劉芳潔， 汪亞群， 唐 晶， 陳惠珍， 賴淑萍， 蘇 暢， 李 娟， 許多榮

(中山大學附屬第一醫(yī)院血液科， 廣東 廣州 510080)

EP2A體外可促進人CD34+細胞歸巢而不能促進其增殖*

劉芳潔， 汪亞群， 唐 晶， 陳惠珍， 賴淑萍， 蘇 暢， 李 娟， 許多榮△

(中山大學附屬第一醫(yī)院血液科， 廣東 廣州 510080)

目的探討前列腺素E2受體2激動劑(EP2A)在體外對人CD34+細胞的歸巢與增殖作用。方法收集健康供者經(jīng)粒細胞集落刺激因子動員后的外周血，免疫磁珠法分選出人CD34+細胞；同時收集健康供者動員前骨髓液，分離單個核細胞，并行骨髓間充質(zhì)干細胞(BMMSC)培養(yǎng)。人CD34+細胞和BMMSC經(jīng)前列腺素E2(陽性對照)、DMSO(陰性對照)、EP2A和EP2A+前列腺素E2受體2拮抗劑(EP2AA)處理后，對人CD34+細胞用CCK-8法檢測細胞活力，集落形成實驗檢測集落形成數(shù)目，流式細胞術(shù)檢測G2/M期細胞比例，Western blot檢測細胞中survivin、β-catenin及CXC趨化因子受體4(CXCR4)的蛋白表達；ELISA法檢測BMMSC中基質(zhì)細胞衍生因子1α(SDF-1α)的含量。結(jié)果EP2A組與陰性對照組相比，人CD34+細胞在細胞活力、集落形成數(shù)目、G2/M期比例及survivin和β-catenin蛋白表達方面均無明顯差別。但EP2A組人CD34+細胞CXCR4及BMMSC SDF-1α的表達均明顯高于陰性對照組。結(jié)論EP2A體外可促進人CD34+細胞歸巢但不能促進其增殖。

前列腺素E2； 前列腺素E2受體2激動劑； 細胞增殖； 歸巢

異基因造血干細胞移植(allogeneic hematopoietic stem cell transplantation，Allo-HSCT)是目前能夠治愈惡性血液病的一種重要手段，促使造血干細胞(hematopoietic stem cell，HSC)增殖和歸巢是使得HSC植入成功的關(guān)鍵[1]。目前關(guān)于促進HSC歸巢的機制已經(jīng)研究得比較透徹，相關(guān)研究明確指出促進HSC歸巢的關(guān)鍵在于CXC趨化因子受體4(CXC chemokine receptor 4，CXCR4)/基質(zhì)細胞衍生因子1α(stromal cell-derived factor-1α，SDF-1α)信號軸[2-4]。Goichberg 等[5]報道前列腺素E2(prostaglandin E2，PGE2)可以通過上調(diào)小鼠HSC表面的CXCR4表達，增加其對SDF-1α的趨化作用，進而達到促進HSC歸巢的作用，而對于促進HSC增殖的具體機制尚未完全明了。本課題組前期研究已經(jīng)證實，PGE2可促進人CD34+細胞體外增殖和歸巢，這一點同早期國外的研究保持一致[6]；同時也證實了人CD34+細胞均能表達PGE2的4個特異性受體，即PGE2受體1～4(prostaglandin E2receptors 1～4, EP1～EP4)，但以EP2和EP4受體為主。本課題組還發(fā)現(xiàn)，EP1和EP3受體在人CD34+細胞中不起作用，主要是通過EP2和EP4受體發(fā)揮作用。PGE2受體2激動劑(EP2agonist， EP2A)是否能通過活化EP2受體同時發(fā)揮促進人CD34+細胞歸巢與增殖的作用仍需進一步探討。本研究旨在探討EP2A是否能同時促進人CD34+細胞體外歸巢和增殖，從而為研發(fā)促進HSC成功植入的藥物提供理論依據(jù)。

材 料 和 方 法

1試劑

經(jīng)健康供者同意，收集本院2015年8月～2016年8月期間健康供者經(jīng)粒細胞集落刺激因子動員后的外周血采集產(chǎn)物及動員前骨髓液；PGE2和PGE2受體2拮抗劑(EP2antagonist， EP2AA)購于Cayman；EP2A由Ono Pharmaceutical Co. Ltd饋贈；人淋巴細胞分離液(Ficoll-Paque)購于MP Biomedicals；無血清培養(yǎng)基StemSpan TM SFEM購于Stem Cell Technologies；CD34+免疫磁珠試劑盒購于MiltenyiBiotec；甲基纖維素購于Sigma；重組人干細胞因子(recombinant human stem cell factor， rhSCF)、rhFlt3、rhTPO和rhIL-3購于Peprotech；CCK-8試劑盒購于日本同仁公司；DMEM/F12培養(yǎng)基購于Thermo Fisher；抗survivin和β-catenin抗體購于CST；抗CXCR4抗體購于Santa-cruze；SDF-1α ELISA試劑盒購于R&D。

2主要方法

2.1人CD34+細胞磁珠分選及流式鑒定 具體見參考文獻[7]。

2.2骨髓間充質(zhì)干細胞(bone marrow mesenchymal stem cells， BMMSC)培養(yǎng)和鑒定 用人淋巴細胞分離液分離骨髓單個核細胞，用DMEM/F12+10% FBS 重懸，接種至10 cm皿中貼壁培養(yǎng)，約4～5 d后換液，繼續(xù)培養(yǎng)，待細胞匯合至90%時，胰酶消化傳代。取第3代生長狀態(tài)良好的細胞，以流式細胞術(shù)檢測表面抗原CD73、CD90、CD105、CD14、CD34和CD45的表達。

2.3人CD34+細胞和BMMSC的藥物處理 將分選后的人CD34+細胞及生長狀態(tài)良好的第3代BMMSC用培養(yǎng)基重懸至5×108/L；人CD34+細胞培養(yǎng)基中加入細胞因子rhSCF、rhFlt3、rhTPO(終濃度為100 μg/L)和rhIL-3(終濃度為20 μg/L)，將其分成4組：PGE2(陽性對照)組、DMSO(陰性對照)組、EP2A(0.1 μmol/L)組和EP2A+EP2AA(濃度同EP2A)組，然后放入37 ℃、5% CO2恒溫培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24 h。收集細胞用于后續(xù)實驗。

2.4CCK8法檢測藥物處理后人CD34+細胞的細胞活力 將收集的細胞以每孔100 μL接種于96孔板，EP2A終濃度分別設(shè)置0、0.1、0.5、1、5和10 μmol/L，每組設(shè)3個平行孔，冰上培養(yǎng)2 h后，繼續(xù)在37 ℃、5% CO2恒溫培養(yǎng)箱中分別培養(yǎng)22 h、46 h、70 h和94 h，每孔加入10 μL CCK-8試劑，輕輕混勻，置于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h，在450 nm波長處用酶標儀測吸光度值(A值)。另設(shè)立4個組： PGE2(終濃度1 μmol/L)組、DMSO(<0.1%，陰性對照)組、EP2A(1 μmol/L)組和EP2A+EP2AA(濃度同EP2A)組，冰上培養(yǎng)2 h，培養(yǎng)箱中培養(yǎng)22 h，其余操作同上。細胞活力(%)=A實驗組/A空白組×100%。

2.5集落形成實驗 具體見參考文獻[7]，2周后倒置顯微鏡下識別和計數(shù)集落形成。

2.6流式細胞術(shù)測定細胞周期 取方法2.3中收集的細胞離心棄上清，PBS洗滌后70%冰乙醇-20 ℃固定過夜，PBS洗滌后加入RNase-A和碘化丙啶避光染色30 min，流式細胞儀分析細胞周期分布，具體見參考文獻[7-8]。

2.7人CD34+細胞中survivin、β-catenin和CXCR4蛋白的表達情況 取方法2.3中收集的細胞，提取蛋白，具體見參考文獻[7]。

2.8ELISA法檢測BMMSC分泌的SDF-1α水平 按ELISA試劑盒操作說明檢測各組細胞分泌的SDF-1α水平。

3統(tǒng)計學處理

所有數(shù)據(jù)分析采用統(tǒng)計軟件SPSS 24.0。數(shù)據(jù)方差齊采用單因素方差分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結(jié) 果

1人CD34+細胞的分選與鑒定

人外周血采集產(chǎn)物經(jīng)CD34+磁珠分選后，用流式細胞儀鑒定分選細胞的純度，結(jié)果顯示CD34+細胞純度達90%以上。

2BMMSC的培養(yǎng)及鑒定

對分離的骨髓單個核細胞進行培養(yǎng)，1周后于倒置顯微鏡下可觀察到呈漩渦狀生長的長梭形、紡錘形和多角形細胞，后通過換液和傳代對其進行純化培養(yǎng)。流式細胞術(shù)檢測發(fā)現(xiàn)，細胞表面高表達CD73、CD90和CD105抗原，而不表達CD14、CD34和CD45抗原，說明這群細胞是BMMSC。

3EP2A對人CD34+細胞的時間和濃度效應(yīng)

采用CCK-8法檢測不同濃度的EP2A作用不同時間后CD34+細胞活力的變化，結(jié)果顯示，相同培養(yǎng)時間下，EP2A濃度在0～10 μmol/L之間時，人CD34+細胞活力沒有明顯變化；而相同EP2A濃度下，在培養(yǎng)時間為24～96 h之間，EP2A對人CD34+細胞活力的作用也無明顯變化。另外，PGE2組的細胞活力是陰性對照組的1.40倍(P<0.05)，EP2A組和陰性對照組間無明顯差異。這說明EP2A對促進人CD34+細胞生長無明顯作用，見圖1。

Figure 1. The viability of human CD34+cells detected by CCK-8 assay. A: theAvalue of human CD34+cells treated with different doses of EP2A for different time; B: the viability of human CD34+cells using the control group as 100%.Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group.

圖1CCK-8法檢測人CD34+細胞的活力變化

4EP2A對人CD34+細胞集落形成影響

造血祖細胞由造血干細胞分化而來，它的增殖能力需要依靠造血干細胞增殖來補充，因此集落形成實驗可以通過反映造血祖細胞的增殖能力，間接反映造血干細胞的分化能力。本研究采用集落形成實驗檢測人CD34+細胞的增殖能力，經(jīng)處理后的人CD34+細胞用甲基纖維素半固體培養(yǎng)基培養(yǎng)2周，倒置顯微鏡下識別和計數(shù)各系集落，結(jié)果示EP2A對各系集落形成與陰性對照組的差異無統(tǒng)計學顯著性，見圖2。

5EP2A對人CD34+細胞的細胞周期分布的影響

采用流式細胞術(shù)檢測各處理組人CD34+細胞，結(jié)果發(fā)現(xiàn)PGE2組處于G0/G1期的細胞比例為(79.97±1.71)%，較陰性對照組(85.37±2.25)%下降，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，EP2A組處于G0/G1期的細胞比例(85.83±2.48)%，較陰性對照組無明顯差別；各藥物處理組處于S期的細胞比例與陰性對照組比較差異無統(tǒng)計學顯著性；PGE2組處于G2/M期的細胞比例為(11.80±0.87)%，較陰性對照組(6.67±0.71)%明顯升高，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.01)，EP2A組處于G2/M期的細胞比例較陰性對照組無明顯差異。由此可知，EP2A不能促進人CD34+細胞由靜止期進入細胞周期，見圖3、表1。

6EP2A對人CD34+細胞中survivin、β-catenin及CXCR4蛋白表達的影響

采用Western blot方法檢測經(jīng)處理后人CD34+細胞中survivin、β-catenin及CXCR4蛋白的表達變化情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)經(jīng)EP2A干預(yù)后，survivin和β-catenin蛋白表達量與陰性對照組比較差異無統(tǒng)計學顯著性，而CXCR4蛋白的表達量是陰性對照組的1.65倍(P<0.05)，且能被相應(yīng)拮抗劑所抑制(P<0.05)。以上結(jié)果顯示，EP2A能促進趨化因子受體CXCR4蛋白表達，不能促進survivin、β-catenin 蛋白表達，見圖4。

Figure 2. The changes of colony-forming units (CFU) in the human CD34+cells with different treatments (×10). Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group.

圖2不同藥物處理對各集落形成的影響

7EP2A促進BMMSC分泌趨化因子SDF-1α

采用ELISA法檢測經(jīng)處理后BMMSC中SDF-1α的蛋白分泌水平。結(jié)果顯示EP2A組中BMMSC分泌的SDF-1α 蛋白量是陰性對照組的1.51倍，加入相應(yīng)拮抗劑后，蛋白表達明顯下降，見圖5。

討 論

早在20世紀Fehér 等[9]就首次報道了PGE2能增加小鼠骨髓細胞的集落形成，其后North 等[10]發(fā)現(xiàn)，runx1/cmyb蛋白在經(jīng)PGE2處理的斑馬魚胚胎造血祖細胞中表達增加。目前的研究均證實PGE2在促進移植后的HSC歸巢和防止其植入功能不良方面具有巨大的臨床應(yīng)用前景[11]。本課題組前期研究已證實PGE2具有促進人CD34+增殖和歸巢的作用，本研究擬進一步明確EP2A是否能通過EP2受體既發(fā)揮促進人CD34+歸巢作用又發(fā)揮促進人CD34+增殖作用。

經(jīng)EP2A處理后，隨著作用時間延長和藥物濃度的升高，人CD34+細胞活力并沒有明顯增加，說明EP2A對人CD34+細胞生長作用不明顯。正常生理情況下，人HSC大部分處于靜止期，本研究檢測，經(jīng)EP2A處理后，人CD34+細胞處于G0/G1期的比例為(85.83±2.48)%，與陰性對照組相比差異無統(tǒng)計學顯著性；處于G2/M期的細胞比例亦無明顯變化，這表明PGE2不通過EP2受體促進HSC進入細胞周期。Baba等[12]和Fukuda 等[13]研究表明PGE2可以通過刺激抗凋亡蛋白survivin的表達來促進人CD34+進入細胞周期。本研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)EP2A處理后，人CD34+細胞中survivin在蛋白表達較陰性對照組無明顯增加，因此無法實現(xiàn)促使HSC由靜止期進入細胞周期。β-catenin是調(diào)控細胞增殖的Wnt經(jīng)典信號途徑的經(jīng)典因子，EP2A組中β-catenin的蛋白表達較陰性對照組沒有明顯變化。以上結(jié)果均表明EP2A對促進HSC增殖沒有明顯作用。

Figure 3. The changes of the cell cycle distribution in the human CD34+cells with different treatments.

圖3不同藥物處理后CD34+細胞周期的分布情況

表1經(jīng)不同方式處理后細胞具體周期分布情況

Table 1. The cell cycle distribution of human CD34+cells with different treatments (Mean±SD.n=3)

Group G0/G1SG2/MControl85．37±2．257．96±1．666．67±0．71PGE279．97±1．71?8．23±0．9711．80±0．87?EP2A85．83±2．487．70±1．236．47±1．90EP2A+EP2AA86．03±3．207．50±1．236．47±2．39

*P<0.05vscontrol group.

Figure 4. The protein expression of survivin (A), β-catenin (B) and CXCR4 (C) in the human CD34+cells with different treatments. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group；#P<0.05vsEP2A group.

圖4不同藥物處理后人CD34+細胞中survivin、β-catenin和CXCR4的表達情況

Figure 5. The secretion of SDF-1α in the BMMSCs with different treatments detected by ELISA. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group.

圖5不同藥物處理后BMMSC中SDF-1α的分泌情況

CXCR4/SDF-1α信號軸在HSC歸巢過程中起著關(guān)鍵作用。趨化因子受體CXCR4表達于HSC表面。本實驗觀察到，與PGE2效應(yīng)相似，經(jīng)EP2A處理后人CD34+表面蛋白CXCR4表達增加，而當加入其對應(yīng)的受體拮抗劑EP2AA后，CXCR4的表達水平明顯下降?；|(zhì)細胞衍生因子SDF-1α主要由骨髓基質(zhì)細胞合成并分泌，為HSC的體內(nèi)遷移提供定向動力。當BMMSC經(jīng)PGE2和EP2A處理后，其合成與分泌的SDF-1α明顯升高，當EP2A組加入其對應(yīng)的受體拮抗劑EP2AA后，SDF-1α的合成與分泌明顯減少。

綜上所述，我們認為EP2A可促進人CD34+體外歸巢，不能促進其增殖，即PGE2不能通過EP2受體促進人CD34+細胞體外增殖。而對于PGE2促進增殖的具體機制以及通過哪一條信號途徑促進人CD34+細胞增殖，本課題組正在進一步研究。

[1] Servais S, Beguin Y, Baron F. Emerging drugs for prevention of graft failure after allogeneic hematopoietic stem cell transplantation[J]. Expert Opin Emerg Drugs, 2013,18(2):173-192.

[2] Kim M, Kim DI, Kim EK, et al. CXCR4 overexpression in human adipose tissue-derived stem cells improves homing and engraftment in an animal limb ischemia model[J]. Cell Transplant, 2017, 26(2):191-204.

[3] Larochelle A, Gillette JM, Desmond R, et al. Bone marrow homing and engraftment of human hematopoietic stem and progenitor cells is mediated by a polarized membrane domain[J]. Blood, 2012, 119(8):1848-1855.

[4] Asri A, Sabour J, Atashi A, et al. Homing in hemato-poietic stem cells: focus on regulatory role of CXCR7 on SDF1a/CXCR4 axis[J]. EXCLI J, 2016, 15:134-143.

[5] Goichberg P， Kalinkovich A， Borodovsky N， et al. cAMP-induced PKCζ activation increases functional CXCR4 expression on human CD34+hematopoietic progenitors[J]. Blood, 2006, 107(3):870-879.

[6] Durand EM, Zon LI. Newly emerging roles for prostaglandin E2regulation of hematopoiesis and hematopoietic stem cell engraftment[J]. Curr Opin Hematol, 2010, 17(4):308-312.

[7] 賴淑萍， 戚永磊， 許多榮. 前列腺素E2體外可促進人CD34+細胞增殖[J]. 中山大學學報： 醫(yī)學科學版, 2013， 34(1):22-27.

[8] 秦瑞英， 夏永華， 任艷芳， 等. AEG-1表達下調(diào)對人宮頸癌細胞細胞周期和侵襲能力的影響及其機制[J]. 中國病理生理雜志, 2013， 29(6):1020-1024.

[9] Fehér I， Gidáli J. Prostaglandin E2as stimulator of hematopoietic stem cell proliferation[J]. Nature,1974, 247(442):550-551.

[10] North TE, Goessling W, Walkley CR, et al. Prostaglandin E2regulates vertebrate haematopoietic stem cell homeostasis[J]. Nature, 2007, 447(7147):1007-1011.

[11] Hoggatt J, Pelus LM. Eicosanoid regulation of hematopoiesis and hematopoietic stem and progenitor trafficking[J]. Leukemia, 2010, 24(12):1993-2002.

[12] Baba HA, Wohlschlaeger J, Schmitz KJ, et al. Survivin is upregulated during liver regeneration in rats and humans and is associated with hepatocyte proliferation[J]. Liver Int, 2009, 29(4):585-592.

[13] Fukuda S, Foster RG, Porter SB, et al. The antiapoptosis protein survivin is associated with cell cycle entry of normal cord blood CD34+cells and modulates cell cycle and proliferation of mouse hematopoietic progenitor cells[J]. Blood, 2002, 100(7):2463-2471.

(責任編輯： 陳妙玲， 羅 森)

EP2A promotes human CD34+cell homing in vitro but not proliferation

LIU Fang-jie, WANG Ya-qun, TANG Jing, CHEN Hui-zhen, LAI Shu-ping, SU Chang, LI Juan, XU Duo-rong

(DepartmentofHematology,TheFirstAffiliatedHospital,SunYat-SenUniversity,Guangzhou510080,China.E-mail:xudr@hotmail.com)

AIM: To investigate the role of prostaglandin E2receptor 2 agonist (EP2A) in proliferation and homing of human CD34+cells.METHODSBone marrow fluid and peripheral blood containing stem cells were collected from healthy donors mobilized by granulocyte colony-stimulating factor in our department. Human CD34+cells were isolated by the method of magnetic-activated cell sorting microbeads. Bone marrow mononuclear cells were isolated by Ficoll-Paque centrifugation, and the bone marrow mesenchymal stem cells (BMMSC) were cultured with L-DMEM. Human CD34+cells and BMMSC were divided into 4 groups, and treated with PGE2(as positive control), DMSO (as negative control), EP2A and EP2A+prostaglandin E2receptor 2 antagonist (EP2AA)， respectively. After exposed to the reagents, human CD34+cell viability was measured by CCK-8 assay, the number of colonies was evaluated by colony-formation assay, the cell cycle distribution was analyzed by flow cytometry, and the protein expression of survivin, β-catenin and CXC chemokine receptor 4 (CXCR4) was detrmined by Western blot. Moreover, the concentration of stromal cell-derived factor-1α (SDF-1α) in the BMMSC was detected by ELISA.RESULTSThe cell viability and the colony number of human CD34+cells in EP2A group were not higher than those in negative control group. Furthermore, the proportion of human CD34+cells treated with EP2A in G2/M phase was not elevated compared with negative control group. The protein expression of survivin and β-catenin did not up-regulated in human CD34+cells exposed to EP2A, but the protein expression of CXCR4 in human CD34+cells and the concentration of SDF-1α in BMMSC were elevated.CONCLUSIONEP2A promotes human CD34+cell hominginvitrobut not proliferation.

Prostaglandin E2; Prostaglandin E2receptor 2 agonist; Cell proliferation; Homing

1000- 4718(2017)11- 2026- 06

2017- 04- 28

2017- 07- 17

國家自然科學基金資助項目(N0. 81370663)

△通訊作者 Tel: 020-87755766-8911； E-mail: xudr@hotmail.com

R551.3； R363

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2017.11.017