周汝順，江 燕 ，李四元

（1.湖南省獸藥飼料監(jiān)察所，湖南長(zhǎng)沙410006；2.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，湖南長(zhǎng)沙410128）

黃藤素注射液含量測(cè)定方法的比較

周汝順1，江 燕1，李四元2※

（1.湖南省獸藥飼料監(jiān)察所，湖南長(zhǎng)沙410006；2.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，湖南長(zhǎng)沙410128）

為建立HPLC法測(cè)定黃藤素注射液中鹽酸棕櫚堿的含量，并對(duì)其方法進(jìn)行評(píng)價(jià)試驗(yàn)，HPLC法用鹽酸巴馬汀為對(duì)照品，以十八烷基健合硅膠為填充劑，以乙腈－0.4%磷酸溶液（34∶66）為流動(dòng)相，柱溫為30℃，檢測(cè)波長(zhǎng)為345nm，外標(biāo)法計(jì)算結(jié)果另乘以1.136即得鹽酸棕櫚堿的含量。對(duì)HPLC法與原標(biāo)準(zhǔn)化學(xué)沉淀法在重復(fù)性、回收率、樣品結(jié)果測(cè)定方面分別進(jìn)行比較，二者在樣品結(jié)果測(cè)定上無(wú)顯著性差異，但HPLC法重復(fù)性更好，回收率更高，且操作簡(jiǎn)便，省時(shí)，可作為黃藤素注射液含量測(cè)定的一種補(bǔ)充方法，亦可為該標(biāo)準(zhǔn)的質(zhì)量修訂提供參考依據(jù)。

黃藤素注射液；含量測(cè)定；HPLC法；化學(xué)沉淀法

黃藤素注射液為防己科植物黃藤提取物制成的中藥單體制劑，主要成分為黃藤素。本品主要功能為清熱解毒，用于細(xì)菌性痢疾，腸炎，呼吸道及泌尿道感染等，具有抑菌、抗炎、抗病毒作用、明顯增加白細(xì)胞吞噬細(xì)菌的多重藥理作用和增強(qiáng)機(jī)體免疫力作用[1-2]，現(xiàn)已被載入《中國(guó)藥典》[3]。本品作為獸用中藥制劑亦已被農(nóng)業(yè)部收入《獸藥國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)匯編》第二冊(cè)[4]，即農(nóng)業(yè)部第1506號(hào)公告。黃藤素又名鹽酸巴馬汀，亦叫鹽酸棕櫚堿，為異喹啉類生物堿，可與碘化鉍鉀、三硝基苯酚等試劑發(fā)生化學(xué)反應(yīng)生成沉淀。因此在《農(nóng)業(yè)部第1506號(hào)公告》黃藤素注射液質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中，其含量測(cè)定方法為化學(xué)沉淀法，但該方法操作過(guò)程繁瑣，耗時(shí)長(zhǎng)，回收率低，重復(fù)性差。因此本試驗(yàn)建立了H PLC法測(cè)定黃藤素注射液中鹽酸棕櫚堿的含量為該制劑的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)一步修訂提供依據(jù)[5]。

1 儀器與試劑

Agi l ent1200高效液相色譜儀（含四元梯度泵，紫外檢測(cè)器，自動(dòng)進(jìn)樣器，柱溫箱，色譜工作站）,AL204分析天平（梅特勒公司，0.0001g）,202型電熱恒溫干燥箱（北京永光明醫(yī)療儀器公司，0.1℃）。鹽酸巴馬汀對(duì)照品（中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)為0732-200005，含量≥98.0%）；黃藤素注射液（湖南廣安動(dòng)物保健品有限公司，湖南偉達(dá)生物科技有限公司，長(zhǎng)沙新起點(diǎn)保健品有限公司）；乙腈為色譜純；水為自制超純水；其他試劑均為分析純。

2 方法

2.1 色譜條件

色譜柱：Agi l ent TC-C18柱（4.6m m×250m m,5μm）；流動(dòng)相：乙腈－0.4% 磷酸溶液（34∶66）；流速：1.0m L/m i n；檢測(cè)波長(zhǎng)：345nm；進(jìn)樣量：10μL。

2.2 溶液的制備

2.2.1 對(duì)照品溶液的制備

取鹽酸巴馬汀對(duì)照品適量，精密稱定，加1%鹽酸甲醇溶液制成每1m L含40ug的溶液，即得。

2.2.2 供試品溶液的制備

精密量取本品5m L，置50m L量瓶中，加1%鹽酸甲醇溶液定容至刻度，搖勻，精密量取1m L置25m L量瓶中，加1%鹽酸甲醇溶液定容至刻度，搖勻，即得。

2.3 結(jié)果的計(jì)算

本法用外標(biāo)法計(jì)算結(jié)果，結(jié)果乘以1.136即得鹽酸棕櫚堿的含量。

2.4 對(duì)照方法含量測(cè)定（化學(xué)沉淀法）

參照《農(nóng)業(yè)部第1506號(hào)公告》黃藤素注射液[含量測(cè)定]項(xiàng)下方法，精密量取本品20m L，置燒杯中，加水75m L與鹽酸溶液（0.1m ol/L）5m L，在不斷攪拌下緩緩加入三硝基苯酚試液30m L，放置2小時(shí)以上，用100℃恒重的垂熔玻璃坩堝濾過(guò)，沉淀用上述濾液洗滌，再用水15m L洗滌，并在100℃干燥至恒重。精密稱定，與0.7612相乘，即得供試品中含有鹽酸棕櫚堿（C21H 21NO4·H Cl·3H 2O）的重量。

3 結(jié)果

3.1 重復(fù)性試驗(yàn)

分別照上述兩種含量測(cè)定方法取同一批號(hào)（20120701）的供試品5份測(cè)定含量。結(jié)果化學(xué)沉淀法測(cè)得樣品平均含量為 9.53m g/m L，RSD=3.9%（n=5）；H PLC法測(cè)得樣品平均含量為 9.71m g，RSD=0.3%（n=5）。見表 1。

2.3 回收率試驗(yàn)

取不同批號(hào)黃藤素原粉2份，測(cè)定含量，按黃藤素注射液生產(chǎn)工藝制成制劑，分別照上述兩種含量測(cè)定方法制備并測(cè)定含量。計(jì)算回收率，結(jié)果化學(xué)沉淀法測(cè)得樣品平均回收率為96.0%，RSD＝1.8%（n＝4）；H PLC法測(cè)得樣品平均回收率為99.4% ，RSD＝0.5%（n＝4）。見表 2。

2.4 樣品結(jié)果

取不同廠家、不同批次的樣品，分別照上述兩種含量測(cè)定方法制備并測(cè)定含量，結(jié)果見表3。

表1 方法的重復(fù)性比較

表2 方法的回收率比較

表3 樣品含量測(cè)定結(jié)果比較

4 分析與討論

4.1 重復(fù)性和回收率的比較

兩種方法重復(fù)性和回收率的比較，H PLC法均明顯好于化學(xué)沉淀法。主要原因是H PLC法樣品處理較為簡(jiǎn)單，儀器進(jìn)樣精密度高。而化學(xué)沉淀法中影響沉淀完全的因素較多，三硝基苯酚試劑加入的速度、溶液PH值和溫度對(duì)沉淀的形成均會(huì)產(chǎn)生較大的影響[6]，過(guò)濾后沖洗沉淀用水的體積和次數(shù)對(duì)沉淀的重量也有一定的影響。因此化學(xué)沉淀法重復(fù)性較差，結(jié)果的準(zhǔn)確性難于控制。而化學(xué)沉淀法回收率較低，可能是由于沉淀不完全或是用水沖洗后導(dǎo)致部分沉淀溶解所致。

4.2 測(cè)定結(jié)果的評(píng)價(jià)

通過(guò)對(duì)多批次的樣品測(cè)定結(jié)果比較，H PLC法測(cè)定的結(jié)果普遍較化學(xué)沉淀法高，但結(jié)果差異不顯著。說(shuō)明這兩種方法對(duì)黃藤素注射液含量測(cè)定結(jié)果的評(píng)價(jià)基本一致，均可以作為含量測(cè)定的方法。

4.3 HPLC法條件的篩選

通過(guò)對(duì)不同色譜柱型號(hào)，柱溫，流動(dòng)相比例、流速的比較，本方法最終確定色譜柱為普通C18柱，流動(dòng)相為乙腈－0.4%磷酸溶液（34：66），柱溫為30℃，流速為1m L/m i n。在該條件下樣品峰型較對(duì)稱，無(wú)拖尾現(xiàn)象，理論塔板數(shù)高，雜質(zhì)峰及溶劑峰對(duì)樣品峰無(wú)干擾。

4.4 黃藤素注射液標(biāo)準(zhǔn)中含量以鹽酸棕櫚堿 （C21H21NO·4HC·l3H2O）計(jì)，鹽酸棕櫚堿跟對(duì)照品鹽酸巴馬汀的分子量比值為1.136，因此最后結(jié)果需乘以1.136。

5 結(jié)論

綜合比較黃藤素注射液含量測(cè)定的這兩種方法，H PLC法與化學(xué)沉淀法在含量測(cè)定結(jié)果方面無(wú)顯著性差別，且化學(xué)沉淀法對(duì)儀器設(shè)備要求沒那么高，檢測(cè)成本相對(duì)較低，結(jié)果更容易得到；但H PLC法操作更簡(jiǎn)便，耗時(shí)少，數(shù)據(jù)相對(duì)準(zhǔn)確，重復(fù)性好，可作為一種補(bǔ)充方法來(lái)測(cè)定黃藤素注射液中鹽酸棕櫚堿的含量，亦可為該標(biāo)準(zhǔn)的質(zhì)量修訂提供參考依據(jù)。

[1]孫高磊,王湘妍.HPLC法測(cè)定黃藤素中鹽酸巴馬汀的含量及有關(guān)物質(zhì)[J]廣州化工，2010，38(8).25-27.

[2]張慧，王義明，謝媛媛,等，HPLC法同時(shí)測(cè)定黃藤素注射液中黃藤素和鹽酸藥根堿的含量[J].中國(guó)藥房2012，23(7):625-627.

[3]國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典（一部）[S].北京：化學(xué)工業(yè)出版社,2015.

[4]農(nóng)業(yè)部獸藥評(píng)審中心.獸藥國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)匯編[M].北京：中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社，2011.

[5]陳啟友，周汝順，匡光偉.HPLC法測(cè)定黃藤素注射液中黃藤素的含量[J].廣東獸藥，2012,29（5）：26-28.

[6]霍留拴,婁建新.重量分析法測(cè)定影響沉淀完全的因素[J].科技與生活,2012,（16）：116.

S859；R284.1

A

1006-4907（2017）05-0036-02

10.3969/j.issn.1006-4907.2017.05.017

周汝順（1984～），男，瑤族，湖南懷化人，獸醫(yī)師，農(nóng)業(yè)推廣碩士，主要從事獸藥、飼料、畜禽產(chǎn)品檢測(cè)技術(shù)研究，33401919@qq.com。

※通訊作者：李四元。

2017-10-20