（活力：150 000 U/g），購(gòu)于丹麥諾維信酶制劑有限公司。

試劑：氫氧化鈉、酚酞、甲醛，均為分析純，購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

FA2004精密分析天平（上海精科儀器公司）；移液槍（Eppendovf公司）；SX-500高壓蒸汽滅菌鍋（日本TOMY有限公司）；THZ-98AB型恒溫振蕩器（上海一恒科學(xué)儀器有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 牛骨肉蛋白浸提液的制備

根據(jù)前期試驗(yàn)結(jié)果，稱取25 g牛骨肉（水分含量49.66%），按照料水比為1∶4的比例添加自來(lái)水，在壓力0.2 MPa、浸提溫度133 ℃條件下浸提4 h得到牛骨肉蛋白浸提液（蛋白含量為3.0 g/100g）。

1.3.2 單因素試驗(yàn)

以上述牛骨肉蛋白浸提液為酶解底物，調(diào)節(jié)pH為7，添加風(fēng)味蛋白酶或復(fù)合蛋白酶，分別以酶解溫度、酶解時(shí)間和酶添加量為自變量，以水解度和氨基態(tài)氮含量為因變量，通過單因素試驗(yàn)（表1）研究酶解條件對(duì)牛骨肉蛋白浸提液的酶解效果。

表1 單因素試驗(yàn)水平

1.3.3 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上，以蛋白水解度為響應(yīng)值，采用Design Expert軟件設(shè)計(jì)3因素3水平試驗(yàn)，分別對(duì)兩種酶（風(fēng)味蛋白酶和復(fù)合蛋白酶）的酶解時(shí)間、酶解溫度以及酶添加量進(jìn)行優(yōu)化。因素水平及編碼見表2和表3。

表2 風(fēng)味蛋白酶響應(yīng)面試驗(yàn)因素及水平編碼值

表3 復(fù)合蛋白酶響應(yīng)面試驗(yàn)因素及水平編碼值

1.4 指標(biāo)測(cè)定

氨基態(tài)氮含量的測(cè)定[17]：甲醛電位滴定法。

1.5 數(shù)據(jù)處理

用Microsoft Excel 2003對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行預(yù)處理，Statistix 8.1進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，顯著性差異（＜0.05）通過Turkey test程序進(jìn)行，Sigmaplot 10.0作圖。響應(yīng)面試驗(yàn)采用Design-Expert 7.0設(shè)計(jì)并進(jìn)行結(jié)果分析，通過建立回歸方程、繪制等高線和三維曲面圖，對(duì)任意兩種因素的交互效應(yīng)進(jìn)行分析評(píng)價(jià)。

2 結(jié)果與分析

2.1 酶解溫度對(duì)牛骨肉蛋白酶解液水解度和氨基態(tài)氮含量變化的影響

圖1（A）和圖1（B）分別代表隨著溫度的變化風(fēng)味蛋白酶和復(fù)合蛋白酶對(duì)牛骨肉蛋白酶解液的水解度和氨基態(tài)氮含量的影響。由圖1可以看出，在30～70 ℃范圍內(nèi)，隨著溫度的升高，兩種酶作用的酶解液水解度和氨基態(tài)氮含量均呈先上升后下降的趨勢(shì)。這是因?yàn)樵?0～50 ℃范圍內(nèi)，溫度越高，酶與底物的作用機(jī)會(huì)越多，氨基態(tài)氮含量越高，水解度就越大；但是當(dāng)溫度超過50 ℃后，則會(huì)導(dǎo)致酶活性逐漸失活，從而導(dǎo)致水解度降低[18]。如風(fēng)味蛋白酶在50 ℃時(shí)，水解度和氨基態(tài)氮含量達(dá)到最高，水解度為15.89%，氨基態(tài)氮含量為71.23 mg/100g；復(fù)合蛋白酶分別在50 ℃和60 ℃時(shí)，兩者水解度和氨基態(tài)氮含量差異不顯著（＞0.05），但考慮到加工的可操作性和成本問題，所以選擇兩種蛋白酶的適宜酶解溫度均為50 ℃。

A風(fēng)味蛋白酶 B復(fù)合蛋白酶

2.2 酶解時(shí)間對(duì)牛骨肉蛋白酶解液水解度和氨基態(tài)氮含量變化的影響

圖2（A）和圖2（B）分別代表隨著酶解時(shí)間的變化風(fēng)味蛋白酶和復(fù)合蛋白酶對(duì)酶解液水解度和氨基態(tài)氮含量的影響。由圖2可以看出，在1～5 h范圍內(nèi)，隨著酶解時(shí)間的延長(zhǎng)，兩種蛋白酶整體上使牛骨肉蛋白酶解液的水解度和氨基態(tài)氮呈緩慢上升趨勢(shì)。

圖2（A）顯示，當(dāng)風(fēng)味蛋白酶的酶解時(shí)間為3 h時(shí)，水解度和氨基態(tài)氮含量分別為15.93%和71.40 mg/100g；當(dāng)酶解時(shí)間增加為4 h時(shí)，水解度和氨基態(tài)氮含量并未出現(xiàn)明顯變化（＞0.05）；但若繼續(xù)延長(zhǎng)至5 h，水解度和氨基態(tài)氮含量則會(huì)明顯提高，水解度達(dá)到17.84%，氨基態(tài)氮含量達(dá)到79.98 mg/100g，差異達(dá)顯著水平（＜0.05），然而由于過度水解會(huì)導(dǎo)致苦味肽的產(chǎn)生[19]，結(jié)合感官評(píng)定，并考慮實(shí)際生產(chǎn)中的各工序時(shí)間安排和成本問題，故選擇風(fēng)味蛋白酶適宜酶解時(shí)間為3 h。

A風(fēng)味蛋白酶 B復(fù)合蛋白酶

從圖2（B）可看出，當(dāng)復(fù)合蛋白酶的酶解時(shí)間為3 h時(shí)，水解度和氨基態(tài)氮含量分別為15.66%和70.18 mg/100g，但當(dāng)延長(zhǎng)酶解時(shí)間至5 h時(shí)，酶解液的水解度和氨基態(tài)氮含量均無(wú)顯著變化（＞0.05），所以，選擇復(fù)合蛋白酶的適宜酶解時(shí)間為3 h。

2.3 添加量對(duì)牛骨肉蛋白酶解液水解度和氨基態(tài)氮含量的影響

圖3（A）和圖3（B）分別代表風(fēng)味蛋白酶和復(fù)合蛋白酶的添加量對(duì)牛骨肉蛋白酶解液水解度和氨基態(tài)氮含量的影響。由圖3可以看出，隨著兩種蛋白酶添加量的增加，酶解液的水解度和氨基態(tài)氮含量整體呈上升趨勢(shì)（＜0.05），但變化速率不同。從圖3（A）可以看出，當(dāng)風(fēng)味蛋白酶添加量在10～30 LAPU/g范圍內(nèi)，水解度隨著加酶量增加而迅速增加；但酶添加量為30～50 LAPU/g范圍內(nèi)增幅明顯減緩（＞0.05）；從圖3（B）可看出，當(dāng)復(fù)合蛋白酶添加量從3 000 U/g增加到9 000 U/g時(shí)，水解度和氨基態(tài)氮含量明顯增加（＜0.05），相應(yīng)的數(shù)值增加到15.81%和70.88 mg/100 g；但當(dāng)酶添加量繼續(xù)增加到15 000 U/g時(shí)，水解度和氨基態(tài)氮含量變化并不明顯（＞0.05）。所以，綜合考慮酶解效果和加工成本，確定風(fēng)味蛋白酶的添加量為30 LAPU/g，復(fù)合蛋白酶的添加量為9 000 U/g。

A風(fēng)味蛋白酶 B復(fù)合蛋白酶

2.4 響應(yīng)面試驗(yàn)確定最佳浸提工藝參數(shù)

在單因素試驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上，使用Design- Expert 7.0軟件，依據(jù)Box-Behnken中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理設(shè)計(jì)響應(yīng)面優(yōu)化分析試驗(yàn)，研究酶解溫度（A）、酶解時(shí)間（B）和酶添加量（C）3個(gè)因素對(duì)牛骨肉蛋白酶解液水解度（Y）的影響。

2.4.1 風(fēng)味蛋白酶酶解牛骨肉蛋白浸提液的響應(yīng)面優(yōu)化

風(fēng)味蛋白酶酶解溫度（A）、酶解時(shí)間（B）和酶添加量（C）3個(gè)因素響應(yīng)面中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見表4。

表4 響應(yīng)面中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

利用Design-Expert 7.0軟件對(duì)上述試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行多元線性回歸分析，建立水解度（）對(duì)酶解溫度（）、酶解時(shí)間（）和酶添加量（）的二次回歸方程＝13.65＋0.55＋0.51＋2.38- 0.19-0.21-0.13-0.942-0.362-0.502（1）

對(duì)試驗(yàn)所建立的回歸模型進(jìn)行方差分析，結(jié)果如表5所示。由表5中可看出，＝0.000 2＜0.01，達(dá)極顯著水平，充分說明本試驗(yàn)對(duì)風(fēng)味蛋白酶酶解效果所建立的模型顯著回歸；失擬項(xiàng)＝0.557 4＞0.05，不顯著，說明本試驗(yàn)所建立的回歸模型擬合度較高，能夠真實(shí)地?cái)M合響應(yīng)面。相關(guān)系數(shù)2＝0.990 1，說明采用響應(yīng)面法所建立的回歸模型回歸效果較好，有99.01%的響應(yīng)值可用所建立的回歸方程進(jìn)行解釋。此外，通過比較回歸方程中一次項(xiàng)系數(shù)絕對(duì)值的大小，可看出3個(gè)因素對(duì)風(fēng)味蛋白酶酶解效果的主次順序依次為酶添加量（C）＞酶解溫度（A）＞酶解時(shí)間（B）。

表5 響應(yīng)面試驗(yàn)回歸模型方差分析

注:值是方差齊性檢查的結(jié)果；** 表示極顯著水平（＜0.01)；* 表示顯著水平（0.01＜＜0.05）

2.4.2 復(fù)合蛋白酶酶解牛骨肉蛋白浸提液的響應(yīng)面優(yōu)化

復(fù)合蛋白酶酶解溫度（A）、酶解時(shí)間（B）和酶添加量（C）3個(gè)因素響應(yīng)面中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見表6。響應(yīng)面試驗(yàn)回歸模型方差分析見表7。

表6 響應(yīng)面中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

表7 響應(yīng)面試驗(yàn)回歸模型方差分析

注:值是方差齊性檢查的結(jié)果；** 表示極顯著水平（＜0.01）；* 表示顯著水平（0.01＜＜0.05）

以酶解溫度（）、酶解時(shí)間（）和酶添加量（）為自變量，水解度為響應(yīng)值，對(duì)復(fù)合蛋白酶酶解試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行多元回歸分析，所建立的回歸方程為＝11.53-0.031＋0.19＋1.28- 0.042＋0.021＋0.12-0.822-0.302-0.372

（2）經(jīng)同樣方法分析，以上所建立的回歸模型回歸效果較好，能夠用于預(yù)測(cè)復(fù)合蛋白酶對(duì)牛骨肉蛋白提取液的酶解效果，3個(gè)因素對(duì)復(fù)合蛋白酶的酶解效果影響主次順序依次為酶添加量（）＞酶解時(shí)間（）＞酶解溫度（）。

2.4.3 工藝優(yōu)化及驗(yàn)證試驗(yàn)

分析回歸方程（1）和（2），得到風(fēng)味蛋白酶的最佳酶解條件為酶解溫度45℃、酶解時(shí)間4.3 h、酶添加量50 LAPU/g蛋白質(zhì)，在此條件下預(yù)測(cè)水解度可達(dá)到15.59%；復(fù)合蛋白酶的最佳酶解條件為酶解溫度45℃、酶解時(shí)間4.5 h、酶添加量15 000 U/g，在此條件下預(yù)測(cè)水解度可達(dá)到12.53%。通過3次驗(yàn)證試驗(yàn)，得到風(fēng)味蛋白酶酶解液水解度為15.88%，復(fù)合蛋白酶酶解液水解度為12.78%，與模型預(yù)測(cè)值吻合度達(dá)到98%，因此本試驗(yàn)所建立的回歸模型具有實(shí)際參考價(jià)值。酶解液中含有豐富的氨基酸、小分子肽，為肉類風(fēng)味物質(zhì)的形成提供前體物質(zhì)，可進(jìn)一步用于制備肉味香料[20-21]。

本試驗(yàn)僅研究風(fēng)味蛋白酶或復(fù)合蛋白酶單一酶的酶解條件，兩者結(jié)合起來(lái)是否效果會(huì)更好，還有待于進(jìn)一步研究。

3 結(jié)論

本研究以牛骨肉蛋白液為底物，添加風(fēng)味蛋白酶或復(fù)合蛋白酶對(duì)其進(jìn)行酶解。在單因素試驗(yàn)結(jié)果基礎(chǔ)上進(jìn)行3因素3水平響應(yīng)面分析試驗(yàn)，最終得到添加風(fēng)味蛋白酶的最佳酶解條件是酶解溫度45 ℃、酶解時(shí)間4.3 h、酶添加量50 LAPU/g蛋白質(zhì)，在此條件下水解度達(dá)到15.88%。添加復(fù)合蛋白酶的最佳酶解條件是酶解溫度45℃、酶解時(shí)間4.5 h、酶添加量15 000 U/g，在此條件下水解度達(dá)到12.78%。為后期進(jìn)行美拉德反應(yīng)制備肉味香料酶解方式的選擇提供理論依據(jù)和數(shù)據(jù)支持，進(jìn)而為副產(chǎn)物牛骨肉的深度開發(fā)提供新的利用途徑。

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責(zé)任編輯：張愛婷

Optimization of Hydrolysis Conditions of Bovine Bone Protein Extract by Response Surface Methodology

FAN Xiao-pan, QIU Hong-bo, MA Li-zhenCorresponding Author

（Tianjin Engineering and Technology Research Center of Agricultural Products Processing, College of Food Science and Biotechnology, Tianjin Agricultural University, Tianjin 300384, China）

In this study, bovine bone were chosen as raw material (2.15% of crude protein content). Study on the influence of technological condition of enzymolysis by two kinds of protease (flavourzyme and protamex). The research results showed that the optimal hydrolysis conditions of flavourzyme were as follows: temperature 45 ℃, hydrolysis time 4.3 h and the enzyme addition 50 LAPU/g protein. Under this condition, the degree of hydrolysis was 15.88%. The optimum conditions for protamex extraction were found to be hydrolysis at 45 ℃ for 4.5 h with an enzyme/substrate ratio of 1 500 U/g, the degree of hydrolysis under this conditions was 12.78%.

bovine bone; enzymatic hydrolysis; flavourzyme; protamex; degree of hydrolysis

1008-5394（2017）03-0073-06

TS251.94

A

2016-11-29

天津市農(nóng)業(yè)科技成果轉(zhuǎn)化與推廣項(xiàng)目“可食性牛羊骨素加工關(guān)鍵技術(shù)集成及工程化示范”（201604060）

樊曉盼（1993-），女，山西運(yùn)城人，碩士在讀，研究方向?yàn)閯?dòng)物源性食品安全與營(yíng)養(yǎng)學(xué)。E-mail：308925471@qq.com。

馬儷珍（1963-），女，山西運(yùn)城人，教授，博士，研究方向?yàn)槿馄房茖W(xué)與技術(shù)。E-mail：malizhen-6329@163.com。