董曉娜++徐佩玲++陳培++杜麗敏

摘 要 通過探索冬鳳蘭的組培技術(shù)，為冬鳳蘭的保護(hù)和工廠化生產(chǎn)提供技術(shù)支撐。以冬鳳蘭蒴果為原材料，通過不同激素對比，篩選適宜萌芽培養(yǎng)基，并開展了冬鳳蘭增殖擴繁、生根壯苗、移栽馴化等一系列研究。結(jié)果表明：在培養(yǎng)基MS+6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.5 mg/L+CM 15%上，萌發(fā)時間最早，萌芽率較高；在改良VW培養(yǎng)基上芽分化效果較MS培養(yǎng)基好，芽分化率高，生長勢好；在生根培養(yǎng)基VW+IBA 0.5 mg/L+NAA 1.0 mg/L+卡拉膠10 g/L+活性炭0.4 g/L上，生根率達(dá)100%；冬鳳蘭后期需要采用630或650 mL的組培瓶。

關(guān)鍵詞 冬鳳蘭 ；VW培養(yǎng)基 ；組織培養(yǎng) ；快速繁殖

中圖分類號 S682.31 文獻(xiàn)標(biāo)識碼 A Doi：10.12008/j.issn.1009-2196.2017.10.012

Tissue Culture and Rapid Propagation of Cymbidium dayanum

DONG Xiaona XU Peiling CHEN Pei DU Limin

（Forestry Research Institute of Hainan Province， Haikou， Hainan 571100）

Abstract Tissue culture was conducted to provide technical support to conservation and mass production of Cymbidium dayanum. Capsules of C. dayanum were used as material and cultured for plant regeneration. Different hormones were tried in the MS mediums to select a suitable germination medium. The germinated capsules were then cultured for proliferation， rooting， formation of strong rooted plantlets and transfer. The results showed that the capsule germinated the earliest with the highest germination rate when cultured in the MS+6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.5 mg/L+CM 15% medium， that the bud differentiation was higher in the improved VW medium than in the MS， with higher growth vigor， that the rooting rate was 100% when the plantlets were cultured in the rooting medium VW+IBA 0.5 mg/L+NAA 1.0 mg/L+carrageenan10 g/L+0.4 g/L， and that the rooted plantlets were then transferred into tissue culture bottles with the bottle size of 630/650 mL.

Keywords Cymbidium dayanum ； VW medium ； tissue culture ； rapid propagation

冬鳳蘭（Cymbidium dayanum Rchb. f.）為附生蘭，生于海拔300～1 600 m的疏林中樹上或沿溪谷旁巖石壁上。海南主要產(chǎn)地為陵水、瓊中、白沙等地。冬鳳蘭總狀花序具5～9朵花；花葶側(cè)生，下垂或外彎；萼片和花瓣白色至奶油黃色，中央有1條粟褐色縱帶（從基部到上部3/4處），或偶見整個瓣片充滿淡棗紅色，唇瓣栗色，但褶片和中央裂片為白色；冬鳳蘭花期為8～12月份[1]。冬鳳蘭花期持久，株型優(yōu)美，具有極大的觀賞價值。羅遠(yuǎn)華等[2]采用灼燒法對冬鳳蘭蒴果進(jìn)行滅菌處理，認(rèn)為此法不用殺菌劑且操作簡便，是冬鳳蘭種子理想的滅菌方法。林泋君[3]以澳大利亞進(jìn)口的冬鳳蘭花梗中部為外植體進(jìn)行試管繁殖。目前針對冬鳳蘭的研究相對較少。本研究通過常規(guī)升汞消毒的方法處理蒴果，將種子無菌播種于MS培養(yǎng)基，通過不同激素誘導(dǎo)出原球莖或芽后，采用改良VW和MS 2種培養(yǎng)基進(jìn)行原球莖或芽的分化培養(yǎng)，并以改良VW培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基開展擴繁、生根培養(yǎng)研究，探索冬鳳蘭的組織培養(yǎng)技術(shù)，為其工廠化生產(chǎn)提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

冬鳳蘭的蒴果來源于海南省林業(yè)科學(xué)研究所野生蘭花種質(zhì)資源圃內(nèi)。試驗在海南省林業(yè)科學(xué)研究所生物技術(shù)研究室進(jìn)行。以八九成熟的自交蒴果為供試材料，從蒴果中收集種子作為外植體進(jìn)行種子的無菌播種。

1.2 方法

1.2.1 材料處理

取八九成熟的尚未裂開的蒴果為外植體；在超凈工作臺上，切除蒴果的果梗，用75%酒精棉球擦去表面的臟物后，將其浸泡在75%酒精中30 s，然后用無菌水沖洗2～3次后，再用0.1%升汞溶液消毒15 min，并不時振蕩，最后用無菌水沖洗5～6次，每次5 min；將消毒好的蒴果放于無菌接種盤中，用消毒刀將蒴果切開后即可播種。

1.2.2 種子萌發(fā)培養(yǎng)

以MS為種子萌發(fā)的基本培養(yǎng)基，分別添加6-BA（0.5、1.0 mg/L）+NAA 0.5 mg/L組合，并添加白糖30 g/L、卡拉膠10 g/L，CM 15%，具體見表1，pH 5.7。endprint

1.2.3 原球莖增殖

誘導(dǎo)出原球莖或芽后，為在短時間內(nèi)獲得大量組培材料，本研究采用液體振蕩的方式。增值培養(yǎng)基為改良VW培養(yǎng)基，添加6-BA 1.0 mg/L，并附加白糖30 g/L，活性碳0.4 g/L，pH 5.7。增殖率采用稱量法進(jìn)行統(tǒng)計，增殖率=（接入原球莖振蕩培養(yǎng)20 d后組培瓶重-接入原球莖初組培瓶重）×100%。

1.2.4 原球莖分化

分別采用MS和改良VW 兩種基本培養(yǎng)基，添加6-BA 1.0 mg/L、NAA 0.5 mg/L，并附加白糖30 g/L、卡拉膠10 g/L、活性炭0.4 g/L，調(diào)節(jié)pH為5.7，對原球莖進(jìn)行分化培養(yǎng)。每處理接種10瓶，3個重復(fù)，培養(yǎng)40 d后統(tǒng)計原球莖的分化率。原球莖分化率=（分化出莖葉的原球莖數(shù)/接種原球莖數(shù)）×100%。

1.2.5 生根培養(yǎng)及移栽

將分化出莖葉的原球莖切去單芽后接種于壯苗生根培養(yǎng)基VW+IBA 0.5 mg/L+NAA 1.0 mg/L+卡拉膠10 g/L+活性炭0.4 g/L中進(jìn)行生根誘導(dǎo)。

后期將組培苗移入630 或650 mL的組培瓶中，待苗高10～11 cm、葉3～5片、根數(shù)3～6時即可移栽。移栽前首先要將組培瓶移入蘭花棚中不開蓋煉苗15～30 d后，再開蓋煉苗至少3 d；煉苗后將苗取出，洗凈根上的培養(yǎng)基，用多菌靈溶液浸泡消毒并晾干，移栽入組培盤內(nèi)。

1.2.6 培養(yǎng)方式及培養(yǎng)條件

采用固體培養(yǎng)基培養(yǎng)的方式，早期以220 mL的組培瓶為培養(yǎng)容器，每瓶培養(yǎng)基用量為30～40 mL；后期采用630或650 mL的組培瓶為培養(yǎng)容器，每瓶培養(yǎng)基用量為100 mL左右，pH值5.7。除種子無菌播種時需要暗室培養(yǎng)外，其余培養(yǎng)條件基本一致。培養(yǎng)溫度為（26±2）℃，以日光燈為光源，每天光照時間為12 h（早上8點至晚上8點），光照強度為1 500～2 000 lx。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同培養(yǎng)基激素組合對種子萌發(fā)情況的影響

將消毒好的種子分別播種在1～4號誘導(dǎo)培養(yǎng)基上（表1），觀察種子萌發(fā)情況。結(jié)果表明，冬鳳蘭種子無菌播種大約3～4個月后陸續(xù)有芽點出現(xiàn)，隨著培養(yǎng)時間的延長球狀凸起不斷伸長，形成原球莖或芽（圖1-A、圖1-B）。從表1可看出，采用不同培養(yǎng)基配方，種子的萌芽時間略有不同。當(dāng)6-BA濃度為1.0 mg/L時，萌發(fā)時間相對0.5 mg/L早，添加CM后萌發(fā)時間略有縮短。試驗結(jié)果表明，6-BA對原球莖芽的誘導(dǎo)起主導(dǎo)作用，而且在添加了CM的培養(yǎng)基上萌發(fā)時間會縮短。

2.2 原球莖的增殖培養(yǎng)

冬鳳蘭的增殖培養(yǎng)采用液體振蕩的方式。在100 r/min的轉(zhuǎn)速下振蕩培養(yǎng)20 d，切除芽點后的原球莖能快速增殖，增殖率采用稱量法進(jìn)行統(tǒng)計，結(jié)果顯示增殖率為132.00%。

2.3 不同培養(yǎng)基對冬鳳蘭原球莖分化培養(yǎng)的影響

將原球莖接種在MS、VW 2種培養(yǎng)基上進(jìn)行分化培養(yǎng)，芽分化效果略有不同（表2）。在VW培養(yǎng)基上芽分化速度較MS培養(yǎng)基快，且芽分化率高，生長勢好；此外，在VW培養(yǎng)基上時，冬鳳蘭的根也開始分化。

2.4 壯苗生根培養(yǎng)

冬鳳蘭易生根，在分化培養(yǎng)基中，冬鳳蘭即有根生成，但是如果添加激素IBA，根長勢更好。壯苗生根50 d左右，即可形成健壯的完整植株，生根率達(dá)100%。

2.5 組培苗移栽

本研究中先后采用了220 和630或650 mL規(guī)格的組培瓶進(jìn)行試驗（圖2）。在220 mL的組培瓶中，待冬鳳蘭成苗后轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基，轉(zhuǎn)接后1個月左右，苗即頂蓋，此時苗還幼嫩，不粗壯，若直接煉苗移栽，成活率低于80%；如果再次轉(zhuǎn)接該規(guī)格瓶，因為苗高已頂瓶蓋，轉(zhuǎn)接的污染率也較高，此外，當(dāng)轉(zhuǎn)接不及時、接種苗數(shù)多時，會導(dǎo)致根部環(huán)繞，如圖3所示。如果成苗后轉(zhuǎn)入220 mL組培瓶中，待苗快頂蓋時轉(zhuǎn)入630或650 mL的組培瓶中進(jìn)行壯苗培養(yǎng)，這樣冬鳳蘭組培苗在瓶內(nèi)可多生長半個多月，此時莖部較粗壯，因此移栽成活率更高，可達(dá)95%以上。

待冬鳳蘭組培苗長至瓶頸口，高約10 cm時，轉(zhuǎn)移至大棚的自然光下煉苗15～30 d后，再開蓋煉苗3～5 d；將組培苗取出洗凈培養(yǎng)基，用多菌靈浸泡后晾干根部，先用浸泡過的水草包裹根部并移栽入組培盤內(nèi)。根據(jù)前幾日的水草濕潤度和天氣，可暫時不澆水，當(dāng)水草干透后淋水。待組培苗移栽成活后，可移入含火山石/椰糠+松樹皮的混合基質(zhì)中，保持適當(dāng)通風(fēng)和足夠濕度，成活率可達(dá)到95%左右。

3 討論

無菌播種是蘭科植物種子萌發(fā)的主要方法，目前多采用MS培養(yǎng)基對冬鳳蘭進(jìn)行無菌播種、組織培養(yǎng)研究。本研究利用常規(guī)的升汞消毒蒴果的方法，將冬鳳蘭種子無菌播種于含6-BA+NAA的誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，經(jīng)暗室培養(yǎng)后萌發(fā)出白色原球莖，見光后轉(zhuǎn)綠。其中在 MS+6-BA 1.0 g/L+NAA 0.5 g/L+CM 15%的培養(yǎng)基上時，誘導(dǎo)率較高。羅遠(yuǎn)華等[2]研究表明，冬鳳蘭種子在花寶1號或MS培養(yǎng)基上培養(yǎng)90 d后萌芽率達(dá)98%以上，可添加適量的CM，低濃度的6-BA和NAA有利于冬鳳蘭種子形成原球莖，這與本研究結(jié)論一致。不過羅遠(yuǎn)華等[2]采用的外植體處理方式為灼燒法，并認(rèn)為此法無需殺菌劑且操作簡便，是冬鳳蘭種子理想的滅菌方法。

為了大量增殖原球莖，本研究采用液體振蕩的方式。將原球莖接種入VW液體培養(yǎng)基，添加6-BA 1.0 mg/L，并附加白糖30 g/L、活性炭0.4 g/L，pH 5.7。振蕩培養(yǎng)20 d后，增殖率為132.00%。

本研究中，將原球莖分別轉(zhuǎn)接入VW和MS 2種分化培養(yǎng)基。在VW培養(yǎng)基中，冬鳳蘭原球莖分化出芽、根的速度快，分化率高，而且組培苗莖粗，葉片綠。

在研究過程中，一般使用傳統(tǒng)的220 mL規(guī)格的組培瓶，但是冬鳳蘭生長速度快，葉細(xì)長，如果一直采用此規(guī)格的瓶，轉(zhuǎn)接的污染率較高，而且當(dāng)轉(zhuǎn)接不及時、接種苗數(shù)多時，會導(dǎo)致根部環(huán)繞。后期煉苗移栽時不能形成單株，如果有一株染病或根部腐爛會導(dǎo)致整瓶十余株感染。因此，冬鳳蘭在壯苗生根階段應(yīng)采用630或650 mL規(guī)格的組培瓶，可增加其在瓶內(nèi)生長時間，提高后期瓶苗移栽成活率。

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