王芳　岳朝敏　阮琴

摘要：以艾葉（Artemisia argyi）為原料，通過超聲波輔助提取得到葉綠素，經(jīng)皂化、酸化、鋅代等過程，制得葉綠素鋅鈉鹽，并對其穩(wěn)定性進(jìn)行了初探。結(jié)果表明，該產(chǎn)品的水溶性較好，具有較好的耐熱性，對氧化劑、還原劑不敏感，在pH為5～11的環(huán)境中均較穩(wěn)定，但在光照條件下穩(wěn)定性差。幾種常見的食品添加劑和一些金屬離子對葉綠素鋅鈉鹽的影響小，但Fe3+、Cu2+、Al3+、檸檬酸和維生素C對葉綠素鋅鈉鹽的穩(wěn)定性有較大影響。

關(guān)鍵詞：艾葉（Artemisia argyi）；葉綠素鋅鈉鹽；制備；穩(wěn)定性

中圖分類號：TS201.1 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：0439-8114（2017）20-3921-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2017.20.031

Abstract： Chlorophyll was extracted from Artemisia argyi with ultrasonic-assisted extraction. Sodium zinc chlorophyllin was prepared from the chlorophyll extracting through the processes of saponification， acidification and zinc substitution. Results showed that sodium zinc chlorophyllin has high water-solubility， good heat resistance at certain temperature， high resistance abilities to oxidants and reducers， and it is stable in the environments of pH 5～11. But it has poor stability under sunshine. And the food additives and metal-salts have little effect on the stability of sodium zinc chlorophyllin. However， it would be influenced by Fe3+，Cu2+，Al3+，citrate and vitamin C.

Key words： Artemisia argyi； sodium zinc chlorophyllin； preparation； stability

葉綠素是較早開發(fā)的一種天然的色素，其安全無毒，并具有抗氧化[1]、降血脂、降血糖等諸多功能[2]，但游離的葉綠素不穩(wěn)定，所以給其應(yīng)用帶來了困難[3]。如果將葉綠素制成葉綠素鋅鈉鹽，可增加穩(wěn)定性，并且能起到一定的補(bǔ)充鋅作用[4]。目前，葉綠素鋅鈉鹽廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、化妝品、飲料中，而且對癌癥的治療也有一定的作用[5]。

艾葉（Artemisia argyi）又名艾蒿、艾，為菊科蒿屬多年生草本植物[6]，在醫(yī)藥、食品、香料等行業(yè)都有使用[7]，主要成分有揮發(fā)油[8]、葉綠素、黃酮類化合物[9]等。雖然艾葉中含有豐富的葉綠素，但是其葉綠素的開發(fā)應(yīng)用尚未見報道，研究艾葉葉綠素鋅鈉鹽的制備工藝及其穩(wěn)定性，為艾葉進(jìn)一步開發(fā)應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

艾葉：采自浙江省金華市。

乙醇、氫氧化鈉、鹽酸、石油醚、硫酸鋅、氯化鈉、檸檬酸、過氧化氫等均為分析純。

1.2 儀器設(shè)備

UV-2550型紫外分光光度計；新T6型分光光度計；JY-92Ⅱ型超聲波細(xì)胞破碎儀；HWS28型恒溫水浴鍋等。

1.3 方法

1.3.1 工藝過程 將新鮮艾葉清洗干凈，剪碎，加入體積分?jǐn)?shù)95%乙醇溶液，超聲波處理一定時間，抽濾棄渣，濾液置于燒瓶中，加入5%NaOH調(diào)節(jié)pH至11，于65 ℃恒溫水浴加熱1 h。然后減壓蒸餾回收乙醇，濃縮液用同體積的石油醚萃取3次，得葉綠素皂化液，用0.1 mol/L的HCl調(diào)節(jié)溶液pH至2～3，而后不斷攪拌緩慢加入20%的ZnSO4溶液（料液比為1∶5），于75 ℃水浴加熱2 h。減壓抽濾，將所得的固體水洗3次，用5%NaOH溶液溶解沉淀，并于低于60 ℃條件下烘干，即得葉綠素鋅鈉鹽成品[10]。

1.3.2 超聲波有機(jī)溶劑提取葉綠素工藝的優(yōu)化 在前期試驗基礎(chǔ)上，選擇料液比、超聲時間、提取溫度和提取時間為考察因素，以葉綠素提取量作為考察指標(biāo)，進(jìn)行L9（34）的正交試驗（表1），優(yōu)化葉綠素提取的工藝。

1.3.3 葉綠素鋅鈉鹽的光譜特性 稱取葉綠素鋅鈉鹽0.1 g，蒸餾水溶解并定容100 mL，制得0.1%的水溶液，用紫外分光光度計在380～800 nm波長范圍內(nèi)進(jìn)行掃描。

1.3.4 葉綠素鋅鈉鹽的穩(wěn)定性研究 取50 mg葉綠素鋅鈉鹽，蒸餾水溶解并定溶于1 000 mL，制得0.005%的葉綠素鋅鈉鹽溶液，作為試驗應(yīng)用液。

1）溫度對葉綠素鋅鈉鹽的影響。每份取10 mL葉綠素鋅鈉鹽試驗應(yīng)用液密封于試管中，分別于4、30、50、70、95 ℃下放置4 h。每隔1 h測定溶液的吸光度，3次重復(fù)。

2）光照對葉綠素鋅鈉鹽穩(wěn)定性的影響。每份取10 mL葉綠素鋅鈉鹽試驗應(yīng)用液密封于試管中，分別放置于暗處和自然光下靜置8 h。每隔2 h測定溶液的吸光度，3次重復(fù)。

3）氧化劑、還原劑對葉綠素鋅鈉鹽穩(wěn)定性的影響。每份取10 mL葉綠素鋅鈉鹽試驗應(yīng)用液密封于試管中，分別加入2 mL不同濃度（0、0.5%、2%、6%、10%）的H2O2、Na2SO3溶液，在室溫下避光靜置1 h，測定其吸光度，3次重復(fù)。endprint

4）金屬離子對葉綠素鋅鈉鹽穩(wěn)定性的影響。每份取10 mL葉綠素鋅鈉鹽試驗應(yīng)用液密封于試管中，然后分別加入2 mL 0.1 mol/L含有不同金屬離子（Na+、Ca2+、K+、Cu2+、Al3+）溶液，同時對照加2 mL的蒸餾水，在室溫下避光靜置1 h，測定其吸光度，3次重復(fù)。

5）常用食品添加劑對葉綠素鋅鈉鹽穩(wěn)定性的影響。每份取10 mL葉綠素鋅鈉鹽試驗應(yīng)用液密封于試管中，分別加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.5%的維生素C和檸檬酸溶液，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%的氯化鈉、葡萄糖和蔗糖溶液各2 mL，在室溫下避光靜置1 h，測定其吸光度，3次重復(fù)。

6）pH對葉綠素鋅鈉鹽穩(wěn)定性的影響。每份取10 mL葉綠素鋅鈉鹽試驗應(yīng)用液密封于試管中，分別用0.1 mol/L HCl和NaOH調(diào)節(jié)配制成pH為3、5、7、9、11、13的葉綠素鋅鈉鹽溶液，室溫下避光靜置1 h，測定其吸光度，3次重復(fù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 超聲波有機(jī)溶劑提取葉綠素正交試驗結(jié)果

在前期試驗基礎(chǔ)上，進(jìn)行L9（34）的正交試驗，結(jié)果如表2所示。影響艾葉葉綠素提取因素中，其主次順序為料液比>提取溫度>超聲時間>提取時間，最終確定優(yōu)化條件為料液比1∶10，超聲功率50 W，超聲時間8 min，提取溫度65 ℃，提取時間20 min。將提取到的葉綠素溶液，按“1.3.1”工藝過程制備葉綠素鋅鈉鹽，20 g新鮮的艾葉制得葉綠素鋅鈉鹽0.266 g，得率為1.330%。

2.2 葉綠素鋅鈉鹽的特征光譜

從圖1可以看出，由艾葉制成的葉綠素鋅鈉鹽在380～800 nm波長范圍內(nèi)有2個吸收峰，分別是410 nm和656 nm，且最大吸收峰在410 nm，與賴海濤等[11]用茶葉制得的葉綠素鋅鈉鹽的特征吸收峰相似。因此，以最大吸收波長410 nm處測得的吸光度為參比，探討葉綠素鋅鈉鹽的穩(wěn)定性。

2.3 葉綠素鋅鈉鹽的穩(wěn)定性研究

2.3.1 溫度對葉綠素鋅鈉鹽穩(wěn)定性的影響 由圖2可知，葉綠素鋅鈉鹽溶液在70 ℃及以下溫度時表現(xiàn)均較穩(wěn)定，處理4 h吸光度下降不超過10%；溫度為95 ℃時，處理4 h后，葉綠素鋅鈉鹽溶液的吸光度顯著下降（P<0.05），比處理0 h的下降了42.9%。說明溫度在70 ℃以內(nèi)，葉綠素鋅鈉鹽的穩(wěn)定性相對較好，隨著溫度的進(jìn)一步升高，葉綠素鋅鈉鹽的穩(wěn)定性下降。

2.3.2 光照對葉綠素鋅鈉鹽穩(wěn)定性的影響 結(jié)果（圖3）表明，葉綠素鋅鈉鹽對光敏感，光照2 h，下降幅度就達(dá)86.7%，而在避光條件下，8 h僅下降了10.7%。這可能是光照加快了葉綠素鋅鈉鹽的分解[12]，所以在葉綠素鋅鈉鹽使用和貯存的過程中應(yīng)避免陽光直射。

2.3.3 氧化劑、還原劑對葉綠素鋅鈉鹽穩(wěn)定性的影響 由圖4可看出，經(jīng)不同濃度的Na2SO3和H2O2處理后，葉綠素鋅鈉鹽溶液的吸光度無顯著性變化（P>0.05）。由此可見，氧化劑和還原劑對葉綠素鋅鈉鹽的穩(wěn)定性影響較小。

2.3.4 部分金屬離子對葉綠素鋅鈉鹽穩(wěn)定性的影響 從圖5可以看出，與CK（對照組）相比，Na+、Ca2+和K+ 3種金屬離子的存在對葉綠素鋅鈉鹽溶液的吸光度并沒有顯著影響（P>0.05）。而添加Cu2+、Al3+的處理，葉綠素鋅鈉鹽的穩(wěn)定性下降，這說明葉綠素鋅鈉鹽溶液對Cu2+、Al3+金屬離子較敏感，加工貯存時應(yīng)注意避免與其接觸。

2.3.5 常用食品添加劑對葉綠素鋅鈉鹽穩(wěn)定性的影響 從圖6可以看出，相較對照組，加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.5%的檸檬酸和維生素C后，葉綠素鋅鈉鹽溶液的吸光度顯著下降（P<0.05）。而當(dāng)加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)2%的葡萄糖、蔗糖和氯化鈉溶液后，葉綠素鋅鈉鹽溶液的吸光度沒有明顯的變化。由此可知，葉綠素鋅鈉鹽溶液對檸檬酸和維生素C較敏感，使用時應(yīng)注意。而葡萄糖、蔗糖和氯化鈉對其沒有明顯影響。

2.3.6 pH對葉綠素鋅鈉鹽穩(wěn)定性的影響 結(jié)果（圖7）表明，在pH 5～11范圍內(nèi)，葉綠素鋅鈉鹽溶液的吸光度無顯著性變化（P>0.05）（與pH 7時的吸光度比較，下同）。但當(dāng)pH 3和pH 13時，樣品溶液吸光度顯著降低（P<0.01）。由此可知，葉綠素鋅鈉鹽在pH為5～11的環(huán)境中比較穩(wěn)定，在強(qiáng)酸和強(qiáng)堿的環(huán)境中穩(wěn)定性下降。

3 結(jié)論

1）艾葉葉綠素較適宜提取工藝為提取溶劑95%乙醇，料液比1∶10，超聲功率50 W，超聲時間8 min，提取溫度65 ℃，提取時間20 min。所得葉綠素溶液經(jīng)皂化、酸化、鋅代、水洗、5% NaOH溶液溶解、烘干，得葉綠素鋅鈉鹽，得率達(dá)1.330%，產(chǎn)品顏色為墨綠色、且具有金屬光澤、水溶性好。

2）艾葉葉綠素鋅鈉鹽對光較敏感，在70 ℃及以下溫度穩(wěn)定性較好，氧化劑和還原劑對其穩(wěn)定性影響很小。Na+、Ca2+和K+對葉綠素鋅鈉鹽穩(wěn)定性無明顯影響，而Cu2+、Al3+對其有不良影響。在pH 5～11的環(huán)境中均較穩(wěn)定。常見食品添加劑對葉綠素鋅鈉鹽穩(wěn)定性影響不大，但是要避同檸檬酸和維生素C共用。

4 討論

本試驗中艾葉葉綠素鋅鈉鹽具有金屬光澤，水溶性好等特性，這與郭瑞華等[13]對柏樹葉葉綠素鋅鈉鹽的研究一致。植物色素的穩(wěn)定性會受光照、溫度、氧化劑、還原劑等因素的影響，艾葉葉綠素鋅鈉鹽具有光不穩(wěn)定性，熱穩(wěn)定性，強(qiáng)酸（pH 3）強(qiáng)堿（pH 13）時性質(zhì)不穩(wěn)定，抗氧化還原能力較好，這與丁林等[14]對石榴葉葉綠素鋅鈉鹽穩(wěn)定性的研究以及丁潔等[15]對葉綠素鋅鈉鹽的理化性質(zhì)及其應(yīng)用研究的結(jié)果相似。檸檬酸和維生素C對葉綠素鋅鈉鹽的穩(wěn)定性影響較大，這可能是在酸性的環(huán)境中鋅離子被氫離子取代，形成脫金屬的卟啉結(jié)構(gòu)[16]，導(dǎo)致穩(wěn)定性下降。

參考文獻(xiàn)：

[1] LAN M B，ZHANG Y H，ZHENG Y，et al. Antioxidant and immunomodulatory activities of polysaccharides from mox（Artemisia argyi） leaf[J].Food Science and Biotechnology，2010，19（6）：1463-1469.endprint

[2] 董 雁，章汝平，張夏紅，等.冬青葉葉綠素提取工藝研究[J].閩西職業(yè)技術(shù)學(xué)院學(xué)報，2010，12（3）：103-106.

[3] 孟慶廷.葉綠素提取方法及穩(wěn)定性研究進(jìn)展[J].煤炭與化工，2009，32（3）：2-3.

[4] 孟慶廷，劉冬梅，韓玲利.萵筍葉綠素鋅鈉鹽的制取及穩(wěn)定性研究[J].現(xiàn)代食品科技，2009，25（5）：553-555.

[5] 黃森科.水浮蓮葉制取葉綠素鋅鈉鹽的新方法[J].閩南師范大學(xué)學(xué)報（自然版），2002，15（3）：95-97.

[6] TORRELL M，CERBAH M，SILJAK-YAKOVLEV S，et al. Molecular cytogenetics of the genus Artemisia（Asteraceae，Anthemideae）：Fluorochrome banding and fluorescence in situ hybridization. I. Subgenus Seriphidium and related taxa[J].Plant Systematics and Evolution，2003，239（1）：141-153.

[7] LEE M Y，DOH E J，PARK C H，et al. Development of SCAR marker for discrimination of Artemisia princeps and A. argyi from other Artemisia herbs[J].Biological & Pharmaceutical Bulletin，2006，29（4）：629-633.

[8] BARNEY J N，HAY A G，WESTON L A. Isolation and characterization of allelopathic volatiles from mugwort（Artemisia vulgaris）[J].Journal of Chemical Ecology，2005，31：247-265.

[9] 何義雁，張 珺，朱香燕，等.響應(yīng)面法優(yōu)化微波輔助提取艾草黃酮工藝[J].食品研究與開發(fā)，2015，36（4）：68-73.

[10] 林燕如，黃俊生，蔡燕佳.羅勒葉葉綠素鋅鈉鹽的制備及其穩(wěn)定性研究[J].中國調(diào)味品，2012，37（11）：111-114.

[11] 賴海濤，黃萬欽.茶葉葉綠素鋅鈉鹽的制備及其穩(wěn)定性研究[J].茶葉科學(xué)，2006，26（1）：59-64.

[12] 占汝真，武 健，付成鈺，等.由松針制取三種葉綠素鈉鹽及其穩(wěn)定性的研究[J].食品工業(yè)科技，2014，35（6）：107-110.

[13] 郭瑞華，翁慶迎，蔡燕佳.柏樹葉葉綠素鋅鈉鹽的制備及其穩(wěn)定性的研究[J].廣州化工，2011，39（17）：40-42.

[14] 丁 林，張艷橋.石榴葉葉綠素鋅鈉的制備及其穩(wěn)定性研究[J].沈陽化工大學(xué)學(xué)報，2010，24（4）：330-334.

[15] 于 潔，石 華.葉綠素鋅鈉鹽的理化性質(zhì)及應(yīng)用研究[J].食品工業(yè)科技，2004，25（3）：105-108.

[16] 張懷斌，李懷祥，馬麗英.葉綠素鋅鈉鹽的制備及其穩(wěn)定性[J].化學(xué)研究，2012，23（5）：1-4.endprint