車瑞波 ，李 芬

（1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，湖南長(zhǎng)沙410128；2.長(zhǎng)沙道勤生物科技有限公司，湖南長(zhǎng)沙，410129）

泰萬菌素對(duì)大鼠結(jié)腸菌群的影響

車瑞波1，2，李 芬1

（1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，湖南長(zhǎng)沙410128；2.長(zhǎng)沙道勤生物科技有限公司，湖南長(zhǎng)沙，410129）

為研究泰萬菌素對(duì)大鼠結(jié)腸菌群的影響，試驗(yàn)采用PCR-DGGE技術(shù)分離方法分析大、小劑量泰萬菌素作用下結(jié)腸菌群結(jié)構(gòu)的改變情況及其停藥后的恢復(fù)狀態(tài)。結(jié)果顯示，泰萬菌素作用時(shí)，大鼠結(jié)腸內(nèi)細(xì)菌種類稍減少，但大、小劑量組都有4種細(xì)菌顯著增多；停藥后細(xì)菌多樣性下降，但有較多豐度低的條帶出現(xiàn)，結(jié)腸菌群結(jié)構(gòu)未受到破壞。

泰萬菌素；結(jié)腸；DGGE；菌群

消化道微生物與宿主為共生關(guān)系，微生物可促進(jìn)消化道對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收，其在消化道內(nèi)構(gòu)成的復(fù)雜生態(tài)環(huán)境對(duì)宿主的內(nèi)穩(wěn)態(tài)有重要作用[1]，同時(shí)消化道也為微生物提供良好生存環(huán)境，兩者之間的平衡對(duì)維持動(dòng)物健康起到關(guān)鍵作用。但是，近年來，抗生素濫用問題日益嚴(yán)重，其不僅影響腸道內(nèi)菌群的種類和數(shù)量，破壞腸道菌群結(jié)構(gòu)，還引起細(xì)菌產(chǎn)生耐藥性。這引起了人們高度重視，同樣，在畜牧獸醫(yī)領(lǐng)域，已發(fā)現(xiàn)動(dòng)物專用抗生素泰樂菌素引起了嚴(yán)重耐藥性，為此，人們對(duì)其進(jìn)行了改造，獲得了新一代抗生素-泰萬菌素。現(xiàn)今，泰萬菌素已被用于動(dòng)物臨床對(duì)急慢性呼吸道和消化道系統(tǒng)疾病的防治，且已有研究表明泰萬菌素可有效治療豬氣喘、豬痢疾、豬增生性腸炎和豬地方流行性肺炎[2]。然而，泰萬菌素是否干擾動(dòng)物消化道菌群結(jié)構(gòu)，目前國(guó)內(nèi)外研究較少。本研究采用PCR-DGGE技術(shù)研究泰萬菌素作用下大鼠結(jié)腸菌群結(jié)構(gòu)的變化及其恢復(fù)情況，這對(duì)掌握泰萬菌素在臨床上使用的安全性具有一定意義。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)大鼠處理

將18只180 g左右的健康大鼠（購(gòu)自湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司）隨機(jī)分成對(duì)照組，小劑量組，大劑量組，每組6只，預(yù)飼7 d。將11.6 m g、23.2 m g泰萬菌素（購(gòu)自湖南某生物科技股份有限公司）分別溶于50 m L純凈水，分別提供給小劑量組和大劑量組大鼠自由使用，對(duì)照組自由飲用純凈水，連續(xù)3 d。從第4 d開始，試驗(yàn)組改為純凈水，對(duì)照組照常，連續(xù)10 d。

試驗(yàn)投喂藥物后的第4 d、第11 d分別解剖每組大鼠3只，打開腹腔，無菌條件下剪取結(jié)腸1 cm，用無菌生理鹽水清洗內(nèi)容物至無菌1.5 m L離心管里，各組結(jié)腸內(nèi)容物混勻，300 r/m i n離心10 m i n，上清液備用。

1.2 結(jié)腸內(nèi)細(xì)菌總DNA提取

以細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒（購(gòu)自天根生化科技（北京）有限公司）提取上述上清液的細(xì)菌總DNA。

1.3 細(xì)菌16SrDNAV3區(qū)擴(kuò)增

以通用引物341F（5’-CCTACGGGAGGCAGCAG-3’）和 907R（5’-CCCCGTCAATTCATTTGAGTTT-3’）擴(kuò)增制備細(xì)菌16SrDNAV2-V4區(qū)；反應(yīng)體系：上述1.2提取的細(xì)菌總DNA 2.0 μL，上、游引物各1μL，2×TransTaq H i FiSuperM i x（購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司）25 μL，補(bǔ)加 ddH 2O至50 μL。反應(yīng)程序：95 ℃ 5 m i n；95 ℃ 30 s、66 ℃ 30 s、72.0℃12 s，32個(gè)循環(huán)；72.0℃ 7 m i n。

以上述擴(kuò)增產(chǎn)物為模板，341F-GC(5’-CGCCCGCCGCGCGCGGCGGGCGGGGCGGGGGCCGGGG GGCCTACGGGAGGCAGCAG-3’) 和 518R(5’-ATTACCGCGGCTGCTGG-3’)為引物，擴(kuò)增制備細(xì)菌16S rDNA V3區(qū)產(chǎn)物。反應(yīng)體系和擴(kuò)增條件同細(xì)菌16S rDNA V2-V4區(qū)擴(kuò)增。

取細(xì)菌 16S rDNA V3區(qū)擴(kuò)增產(chǎn)物 5 μL，于1.5%瓊脂糖凝膠中電泳。

1.4 DGGE電泳

移取上述各組產(chǎn)物5μL于6%的聚丙烯酰胺凝膠點(diǎn)樣孔中，以60℃，300 V為電泳條件在變性梯度凝膠電泳儀（購(gòu)自美國(guó)CBS公司，DGGEK-2001）中電泳7 h。EB染色20 m i n，在凝膠成像系統(tǒng)（購(gòu)自法國(guó)Vi l berl ourm at公司，Quant um ST5）下觀察拍照，用Quant i t y One v4.6.2軟件繪制DGGE電泳圖譜。

1.5 DNA回收、克隆、測(cè)序

選取DGGE膠中優(yōu)勢(shì)條帶，標(biāo)記后無菌條件下切取，ddH2O清洗3次于無菌EP管中，以DNA快速純化回收試劑盒（天根生化科技（北京）有限公司）純化回收。產(chǎn)物與pM ETeasy載體連接，轉(zhuǎn)化DH 5α感受態(tài)細(xì)胞，構(gòu)建重組質(zhì)粒，選擇陽(yáng)性克隆。將產(chǎn)物送至深圳華大基因科技服務(wù)有限公司測(cè)序。

1.6 序列分析

測(cè)序序列與GenBank上已上傳序列進(jìn)行BLAST比對(duì)分析，選取相似度最高的同源性序列。

2 結(jié)果與分析

2.1 細(xì)菌16S rDNA V3區(qū)擴(kuò)增結(jié)果

用上述經(jīng)兩輪擴(kuò)增后的細(xì)菌16S rDNA V3區(qū)產(chǎn)物進(jìn)行電泳，結(jié)果如下，細(xì)菌16S rDNA V3區(qū)片段大小約為200bp，與預(yù)期相符。

圖1 大鼠結(jié)腸內(nèi)細(xì)菌16S rDNA V3區(qū)擴(kuò)增片段

2.2 DGGE電泳結(jié)果

用結(jié)腸內(nèi)細(xì)菌16S rDNA V3區(qū)各組產(chǎn)物進(jìn)行DGGE電泳，結(jié)果見圖2。

圖2 大鼠結(jié)腸細(xì)菌菌群DGGE電泳圖

2.3 序列比對(duì)結(jié)果

本實(shí)驗(yàn)純化回收DGGE膠中13條優(yōu)勢(shì)條帶，克隆測(cè)序后，登錄GenBankBLAST進(jìn)行序列比對(duì)，得出與之相似度較高的菌種（表1）。

表1 DGGE膠中回收條帶序列比對(duì)結(jié)果

結(jié)腸PCR產(chǎn)物經(jīng)DGGE電泳分離后，不同組得到不同條帶數(shù)目、不同亮度，不同遷移率條帶。從圖2可看，實(shí)驗(yàn)組相比于對(duì)照組菌種數(shù)略微下降，如小劑量A10、A12、A15條帶消失，大劑量組A5、A9條帶消失；但有的細(xì)菌數(shù)目卻急劇增長(zhǎng)，呈現(xiàn)高亮狀態(tài)，如小劑量組A2、A4、A6、A8條帶亮度升高，大劑量組A2、A7、A12、A14條帶亮度顯著增強(qiáng)。

停藥后，與實(shí)驗(yàn)組相比細(xì)菌多樣性降低，如小劑量組A1、A2、A4等5條條帶消失，大劑量組A2、A7、A10等6條條帶消失，但有較多豐度不高的細(xì)菌出現(xiàn)。說明在停藥后，雖有一些細(xì)菌被抑制，但結(jié)腸菌群結(jié)構(gòu)未收到破壞，說明泰萬菌素在合適的劑量下是安全的。

從表1可見，結(jié)腸內(nèi)細(xì)菌與尸毒梭菌（Cl ost ri di um cadaveri s）、毛螺菌（Lachnospi raceaebact eri um）、鏈霉菌（St rept om yces）、梭菌（Cl ost ri di um）等細(xì)菌有較高相似度。有資料表明擬桿菌為機(jī)會(huì)致病菌，可引起慢性腸炎和直腸癌。大腸桿菌為腸道內(nèi)共生菌，但大腸桿菌對(duì)藥物的選擇壓力很敏感，易產(chǎn)生耐藥性[3]。

3 討論

資料表明，泰萬菌素可抑制PRRSV病毒復(fù)制[4]，泰樂菌素對(duì)支原體有強(qiáng)的敏感性，能抑制革蘭氏陽(yáng)性菌，可控制革蘭氏陰性菌如巴氏桿菌等的繁殖，對(duì)螺旋體和大病毒也有效[5]。還有研究表明，替米考星和泰樂菌素的治療作用表現(xiàn)為非抗菌活性的抗炎機(jī)制[6]。綜上，泰萬菌素對(duì)結(jié)腸菌群結(jié)構(gòu)未產(chǎn)生破壞，且在停藥后有一定的恢復(fù)趨勢(shì)，說明泰萬菌素可能具備上述作用，且一定程度上是安全的。

雖然泰萬菌素沒有破壞結(jié)腸菌群結(jié)構(gòu)，但是如果長(zhǎng)時(shí)間大量使用廣譜抗生素，其在抑殺有害菌的同時(shí)也可對(duì)一些腸道有益菌產(chǎn)生抑制作用，可導(dǎo)致腸道菌群多樣性降低[7]，故筆者建議不宜長(zhǎng)期大量拌喂或混飲泰萬菌素。

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S859.796

A

1006-4907（2017）05-0043-03

10.3969/j.issn.1006-4907.2017.05.020

車瑞波（1981～），男，湖南長(zhǎng)沙人，助理獸醫(yī)師，主要從事動(dòng)物疫病的防控和研究，E-mail:158656260@qq.com.

2017-07-18