,, ,,孫仁, , ,*,

(1.廣西壯族自治區(qū)海洋研究所,廣西海洋生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,廣西北海 536000; 2.廣西壯族自治區(qū)分析測(cè)試研究中心,廣西南寧 530022; 3.廣西科學(xué)院廣西紅樹(shù)林研究中心,廣西紅樹(shù)林保護(hù)與利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,廣西北海 536000)

方格星蟲提取物的 抗氧化活性及成分分析

徐艷1,謝一興2,鄒杰1,李蕾蘚3,孫仁杰3,王欣3,張琴1,*,聶振平1

(1.廣西壯族自治區(qū)海洋研究所,廣西海洋生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,廣西北海 536000; 2.廣西壯族自治區(qū)分析測(cè)試研究中心,廣西南寧 530022; 3.廣西科學(xué)院廣西紅樹(shù)林研究中心,廣西紅樹(shù)林保護(hù)與利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,廣西北海 536000)

目的:對(duì)方格星蟲的抗氧化活性進(jìn)行研究。方法:方格星蟲勻漿后于室溫下用乙醇提取,然后用乙酸乙酯和水萃取,得到不同極性的提取物,分別對(duì)提取物進(jìn)行抗氧化檢測(cè),同時(shí)與合成的抗氧化劑抗壞血酸(VC)進(jìn)行對(duì)照,并對(duì)有抗氧化活性的提取物進(jìn)行化學(xué)成分分析。結(jié)果:實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明水層提取物具有較好的抗氧化活性,乙酸乙酯層和乙醇提取物的抗氧化活性較弱;從乙酸乙酯層中分離鑒定出59個(gè)化合物,不飽和脂肪酸和甾體為主要成分;方格星蟲水層具有多種成分,包括蛋白質(zhì)、總糖、牛磺酸和SOD等。結(jié)論:不飽和脂肪酸、甾體、多肽、?；撬岷蚐OD對(duì)方格星蟲的抗氧化活性可能有一定的貢獻(xiàn)。

方格星蟲,抗氧化活性,氣質(zhì)聯(lián)用,化學(xué)成分

方格星蟲(SipunculusnudusLinnaeus)又稱光裸星蟲,俗稱沙蟲、土蒜、沙腸子、泥蒜等,隸屬于星蟲動(dòng)物門(Sipuncula)方格星蟲科(Sipunculida)方格星蟲屬(Sipunculus),在我國(guó)沿海均有分布,多數(shù)棲息在熱帶和亞熱帶淺海泥沙內(nèi)和珊瑚間,以廣西北部灣海區(qū)資源量最為豐富[1-2]。方格星蟲不僅味道鮮美、營(yíng)養(yǎng)豐富,藥用價(jià)值也較高,有“冬蟲夏草”之稱[3-4]。

目前,國(guó)內(nèi)外主要對(duì)其進(jìn)行繁殖生物學(xué)、食用功效和藥用價(jià)值的研究[5-7],方格星蟲活性物質(zhì)和生理活性研究表明,方格星蟲中的主要活性成分為蛋白質(zhì)、多糖、礦物質(zhì)元素等,具有抗氧化、提高免疫力、抗輻射、抗病毒活性等多種生物學(xué)功能,方格星蟲多糖和多肽的抗氧化活性已經(jīng)有相關(guān)報(bào)道[8-10],但是關(guān)于方格星蟲提取物的抗氧化活性研究還未見(jiàn)報(bào)道。本文,為綜合開(kāi)發(fā)方格星蟲的藥用和保健價(jià)值提供一定實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)和理論數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1材料與儀器

方格星蟲 2015年10月購(gòu)自廣西北海沙灘;DPPH(2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl) 美國(guó)Sigma公司;柱層析硅膠及薄層層析硅膠板 青島海洋化工廠;三羥基甲基氨基甲烷(Tris)、鐵氰酸鉀、抗壞血酸(VC)、過(guò)氧化氫、鄰苯三酚、鐵氰化鉀、三氯乙酸、三氯化鐵、蒽酮、茚三酮 國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭?無(wú)水乙醇、乙酸乙酯 為國(guó)產(chǎn)分析純，購(gòu)自成都市科龍化工試劑廠。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 方格星蟲乙醇浸膏和各極性層的制備 鮮活方格星蟲(14.5 kg)洗凈,于組織搗碎機(jī)中絞碎,經(jīng)95%的乙醇室溫浸泡提取6次,每次30 min,過(guò)濾,合并提取液,減壓濃縮后得乙醇浸膏。浸膏用水分散后,用等體積的乙酸乙酯萃取,減壓濃縮后得到乙酸乙酯相(12.7 g)和水相(234.9 g)。稱取乙醇浸膏、乙酸乙酯相和水相各1.000 g,置于具塞錐形瓶中,加入100 mL無(wú)水乙醇,經(jīng)60 ℃水浴后,置于超聲頻率40 kHz、功率200 W超聲波清洗器內(nèi)超聲,直至溶解,然后稀釋成20、40、60、80、100 μg/mL的濃度梯度備用。

1.2.2 抗氧化活性的測(cè)定

1.2.2.1 還原力的測(cè)定 參照鐵氰化鉀法進(jìn)行[11]。取不同濃度的樣品0.5 mL,分別加入1.25 mL PBS(0.2 mol/L,pH6.6)和質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%的 K3Fe(CN)6混勻,于50 ℃反應(yīng)20 min后快速冷卻,加入1.25 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%的三氯乙酸,混勻,于3000 r/min離心10 min,取上清液2.5 mL,加蒸餾水2.0 mL,及1 mg/mL的FeCl3溶液0.5 mL,混勻,10 min后于1 cm比色皿中700 nm處測(cè)定吸光度。以VC為陽(yáng)性對(duì)照,每個(gè)測(cè)定對(duì)象平行測(cè)定3次,取平均值。

1.2.2.2 DPPH·清除能力的測(cè)定 取不同濃度的樣品2 mL,加入2 mL DPPH乙醇溶液(0.14 mmol/L),混勻后在室溫下避光反應(yīng)20 min,于517 nm處測(cè)定吸光度A1;以無(wú)水乙醇代替樣品為空白體系,其吸光度為A0;以無(wú)水乙醇代替DPPH自由基作為對(duì)照體系,其吸光度為A2。同時(shí)以VC為對(duì)照,按以下公式計(jì)算清除率[11]。

式(1)

1.2.2.3 羥自由基(·OH)清除率的測(cè)定 向25 mL容量瓶中依次加入7.5 mmol/mL鄰二氮菲溶液1.0 mL,PBS(pH7.4)5.0 mL,7.5 mmol/mL FeSO4溶液 1.0 mL,一定量的抗氧化劑溶液(損傷管及未損傷不加提取液),體積分?jǐn)?shù)為 0.1% H2O21.0 mL(未損傷管不加),以蒸餾水定容,暗處放置 60 min,在 536 nm 處測(cè)吸光度。以上每加一次試劑均需混勻,同時(shí)以VC為對(duì)照[12]。羥自由基清除率計(jì)算按下列公式:

樁西潛山帶位于沾化凹陷東部，在沾化、樁東、埕北3凹陷的交匯處，勘探面積220km2，構(gòu)造上處于埕島、長(zhǎng)堤、埕東三大斷裂體系的應(yīng)力交匯處，斷裂系統(tǒng)極為發(fā)育，地質(zhì)構(gòu)造格局復(fù)雜多樣。

式(2)

1.2.3 方格星蟲抗氧化化學(xué)成分分析

1.2.3.1 乙酸乙酯層化學(xué)成分分析 本文應(yīng)用硅膠柱層析,石油醚丙酮(1∶0～0∶1)洗脫,對(duì)方格星蟲乙酸乙酯層進(jìn)行分離純化,經(jīng)薄層硅膠板檢測(cè)和合并后,得到四個(gè)餾分,分別對(duì)其進(jìn)行 GC-MS 分析。

用氫氧化鉀-甲醇甲酯化法對(duì)四個(gè)餾分分別進(jìn)行脂肪酸甲酯化,加入正己烷進(jìn)行脂肪酸甲酯的萃取,靜置分層后,取上層有機(jī)相(正己烷)適當(dāng)稀釋,用針筒式微孔濾膜過(guò)濾器過(guò)濾后進(jìn)行氣相色譜-質(zhì)譜儀進(jìn)樣分析。

氣相色譜條件:色譜柱為VF-5MS石英毛細(xì)柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm);MS條件:電子轟擊(EI)離子源,電子能量70 eV,操作系統(tǒng)Xcalibur,譜庫(kù)NIST 02;分析參數(shù)為:初始溫度50 ℃,保持2 min,程序升溫至130 ℃,速度5 ℃/min,再以25 ℃/min升至300 ℃,保持10 min。

1.2.3.2 水層基本成分分析 蛋白質(zhì)的測(cè)定按照標(biāo)準(zhǔn):GB 5009.5-2010;脂肪的測(cè)定按照標(biāo)準(zhǔn):GB/T 14772-2008;水分的測(cè)定按照標(biāo)準(zhǔn):GB 5009.3-2010;灰分的測(cè)定按照標(biāo)準(zhǔn):GB 5009.4-2010;氨基酸含量的測(cè)定:GB/T 5009.124-2003;總糖含量的測(cè)定:GB/T 5009.8;SOD含量的測(cè)定按照標(biāo)準(zhǔn):GB/T 5009.171-2003;牛磺酸含量的測(cè)定按照標(biāo)準(zhǔn):GB/T 5009.169-2003。

2 結(jié)果與分析

2.1方格星蟲的還原能力

還原力能檢驗(yàn)樣品是否為一個(gè)良好的電子供應(yīng)者,一般情況下,樣品的還原能力與其抗氧化活性之間有顯著的正相關(guān),還原力的高低可以反映抗氧化能力的強(qiáng)弱[14]。由圖1可知,在40～100 μg/mL的濃度范圍內(nèi),方格星蟲各個(gè)提取物的還原力都不如VC的強(qiáng);在 20～40 μg/mL的濃度范圍內(nèi),方格星蟲水層的還原力比VC的強(qiáng),具有一定的還原能力,而方格星蟲乙醇層和乙酸乙酯層的還原力都不如VC的強(qiáng),在20 μg/mL 時(shí),方格星蟲水層的還原力是VC一倍多,而乙醇層和乙酸乙酯層的還原力與VC的相當(dāng)。

圖1 方格星蟲提取物的還原能力Fig.1 Total antioxidant activity of the extracts from S. nudus

2.2方格星蟲對(duì)DPPH·的清除作用

DPPH·是一種很穩(wěn)定的以氮為中心的自由基,其孤對(duì)電子在 517 nm 波長(zhǎng)附近有強(qiáng)吸收,若有自由基清除劑存在時(shí),孤對(duì)電子被配對(duì),吸收消失或減弱,因此通過(guò)測(cè)定吸收減弱的程度,可以評(píng)價(jià)受試物的抗氧化活性[13]。由圖2可知,在本實(shí)驗(yàn)濃度范圍內(nèi),方格星蟲水層對(duì) DPPH·的清除作用隨著濃度的增加而增大,且優(yōu)于陽(yáng)性對(duì)照 VC,而乙酸乙酯層和乙醇層的清除作用不如VC的強(qiáng)。在60 μg/mL 時(shí),VC和水層對(duì) DPPH·的清除率分別為20.25%和50.70%,乙酸乙酯層和乙醇的清除率分別為10.84%和3.93%,水層的清除效果是VC兩倍多,而乙酸乙酯層的清除率只有VC的一半左右,乙醇層的清除作用不明顯。

圖2 方格星蟲提取物對(duì)DPPH·的清除作用Fig.2 DPPH radical scavenging effects of the extracts from S. nudus

表1 方格星蟲乙酸乙酯相的成分分析Table 1 Chemical compositions of the ethyl acetate fraction of S. nudus

續(xù)表

圖3 方格星蟲提取物對(duì)·OH 的清除作用Fig.3 OH radical scavenging effects of the extracts from S. nudus

2.3方格星蟲對(duì)·OH的清除作用

·OH是體內(nèi)活性最強(qiáng)的自由基,是在生命活動(dòng)的氧化代謝過(guò)程中產(chǎn)生的,可導(dǎo)致大量疾病發(fā)生,因此對(duì)·OH清除率的檢測(cè)具有重要意義[11]。由圖3可知,在本實(shí)驗(yàn)濃度范圍內(nèi),方格星蟲乙酸乙酯層和水層對(duì)·OH的清除能力隨著濃度增大而增強(qiáng),且優(yōu)于陽(yáng)性對(duì)照VC,表明方格星蟲乙酸乙酯層和水層對(duì)·OH有一定的清除能力。在60 μg/mL 時(shí),VC和水層對(duì)·OH的清除率分別為7.53%和89.25%,乙酸乙酯層和乙醇層的清除率分別為27.42%和4.83%,水層的清除效果是VC十倍多,乙酸乙酯層的清除率是VC的三倍多,乙醇層的清除作用不明顯。

2.4方格星蟲抗氧化化學(xué)成分分析

2.4.1 乙酸乙酯層化學(xué)成分分析 為了探討方格星蟲乙酸乙酯相的化學(xué)組成,本文分別對(duì)四個(gè)餾分進(jìn)行了GC-MS分析,得到方格星蟲乙酸乙酯相四個(gè)餾分的總離子流譜,對(duì)各峰通過(guò)Xcalibur工作站NIST標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)譜圖庫(kù)進(jìn)行檢索,共鑒定出59個(gè)化合物(見(jiàn)表1),包括長(zhǎng)鏈烷烴類、飽和脂肪酸、不飽和脂肪酸和甾醇類化合物及其衍生物,以脂肪酸和甾醇類化合物為主,包括4個(gè)膽甾醇、1個(gè)麥角甾醇、1個(gè)菜籽甾醇,還有大量的二十碳五烯酸(EPA)、花生四烯酸(AA)、亞麻酸(LNA)等有生理功能的不飽和脂肪酸。

方格星蟲乙酸乙酯相四個(gè)餾分的化學(xué)成分有些是重復(fù)的,對(duì)各餾分的化合物及其含量進(jìn)行分析后,得到以下結(jié)果:餾分一的化學(xué)成分以不飽和脂肪酸為主,相對(duì)含量最高的化合物為:9,12-硬脂酸甲酯,相對(duì)含量為 62.44%;餾分三和餾分四的主要化學(xué)成分都為膽甾醇,且相對(duì)含量最高的化合物都為:膽甾-5-烯-3-醇(3β),相對(duì)含量分別為 75.90%和 66.10%;餾分二的化學(xué)成分種類比較多,且相對(duì)含量比較分散,相對(duì)含量最高的化合物為:14-甲基十五酸甲酯,相對(duì)含量為 15.89%,其次為:油酸甲酯,相對(duì)含量為 11.52%,第三為:肉豆蔻酸甲酯,相對(duì)含量為 10.19%,第四個(gè)為:硬脂酸甲酯,相對(duì)含量為 8.71%,第五個(gè)為:11-二十烯酸甲酯,相對(duì)含量為 7.70%,最后為:花生四烯酸甲酯,相對(duì)含量為 6.61%,這六個(gè)化合物共占到餾分二相對(duì)總量的 60.62%。由此可見(jiàn),方格星蟲乙酸乙酯相的化學(xué)成分以甾醇和不飽和脂肪酸為主。

表2 方格星蟲水層的化學(xué)成分Table 2 Chemical composition of the water fraction of S. nudu

2.4.2 水層化學(xué)成分分析 為了探討方格星蟲水層的化學(xué)組成,本文按照國(guó)標(biāo)法對(duì)其進(jìn)行了化學(xué)成分分析,結(jié)果見(jiàn)表2。

方格星蟲水層具有良好的抗氧化活性,但它是一種混合物,基本成分分析結(jié)果顯示,它除了含有蛋白質(zhì)、脂肪、總糖、多肽和氨基酸等成分外,還含有多種抗氧化活性成分,如:?；撬?、SOD 等,方格星蟲水層的主要成分為蛋白質(zhì),占總質(zhì)量的 47.6%,多肽占 23.3%,總糖的含量較低,占總質(zhì)量的 0.8%,而哪種成分是主要的抗氧化活性成分,還有待于進(jìn)一步研究。

3 結(jié)論

方格星蟲的抗氧化物質(zhì)主要存在于極性部位,乙酸乙酯相和乙醇提取物的抗氧化活性不明顯,而水層的體外抗氧化活性明顯,能明顯清除體系中已產(chǎn)生的DPPH自由基和羥自由基,并在本實(shí)驗(yàn)濃度范圍內(nèi),具有濃度依賴性。

化學(xué)成分分析結(jié)果顯示,方格星蟲乙酸乙酯層以甾醇類和不飽和脂肪酸類化合物為主,而水層具有多種成分,除了蛋白質(zhì)、脂肪、多肽、總糖和氨基酸,還有?；撬岷蚐OD等。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道,不飽和脂肪酸[13-14]、海洋動(dòng)物甾醇[15]、方格星蟲多肽[8]、?；撬醄16-17]和 SOD[18]都具有良好的抗氧化活性,是公認(rèn)的天然抗氧化劑,已有大量專利文獻(xiàn)報(bào)道,這些物質(zhì)都可能是方格星蟲抗氧化功效的物質(zhì)基礎(chǔ),而哪種物質(zhì)是主要的抗氧化活性成分還有待于進(jìn)一步研究。

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AntioxidationactivityandcompositionanalysisofSipunculusnudusextracts

XUYan1,XIEYi-xing2,ZOUJie1,LILei-xian3,SUNRen-jie3,WANGXin3,ZHANGQin1,*,NIEZhen-ping1

(1.Guangxi Institute of Oceanology,Guangxi Key Laboratory of Marine Biotechnology,Beihai 536000,China; 2.Analysis and Testing Center of Guangxi Province,Nanning 530022,China; 3.Guangxi Key Laboratory of Mangrove Conservation and Utilization,Guangxi Mangrove Research Center of Guangxi Academy of Sciences,Beihai 536000,China)

Objective:To study the antioxidant activity ofSipunculusnudusLinnaeus from the South China Seainvitro. Methods:The homogenate ofS.nuduswas extracted by ethanol,ethyl acetate,and water in order to get fractions with different polarities,and then the antioxidant activity of the extracts was tested,compared with one synthetic antioxidants ascorbic acid. The chemical components of extracts with antioxidant activity were analyzed. Results:The results showed that the water fraction exhibited high antioxidant activity,the ethyl acetate fraction and ethanol extract exhibited low antioxidant activity. 59 compounds were found in the ethyl acetate fraction,which was mainly composed of unsaturated fatty acids and steroids. The water fraction had many components,including protein,total sugar,taurine,SOD and so on. Conclusion:Unsaturated fatty acids,steroids,polypeptide,taurine,SOD might have contributed to the antioxidant activity ofS.nudus.

SipunculusnudusLinnaeus;antioxidant activity;gas chromatography-mass spectrometry;chemical components

2017-04-18

徐艷(1981-) ，女，碩士，副研究員，研究方向：海洋活性物質(zhì)研究與開(kāi)發(fā)，E-mail：xuyango528@163.com。

*

張琴(1982-)，女，博士，研究員，研究方向：水產(chǎn)動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)與精深加工，E-mail：zhangqin821220@163.com。

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31402304)；廣西自然科學(xué)基金項(xiàng)目 (2015GXNSFBB139005)；廣西科學(xué)院基本科研業(yè)務(wù)費(fèi) (15YJ22HYS16)。

TS201.2

A

1002-0306(2017)21-0007-05

10.13386/j.issn1002-0306.2017.21.002