林文秋　肖熙鷗　張紅娜　劉勝輝　孫偉生　吳青松　李運合

摘 要 以菠蘿品種‘巴厘的吸芽或腋芽為外植體，從滅菌消毒、愈傷組織和芽的誘導、繼代增殖、生根培養(yǎng)和練苗移栽等方面，闡述了菠蘿組織培養(yǎng)技術及存在問題。

關鍵詞 菠蘿 ；‘巴厘 ；離體培養(yǎng)

中圖分類號 S668.3 文獻標識碼 A Doi：10.12008/j.issn.1009-2196.2017.10.010

In Vitro Culture of Yellow Mauritius Pineapple

（Ananas comosus L. Merr.）

LIN Wenqiu XIAO Xi'ou ZHANG Hongna

LIU Shenghui SUN Weisheng WU Qingsong LI Yunhe

（1 South Subtropical Crop Research Institute， CATAS， Zhanjiang， Guangdong 524091；

2 Hainan Provincial Engineering Research Center for Pineapple Germplasm Innovation

and Utilization， Zhanjiang， Guangdong 524091）

Abstract Suckers and axillary buds of yellow Mauritius pineapple （Ananas comosus cv Yellow Mauritius） were used as explants for tissue culture， and the tissue culture and its arising problems in sterilization， callus and shoot induction， subculture for proliferation， rooting， hardening off and transplanting were described.

Keywords pineapple ； yellow Mauritius pineapple ； in vitro culture

菠蘿（Ananas comosus L.）屬于鳳梨科鳳梨屬植物，是熱帶和亞熱帶地區(qū)的著名水果，也是世界重要的水果之一。我國是菠蘿十大主產(chǎn)國之一，其產(chǎn)區(qū)主要分布在廣東、海南、廣西、福建、云南等省份[1]。生產(chǎn)上主要通過從菠蘿植株上長出的各種新芽（吸芽、冠芽、裔芽和塊莖芽）進行扦插繁殖，存在繁殖系數(shù)低[2]，生長速度慢，種苗生長不一致，容易攜帶病菌等問題[3]，不利于生產(chǎn)。而組織培養(yǎng)技術具有繁殖系數(shù)高，苗期一致等特點，有助于菠蘿品種的推廣與更新?lián)Q代。自aghion和Beauchesue[4]于1960以冠芽為外植體進行離體繁殖獲得成功后，研究人員對不同品種的菠蘿組織培養(yǎng)進行研究，建立了不同品種的再生體系[5-7]。隨后，對影響菠蘿組織培養(yǎng)因素的研究發(fā)現(xiàn)菠蘿再生受到多種因素的調(diào)控：（1）基因型是影響菠蘿再生的重要因素之一，不同品種再生率不同[8]；（2）外植體類型影響菠蘿再生率[9-10]；（3）植物生長調(diào)節(jié)劑對菠蘿再生有著重要的作用。研究表明，適當添加激素有助于菠蘿高效再生體系的建立。其中，6-BA在菠蘿外植體芽的增殖和分化過程中起著關鍵作用[11-12]；（4）培養(yǎng)時間和繼代次數(shù)對愈傷組織和芽的分化有影響。同一繼代次數(shù)的不同培養(yǎng)時間芽的增殖數(shù)量不同[12]。此外，不同培養(yǎng)方式愈傷組織的誘導和芽的分化率存在顯著差異，Ayenew等[13]研究發(fā)現(xiàn)，菠蘿叢生芽在瞬時浸沒式生物反應器下進行培養(yǎng)，其再生率高達95%。

‘巴厘菠蘿自1953年引進我國后，因其汁多、味甜、產(chǎn)量穩(wěn)定、田間易管理等特點，成為我國主栽品種之一，約占全國菠蘿種植面積的80%，主要分布在廣東徐聞地區(qū)[14]。為獲得整齊一致的‘巴厘菠蘿脫毒苗，滿足生產(chǎn)需求，降低種植成本，保存創(chuàng)新菠蘿種質(zhì)資源和今后的開發(fā)利用，筆者通過對該品種的外植體誘導、繼代增殖、生根培養(yǎng)及組培苗移栽等技術進行研究，建立了‘巴厘菠蘿的高效再生體系。

1 ‘巴厘菠蘿組織培養(yǎng)技術

1.1 取材及消毒

1.1.1 取材

供試材料為生長健壯、無病蟲害的 ‘巴厘品種的吸芽或腋芽，采自中國熱帶農(nóng)業(yè)科學院南亞熱帶作物研究所種質(zhì)資源圃。

1.1.2 消毒

在晴天采下生長健壯的吸芽或腋芽，從基部剝除衰老葉片后，用自來水將芽沖洗干凈，在吸芽生長點上方約5 cm處切斷所有葉片，將芽和著生在吸芽上的白色葉基放入2% NaClO消毒10 min，無菌水沖洗3次，再放入0.1% HgCl消毒8 min，無菌水沖洗3次。

1.2 組織培養(yǎng)

1.2.1 直接再生途徑

用滅好菌的手術刀，將消毒好的外植體縱切成2～3塊，接種于MS+2.0 mg/L 6-BA+2.5 mg/L NAA的固體培養(yǎng)基上進行啟動培養(yǎng)，培養(yǎng)20～30 d后，從葉腋處萌發(fā)出不定芽。將不定芽從基部切下，轉(zhuǎn)接于MS+2.0 mg/L 6-BA+1.0 mg/L NAA培養(yǎng)基上進行繼代增殖，繼代周期為25～30 d，增殖系數(shù)約為3（圖1）。

1.2.2 愈傷組織、芽的誘導和增殖

將菠蘿品種‘巴厘吸芽的葉基接種在MS+3 mg/L 6-BA+2 mg/L NAA培養(yǎng)基上，誘導30 d后，從切口處產(chǎn)生結瘤狀愈傷組織，誘導率約為60%。不同培養(yǎng)時間愈傷組織鮮重質(zhì)量增加率結果表明，培養(yǎng)20 d后，鮮重增加率達到最大值，隨后下降，因此，愈傷組織最佳繼代周期為20 d （圖2）。將愈傷組織轉(zhuǎn)接于MS+2.0 mg/L 6-BA+1.0 mg/L NAA的分化培養(yǎng)基上，26℃，1 500 lx的光照條件下進行培養(yǎng)，20 d后部分愈傷組織的球形節(jié)狀表面出現(xiàn)小綠點，然后小綠點伸長長大，形成叢生芽。將叢生芽切成單株，轉(zhuǎn)移到分化培養(yǎng)基上進行繼代培養(yǎng)，芽逐漸長高，30 d后形成再生植株。繼代周期為25～30 d（圖1）。endprint

1.2.3 誘導生根

將獲得的組培苗切成單株轉(zhuǎn)接至培養(yǎng)基（MS+ 2.0 mg/L 6-BA+1.0 mg/L NAA）中，培養(yǎng)25～30 d。當不定芽長至株高2 cm左右、有3～5片葉時，將其沿基部切下，接到生根培養(yǎng)基上誘導生根，生根培養(yǎng)基為MS+1.0 mg/L NAA+0.5 mg/L IBA，培養(yǎng)條件同繼代培養(yǎng)一致。培養(yǎng)15 d后小苗基部開始長根30 d后，長出10條左右較粗的根，生根率可達90%～100%（圖1）。

1.2.4 練苗移栽

為了提高組培苗的移栽成活率，在移栽前需進行練苗。當小苗有3～5條1 cm以上的不定根時，逐步開蓋練苗3～5 d，取出小苗，將根部培養(yǎng)基洗去，晾干，移到透氣性和保濕性良好的泥炭土中，澆定植的水，保持濕潤，遮蔭1～2周后長出新根和新芽。移栽成活率可達95%（圖1）。

2 存在問題及建議

在生產(chǎn)上，傳統(tǒng)的菠蘿繁殖方法是通過母體抽生的各類芽（冠芽、吸芽、裔芽）進行無性繁殖，存在繁殖系數(shù)低，種苗一致性差，易攜帶母體的病蟲害，易發(fā)生變異，導致種質(zhì)的退化等問題。此外，通過無性繁殖既制約了優(yōu)良品種的推廣和應用，也不利于品種的調(diào)整和改良。而利用組織培養(yǎng)技術可以獲得大量脫毒且生產(chǎn)性狀一致的種苗，滿足生產(chǎn)需求，為進行品種的改良和更換提供技術支撐。研究人員通過對不同菠蘿品種組織培養(yǎng)技術的研究，雖然建立了不同品種的再生體系[15-19]，但都出現(xiàn)不同程度的植株變異，變異率約為0.031%～34%，阻礙了菠蘿組培苗工廠化的進程[20-26]。因此，在菠蘿組織培養(yǎng)過程中，如何減少或者避免體細胞無性系變異的發(fā)生，降低組織培養(yǎng)的成本，有利于推進菠蘿工廠化育苗和品種的更新?lián)Q代，加快菠蘿產(chǎn)業(yè)化發(fā)展進程。

參考文獻

[1] 石偉琦，孫偉生，習金根，等. 我國菠蘿產(chǎn)業(yè)現(xiàn)狀與發(fā)展對策[J]. 廣東農(nóng)業(yè)科學，2011，38（3）：181-186.

[2] 鄭加協(xié)，李華東，甘勇輝. 蜜寶菠蘿組織培養(yǎng)及低成本快繁技術研究[J]. 果樹學報，2005，22（1）：27-30.

[3] 符運柳，徐 立，李志英. 金菠蘿種苗組織培養(yǎng)技術[J]. 現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技，2016（1）：121-122.

[4] Aghion D， Beauchesne G. The use of the sterile tissue culture technique to obtain pineapple clones[J]. Fruits Doutre Mer， 1960（15）： 464-466.

[5] Zuraida A R， Shahnadz A H N， Harteeni A， et al. A novel approach for rapid micropropagation of maspine pineapple （Ananas comosus L.） shoots using liquid shake culture system[J]. African Journal of Biotechnology， 2011， 10（19）： 3 859-3 866.

[6] Acheampong S， Galyuon I K A， Asare A T. Effects of sterilization protocols， benzylaminopurine and type of explants on growth initiation of pineapple [Ananas comosus （L.） Merr.] cultures[J]. Journal of Basic & Applied Sciences， 2016， 1（3）： 50-65.

[7] 何業(yè)華，羅 吉，吳會桃，等. 菠蘿葉基愈傷組織誘導體細胞胚[J]. 中國果業(yè)信息，2007，24（3）：59-63.

[8] De Wald M G， Moore G A， Sherman W B， et al. Production of pineapple in vitro. Plant Cell Reports， 1988（7）： 535-537.

[9] 吳昭平，盧麗芬，沈雪玉. 菠蘿雜交種子雜交苗的組織培養(yǎng)[J]. 植物生理學報，1984（6）：40.

[10] Souza B M， Molfetta-Machado J B， Freschi L， et al. Axillary bud development in pineapple nodal segments correlates with changes on cell cycle gene expression， hormone level， and sucrose and glutamate contents[J]. In Vitro Cellular & Developmental Biology-Plant， 2010， 46（3）： 281-288.

[11] Hamad A M， Taha R M. The effect of different hormones and incubation periods on in vitro proliferation of pineapple （Ananas comosus L.） Merr cv. smooth cayenne） shoot-tip culture[J]. Pakistan Journal of Biological Sciences Pjbs， 2008， 11（3）： 386-391.

[12] Al-Saif A M， Hossain A B M S， Taha R M. Effects of benzylaminopurine and naphthalene acetic acid on proliferation and shoot growth of pineapple （ananas comosus L. merr） in vitro[J]. African Journal of Biotechnology， 2011， 10（27）： 5 291-5 295.endprint

[13] Ayenew B， Tadesse T， Gebremariam E， et al. Efficient use of Temporary Immersion Bioreactor （TIB） on pineapple （Ananas comosus L.） multiplication and rooting ability[J]. Journal of Microbiology Biotechnology & Food Sciences， 2013， 2（4）： 2 456-2 465.

[14] 董定超，李玉萍，梁偉紅，等. 中國菠蘿產(chǎn)業(yè)發(fā)展現(xiàn)狀[J]. 熱帶農(nóng)業(yè)工程，2009，33（4）：13-17.

[15] Sripaoraya S， Marchant R， Power J B， et al. Plant regeneration somatic embryogenesis and organogenesis in commercial pineapple（Ananas comosus L.） [J]. In Vitro Cellular & Developmental Biology-Plant， 2003， 39（5）： 450-454.

[16] Danso K E， Ayeh K O， Oduro V， et al. Effect of 6Benzylaminopurine and α-naphthalene acetic acid on in vitro production of MD2 pineapple planting materials[J]. World Applied Sciences Journal， 2008， 3 （4）： 614-619.

[17] Roostika I， Mariska I， Khumaida N， et al. The use of picloram on somatic embryogenesis regeneration of， pineapple[J]. 2011（11）： 23-24.

[18] Scherer R F， Fraga H P D F， Klabunde G F， et al. Global DNA methylation levels during the development of nodule cluster cultures and assessment of genetic fidelity of in vitro regenerated pineapple plants （ Ananas comosus var. comosus）[J]. Journal of Plant Growth Regulation， 2015， 34（3）： 677-683.

[19] Farahani F. Micropropagation and growth of in vitro pineapple（ananas comosus L.Merr） in Iran[J]. Plant Archives， 2014， 14（1）： 337-341.

[20] Wakasa K， Koga Y， Kudo M. Differentiation from in vitro culture of Ananas comosus[J]. Japanese Journal of Breeding， 2008， 28（2）： 113-121.

[21] 徐舜全，葛華生，張振基，等. 菠蘿組織培養(yǎng)再分化植株的變異[J]. 廣東農(nóng)業(yè)科學，1991（3）：26-29.

[22] 黃德貴，郭建輝. 剝粒菠蘿組織培養(yǎng)快速繁育種苗的研究[J]. 福建熱作科技，1993（z1）：1-10.

[23] Das R K， Bhowmik G. Some somaclonal variants in pineapple [Ananas comosus （L.） Merr.] plants obtained from different propagation techniques[J]. Inter J of Trop A gric， 1998， 15（14）： 95-100.

[24] 劉 巖，鐘 云，孟祥春，等. “粵脆”菠蘿吸芽組織培養(yǎng)苗變異性調(diào)查[J]. 中國南方果樹，2006，35（1）：38-38.

[25] Pérez G， Mbogholi A， Sagarra F， et al. Lorenzo. Morphological and physiological characterization of two new pineapple somaclones derived from in vitro culture[J]. In Vitro Cell. Dev. Biol.—Plant， 2011（47）： 428-433.

[26] Roostika I， Khumaida N， Ardie S W. RAPD analysis to detect somaclonal variation of pineapple in vitro cultures during micropropagation. Biotropia[J]. 2015， 2（22）： 109-119.endprint