陳文，陳珍，楊光提，黃遠(yuǎn)強(qiáng)

（湖南省瀏陽市畜牧獸醫(yī)水產(chǎn)局，湖南瀏陽410300）

L-茶氨酸對(duì)H2O2損傷的瘤胃上皮細(xì)胞活性的影響

陳文，陳珍，楊光提，黃遠(yuǎn)強(qiáng)

（湖南省瀏陽市畜牧獸醫(yī)水產(chǎn)局，湖南瀏陽410300）

以體外分離培養(yǎng)的60日齡湘東黑山羊瘤胃上皮細(xì)胞作為試驗(yàn)材料，利用H202構(gòu)建損傷模型，通過分別添加4、8、12和16mmol/L的L-茶氨酸溶液，來測(cè)定L-茶氨酸對(duì)瘤胃上皮細(xì)胞活性的影響。結(jié)果表明：L-茶氨酸的濃度在8～16mmol/L時(shí)能夠顯著增加的瘤胃上皮細(xì)胞的活性(P＜0.05)，并且隨著添加濃度的增加其活性增加，且在24h時(shí)處理效果較好。由此可知，L-茶氨酸對(duì)H202損傷的湘東黑山羊瘤胃上皮細(xì)胞具有一定的保護(hù)作用。

L-茶氨酸；瘤胃上皮細(xì)胞；細(xì)胞活性

胃腸道的氧化應(yīng)激主要是由兩種應(yīng)激通過產(chǎn)生自由基引起的，包括急性和慢性應(yīng)激。長(zhǎng)期應(yīng)激會(huì)對(duì)動(dòng)物機(jī)體造成很大的損傷，產(chǎn)生的自由基會(huì)造成特定維生素和微量元素的大量耗損，從而使畜禽的免疫力下降，進(jìn)而造成機(jī)體的功能障礙甚至是誘發(fā)死亡[1]。研究表明，活性氧的產(chǎn)生能夠誘發(fā)多種類型的胃腸疾病[2]。并且H2O2是引起胃粘膜細(xì)胞氧化損傷的主要活性氧。

綠茶作為一種養(yǎng)生性飲品，隨著研究者對(duì)于其功能的逐步認(rèn)知，目前已經(jīng)得到廣泛的關(guān)注[3]。天然的茶氨酸僅以游離的形式存在，并且主要是L型[4]。作為茶科植物中的主要活性成分，茶氨酸主要是借助氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)來完成在組織和細(xì)胞內(nèi)的作用的，并且研究表明，茶氨酸對(duì)組織損傷具有一定的保護(hù)作用，例如腦組織[5-7]和肝組織[8-9]。

作為反芻動(dòng)物特有的消化器官，瘤胃在反芻動(dòng)物消化過程中起著決定性的作用。反芻動(dòng)物能夠高效的利用高纖維的飼料原料，離不開瘤胃的功勞。反芻動(dòng)物的瘤胃功能完善和健康，能夠保證反芻動(dòng)物的正常生理活動(dòng)。本試驗(yàn)借助構(gòu)建的離體氧化損傷模型，通過添加不同濃度梯度的L-茶氨酸來分析其對(duì)湘東黑山羊瘤胃上皮細(xì)胞活性的影響，為更加全面的了解L-茶氨酸對(duì)瘤胃上皮受損的保護(hù)作用，探索其作用機(jī)制提供了理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)儀器

分光光度計(jì)(BIO RAD680,美國(guó))，二氧化碳培養(yǎng)箱（SELECTA，西班牙），倒置相差顯微鏡（Ol ympus，日本），高壓蒸汽滅菌鍋（SANYO，日本），超凈工作臺(tái)（SANYO，日本），水平搖床(哈爾濱市東聯(lián)電子技術(shù)開發(fā)有限公司，H ZS-H)，鼓風(fēng)干燥箱（上海申賢恒溫設(shè)備廠）

1.2 試驗(yàn)試劑

胎牛血清（Cel l m ax）、基本培養(yǎng)基（Dul becco’s m odi f i ed eagl e m edi um∶nut ri ent m i xt ure F-12,DM EM/F12）、0.25%Trypsi n+0.02%EDTA、磷酸鹽緩沖溶液（PBS）、青霉素均購(gòu)自（Gi bco,美國(guó)）；兩性霉素B+慶大霉素（Gent am i ci n/am phot eri ci n Sol ut i on）購(gòu)自 Therm o Fi shersci ent i f i c（R-015-10,10×1m L，美國(guó)）；L- 茶氨酸（L-t heani ne,CAS∶3081-61-6,純度≥99%,H PLC）；3-（4,5- 噻唑 -2）-2,5- 二苯基四氮唑溴鹽（M TT）、二甲基亞砜（DM SO）購(gòu)自美國(guó)Si gm a公司。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)

試驗(yàn)選擇4只60日齡（體重為8.2±0.8 kg）健康的湘東黑山羊。采用頸靜脈放血的方法，待山羊死亡后即刻采取瘤胃組織，沖洗并棄內(nèi)容物，后用生理鹽水反復(fù)沖洗，干凈后進(jìn)行取樣。對(duì)瘤胃上皮進(jìn)行鈍性剝離，浸泡于4℃含10倍雙抗、5倍慶大霉素的DM EM-F12培養(yǎng)基中，轉(zhuǎn)移至細(xì)胞培養(yǎng)室；組織用含5倍雙抗的PBS液清洗3～5次；將組織盡量剪碎，加入0.25%胰酶消化液；37℃空氣浴振蕩消化，收集酶解液，加入適量完全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，依次經(jīng)100μm孔徑篩網(wǎng)過濾，收集濾液，1000 r/m i n離心5 m i n，去上清，將細(xì)胞重懸于DM EM/F12完全培養(yǎng)液中，并調(diào)整細(xì)胞濃度為1×106/m L，置于CO2培養(yǎng)箱，37℃，5%CO2培養(yǎng)。

1.4 試驗(yàn)方法

1.4.1 條件培養(yǎng)液的配制

將L-茶氨酸在完全培養(yǎng)基中進(jìn)行充分溶解，使其終濃度達(dá)到32m m ol/L的濃縮液。處理時(shí)用完全培養(yǎng)基進(jìn)行稀釋，使最終的工作液分別為4m m ol/L、8m m ol/L、12m m ol/L、16m m ol/L 各 20m L。保存在4℃冰箱中備用。

1.4.2 細(xì)胞的分組及處理

當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到80%～90%時(shí)，進(jìn)行換液，用PBS對(duì)貼壁細(xì)胞進(jìn)行沖洗，重復(fù)一次，加入1m L的胰蛋白酶消化細(xì)胞，放入恒溫恒濕的CO2培養(yǎng)箱中消化4 m i n。倒置顯微鏡下觀察，當(dāng)所有細(xì)胞變亮、變圓且有部分細(xì)胞漂浮時(shí)，迅速用完全培養(yǎng)基終止消化。輕輕吹打細(xì)胞，使其形成細(xì)胞懸液，吸取懸液進(jìn)行離心1000 r/m i n 5 m i n，保留底部沉淀。隨后用完全培養(yǎng)基使細(xì)胞重懸，相同比例接種在兩個(gè)培養(yǎng)皿中。培養(yǎng)箱中放置1h，隨后重吸細(xì)胞懸液，轉(zhuǎn)移至新的培養(yǎng)皿中培養(yǎng)，重復(fù)接種過程一次，進(jìn)一步純化[10]。純化后細(xì)胞可備用于試驗(yàn)處理，待細(xì)胞密度達(dá)到60%～70%時(shí)，分為6組，每組6個(gè)重復(fù)，分為對(duì)照組添加0、Ⅰ組 800 μm ol/L H2O2、Ⅱ組4m m ol/L L-茶氨酸+800 μm ol/L H2O2、Ⅲ組8m m ol/L L- 茶 氨 酸 +800 μm ol/L H2O2、 Ⅳ 組12m m ol/L L-茶氨酸 +800 μm ol/L H2O2和Ⅴ組16m m ol/L L-茶氨酸+800 μm ol/L H2O2，分別處理12、24、48h，隨后PBS沖洗三遍,將M TT加入試驗(yàn)處理組各孔,并在培養(yǎng)箱中孵育4h,吸取上清液。后向每孔種添加150 μL DM SO,水平搖床中振蕩10 m i n,570 nm波長(zhǎng)測(cè)定其各孔的吸光度值。

2 數(shù)據(jù)處理與分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 21軟件進(jìn)行分析，統(tǒng)計(jì)方法采用LSD法，對(duì)各水平間數(shù)據(jù)進(jìn)行多重比較，試驗(yàn)結(jié)果以均值±標(biāo)準(zhǔn)誤的形式進(jìn)行呈現(xiàn)。

3 結(jié)果

3.1 不同濃度L-茶氨酸對(duì)H2O2誘導(dǎo)的受損瘤胃上皮細(xì)胞存活率的影響

本試驗(yàn)的研究目的，主要是圍繞L-茶氨酸的保護(hù)機(jī)制來探索，探究其對(duì)受損瘤胃上皮細(xì)胞活性的影響。試驗(yàn)首先采用不同濃度水平(4、8、12、16m m ol/L)的L-茶氨酸來處理細(xì)胞，孵育1h后與H2O2(0.8 m m ol/L)共同培養(yǎng)24h。試驗(yàn)結(jié)果（圖1）表明：瘤胃上皮細(xì)胞的活性對(duì)于H2O2的刺激很敏感(P＜0.01)。H2O2對(duì)細(xì)胞的損傷作用，只有在L-茶氨酸濃度不低于8m m ol/L的情況下才得到改善。當(dāng)L-茶氨酸的孵育濃度達(dá)到8、12和16 m m ol/L時(shí),其細(xì)胞活性分別為(62.43±8.21)%、(69.55±6.78)%、(76.44±7.42)%,與H 2O2單獨(dú)添加組比較,顯著增加 (P＜0.01)，由此可知，L-茶氨酸的濃度在8～16m m ol/L時(shí)能夠顯著改善受損的瘤胃上皮細(xì)胞的細(xì)胞活力。

圖1 不同L-茶氨酸水平下瘤胃上皮細(xì)胞活性

3.2 不同濃度L-茶氨酸不同作用時(shí)間下H2O2誘導(dǎo)的受損瘤胃上皮細(xì)胞的存活率

試驗(yàn)結(jié)果如圖2所示，處理濃度相同的情況下，時(shí)間處理不同組的細(xì)胞活性各組間差異不顯著(P＞0.05)，然而與12h和48h處理組相比，24h處理組的細(xì)胞具有更好的活性，由此說明對(duì)于H2O2誘導(dǎo)的受損瘤胃上皮細(xì)胞，在L-茶氨酸處理24h時(shí)對(duì)細(xì)胞的保護(hù)性最強(qiáng)。

圖2 不同濃度茶氨酸不同處理時(shí)間瘤胃上皮細(xì)胞活性

4 討論

高濃度的活性氧能夠作用于瘤胃上皮細(xì)胞，使相關(guān)疾病惡化，甚至是誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生凋亡。作為引起細(xì)胞損傷的關(guān)鍵因素，氧化自由基的產(chǎn)生因素有很多，例如缺血再灌注、藥物代謝，以及一些重金屬引起的中毒[11]。氧化自由基的種類有很多，H2O2在占了很大的比例，也是目前研究最為廣泛的自由基之一[12]。H2O2可導(dǎo)致細(xì)胞損傷的機(jī)制涉及的范圍比較廣，不僅會(huì)對(duì)通過作用線粒體和DNA來起到損傷作用，而且還可以對(duì)細(xì)胞內(nèi)的蛋白和脂質(zhì)進(jìn)行氧化，同時(shí)消耗大量的ATP，對(duì)細(xì)胞造成損傷，甚至是誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生凋亡[13]。

作為綠茶中天然存在的氨基酸，L-茶氨酸主要起著呈味的作用，并且已經(jīng)廣泛應(yīng)用在食品行業(yè)。研究表明，L-茶氨酸不僅能夠抗氧化，還能幫助神經(jīng)細(xì)胞抵御外界的各種刺激[14]。目前對(duì)于茶氨酸對(duì)氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的受損瘤胃上皮細(xì)胞是否起作用，還鮮有文獻(xiàn)報(bào)道。因?yàn)長(zhǎng)-茶氨酸是由谷氨酰胺衍生而得的，在代謝過程中可以轉(zhuǎn)化成谷氨酸，進(jìn)而參加谷胱甘肽（GSH）的合成。除此之外，L-茶氨酸可以保護(hù)細(xì)胞內(nèi)的抗氧化酶，減少GSH損耗的同時(shí)還能生成GSH，以維持細(xì)胞內(nèi)GSH的穩(wěn)態(tài)，保證細(xì)胞內(nèi)氧化還原狀態(tài)的正常運(yùn)轉(zhuǎn)，免受氧化應(yīng)激造成的應(yīng)激損傷[15]。

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S852.32

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1006-4907（2017）05-0041-03

10.3969/j.issn.1006-4907.2017.05.019

2017-09-19