李志鵬， 劉 儀，2, 李云蕊， 盧明月， 杜雪婷， 楊云慧

(1.云南師范大學(xué) 化學(xué)化工學(xué)院，云南 昆明 650500； 2.昭通市疾病預(yù)防控制中心，云南 昭通 657008)

基于金屬—有機骨架材料的C反應(yīng)蛋白傳感器研制*

李志鵬1， 劉 儀1，2, 李云蕊1， 盧明月1， 杜雪婷1， 楊云慧1

(1.云南師范大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，云南昆明650500；2.昭通市疾病預(yù)防控制中心，云南昭通657008)

在常溫下合成了Au納米顆粒負(fù)載的超納米結(jié)構(gòu)金屬有機骨架化合物(Au NPs/SNHKUST—1)，并以其為標(biāo)記材料標(biāo)記C反應(yīng)蛋白抗體。同時合成了中空狀石墨烯納米材料和Au納米顆粒作為固定基質(zhì)，制備了夾心型的C反應(yīng)蛋白免疫傳感器。通過檢測標(biāo)記物對H2O2還原反應(yīng)的催化電流，實現(xiàn)了對C反應(yīng)蛋白的定量測定。傳感器在C反應(yīng)蛋白濃度為0.2～200 ng/mL的范圍內(nèi)線性良好的，線性相關(guān)系數(shù)R2=0.994 7，檢測下限為0.05 ng/mL，為C反應(yīng)蛋白測定提供了一種新的簡單快速的檢測方法。

C反應(yīng)蛋白； SNHKUST—1； 金屬—有機骨架； 免疫傳感器； 中空石墨烯

0 引 言

C反應(yīng)蛋白(CRP)是一種典型的急性血漿蛋白，產(chǎn)生于肝細(xì)胞，由5個相同的亞基組成(每個亞基的分子量為23 kDa),為急性和全身慢性炎癥的臨床生物標(biāo)志物。許多研究表明，高濃度的C反應(yīng)蛋白與心血管疾病密切相關(guān)[1～4]。

CRP會分解成單體，同時導(dǎo)致熱、尿素、和鈣離子的缺失以及低pH值。正常情況下CRP在體內(nèi)的含量極微，而在急性創(chuàng)傷感染心血管炎癥及腫瘤疾病患者血液中的含量會急劇升高[5]，CRP還被證明與癌癥[6]和新陳代謝[7]有關(guān)，因此，在臨床診斷中非常重要[8]。通常，人體中CRP的正常水平小于2 μg/mL，當(dāng)高于這個濃度時可能存在炎癥，例如病毒感染時CRP含量為10～40 μg/mL，細(xì)菌感染時為40～200 μg/mL。

金屬—有機骨架(metal-organic frameworks，MOFs)材料由芳香酸或堿的氮、氧多齒有機配體，通過配位鍵與無機金屬中心雜化形成立體網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)晶體，研究表明，MOFs較其他的多孔材料具有更廣闊的應(yīng)用前景，如可用于吸附分離氫[9]、催化劑[10,11]、磁性材料[12,13]、光學(xué)材料[14]和有毒離子的檢測[15]等。

Chui等人首次報道的金屬有機骨架化合物HKUST—1(Hongkong University of Science and Technology)也稱為CuBTC，是由雙核銅簇與均苯三甲酸配位而成的研究最廣泛的MOFs材料之一[16]。SNHKUST—1[17]是超納米結(jié)構(gòu)的HKUST—1,粒徑相對較小，具有更大的孔隙,在氣體存儲、分離、凈化和催化等領(lǐng)域有廣泛的應(yīng)用。

中空石墨烯球[18～20](hollow graphene ball，HGB)呈空心球狀，近年來引起廣大研究者的關(guān)注，三維結(jié)構(gòu)的石墨烯具有巨大的比表面積，在傳感器[21]、催化電極[22]、電容[23,24]等領(lǐng)域有潛在的應(yīng)用。

本文研制了一種以Au/SNHKUST—1納米顆粒為標(biāo)記物的夾心型免疫傳感器,用于CRP的快速檢測。SNHKUST—1納米顆粒作為一種天然的模擬酶，對過氧化氫(H2O2)具有一定的催化作用，負(fù)載了Au納米顆粒的SNHKUST—1對H2O2的催化效果更好。本文采用夾心法來檢測CRP，通過電流響應(yīng)信號與CRP抗原濃度之間的正比例關(guān)系，實現(xiàn)對CRP抗原的定量檢測。

1 實驗部分

1.1 試劑及儀器

主要試劑及所用儀器列于表1及表2。

表1 主要試劑及廠家

表2 主要儀器及廠家

1.2 HGB的合成

參照文獻(xiàn)[25]合成HGB。

1.3 金納米溶膠的合成

在三頸燒瓶中加入50 mL蒸餾水，0.5 mL 1 %的氯金酸加熱至沸騰后，加入1 %的檸檬酸三鈉1.75 mL，繼續(xù)加熱至沸騰后15 min，至溶液反應(yīng)成酒紅色。

1.4 Au NPs/SNHKUST-1的合成

1.4.1 SNHKUST—1的合成

參照文獻(xiàn)[26]制得SNHKUST—1納米顆粒。

1.4.2 Au NPs/ SNHKUST—1的合成

向15 mLAu納米溶膠中加入50 mg SNHKUST—1，常溫攪拌48 h，使得Au納米顆粒被SNHKUST—1充分吸附。

1.5 CRP抗體的標(biāo)記

取1 mL的1.25 mg/mL的Au NPs/ SNHKUST—1納米顆粒，用200 mmol/L的碳酸鈉調(diào)節(jié)pH=9，向其中加入1 mg/mL的CRP抗體共10 μL，分5次加完，每次間隔3 min。之后，將離心管放至振蕩器上振搖2 h，再加入25 μL 10 %BSA，封閉30 min，離心洗滌2次，最后分散在1 mL的PBS中。

1.6 CRP傳感器的制備

取玻碳電極(Φ=3 mm)在金相砂紙上打磨拋光；依次在粒徑為1.5，0.5～0.7 μm，30～50 nm的α—氧化鋁拋光粉上打磨；分別在硝酸溶液V(HNO3)∶V (H2O)=1∶1，CH3CH2OH,去離子水中各超聲洗滌10 min。自然風(fēng)干后滴加0.6 mg/mL的HGB懸濁液于玻碳電極表面，晾干后用PBS沖洗未吸附的HGB，滴上10 μL Au納米顆粒，自然晾干，再滴加10 μL的20 μg/mL CRP抗體，于4 ℃過夜。修飾好的玻碳電極用PBS緩沖溶液沖洗3次。取出電極沖洗干凈，即可制得anti-CRP/Au NPs/HGB/GCE修飾傳感器。CRP免疫傳感器制備流程如圖1所示。

圖1 免疫傳感器制備流程(A為CRP抗體的標(biāo)記過程； B為免疫傳感器的制作過程)

1.7 檢測方法

電極在使用前用滴加1 % BSA 溶液，37 ℃培育1 h，封閉電極表面的非特異性結(jié)合位點。然后滴加不同濃度CRP抗原，在37 ℃培育45 min，培育時間結(jié)束用PBS沖洗未結(jié)合的抗原，再滴加10 μL標(biāo)記好的 anti—CRP以進(jìn)一步培育。最后在10 mL的PBS環(huán)境中，于-0.2 V的電位下用計時電流法(IT)進(jìn)行測量，所有測量均在室溫下進(jìn)行。

2 結(jié)果與討論

2.1 材料表征

2.1.1 中空石墨烯納米顆粒與SNHKUST—1的微觀形貌

用高倍透射電鏡(TEM)觀察了中空石墨烯和SNHKUST—1的納米顆粒的微觀形貌特征如圖2。由圖2(a)可知中空石墨烯顆粒的平均粒徑為200～250 nm,外殼厚度約為5 nm，呈中空狀，分散性好。由圖2(b)可知,合成的SNHKUST—1顆粒呈現(xiàn)石頭狀，分散性好無團(tuán)聚。

圖2 中空石墨烯(a)以及SNHKUST—1(b)的TEM

為了表征所合成的材料是否和文獻(xiàn)一致，采用X 射線(XRD)粉末衍射對所合成的材料進(jìn)行表征，結(jié)果如圖3所示。與文獻(xiàn)[27]譜圖進(jìn)行對比，衍射峰位置一致。表明成功合成了SNHKUST—1納米顆粒。

圖3 SNHKUST—1材料的XRD

2.1.2 Au/SNHKUST—1納米顆粒表征

對合成的Au—SNHKUST—1材料進(jìn)行TEM表征，結(jié)果如圖4所示,可見，金納米顆粒粒徑大小約為5 nm，分散性好，無團(tuán)聚，且已經(jīng)均勻負(fù)載在SNHKUST—1上，表明已成功制得了Au/SNHKUST—1納米復(fù)合物。

圖4 Au/SNHKUST—1材料的SEM

2.2 不同修飾材料電化學(xué)性能比較

為了證實Au NPs—SNHKUST—1材料對H2O2的催化作用，將玻碳電極在相同條件用殼聚糖分別固定等量的Au納米顆粒,SNHKUST—1和Au NPs/SNHKUST—1，將其分別浸入PBS緩沖溶液中，加入100 μL1.0 mol/L的H2O2于-0.2 V下進(jìn)行計時電流的測定，結(jié)果如圖5所示。從圖中可以看出，Au NPs—SNHKUST—1(曲線c)對H2O2的催化電流遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于SNHKUST—1(曲線b),Au NPs(曲線a)，證實了Au NPs—SNHKUST—1材料對H2O2具有較強的協(xié)同催化作用，可產(chǎn)生較大的電流響應(yīng)信號。

圖5 不同修飾材料催化性能比較

2.3 免疫傳感器循環(huán)伏安行為

圖6為培育相同濃度 CRP抗原(40 ng/mL)的免疫傳感器，在不同溶液中的循環(huán)伏安行為。曲線a為在10 mL 0.1 mol/L的PBS緩沖溶液(pH 7.4)中的循環(huán)伏安圖，無氧化還原峰；當(dāng)在10 mL 0.1 mol/L的PBS緩沖溶液(pH 7.4)中加入0.1 mol/L的H2O2時，電流急劇增加(曲線b),證實了Au/SNHKUST—1材料對H2O2具有催化作用。

圖6 免疫傳感器在不同溶液中的循環(huán)伏安曲線

2.4 不同修飾電極界面交流阻抗行為

圖7為修飾不同物質(zhì)的電極在5 mmol/L[Fe(CN)6]3-/4-溶液中的交流阻抗行為;其中曲線a為空玻碳電極(GCE)的阻抗曲線，近似為一條直線，電阻值極小，說明電子傳遞只受擴散控制；曲線b為中空石墨烯/殼聚糖修飾電極的交流阻抗，修飾了HGB后電阻值增大；曲線c為金納米顆粒/中空石墨烯/殼聚糖修飾電極的交流阻抗，加了Au納米顆粒后，導(dǎo)電性增大，電阻減小,其阻抗值小于曲線b。曲線d為anti-CRP/金納米顆粒/中空石墨烯/殼聚糖修飾電極的交流阻抗，阻抗明顯增大。這是由于抗體不導(dǎo)電，阻礙了[Fe(CN)6]3-/4-的電子傳遞，表明電極表面已經(jīng)固定了抗體；曲線e為anti-CRP/金納米顆粒/中空石墨烯/殼聚糖修飾電極用BSA封閉后所得的交流阻抗曲線，阻抗值遞增。曲線f為BSA/anti-CRP/金納米顆粒/中空石墨烯/殼聚糖修飾電極培育50 ng/mL濃度抗原后的阻抗曲線，阻抗值進(jìn)一步增大，這是因為培育抗原后，抗原與抗體發(fā)生特異性結(jié)合，形成免疫復(fù)合物，進(jìn)一步阻礙了電子傳遞。曲線g為CRP/BSA/anti-CRP/金納米顆粒/中空石墨烯/殼聚糖修飾電極繼續(xù)與Au NPs/SNHKUST—1標(biāo)記的anti-CRP免疫結(jié)合后電極的阻抗曲線,阻抗值降低，這是因為培育了Au-NPs/SNHKUST—1標(biāo)記的抗體后，導(dǎo)電性增強。

圖7 不同修飾電極界面的交流阻抗行為

2.5 實驗條件優(yōu)化

實驗考察了固定抗體的濃度、抗原培育時間以及標(biāo)記抗體培育時間對傳感器響應(yīng)電流的影響，結(jié)果如圖8。根據(jù)實驗結(jié)果，實驗選擇固定抗體濃度為20 μg/mL；最佳抗原的培育時間為60 min；最佳標(biāo)記抗體培育時間為60 min。

圖8 實驗結(jié)果

2.6 傳感器的校正曲線

在最佳實驗條件下，培育了不同濃度的CRP，測定電極的工作曲線，如圖9所示，內(nèi)置圖為不同濃度的CRP的i-t響應(yīng)曲線。從圖中可以看出，傳感器在CRP的濃度范圍C為0.2～200 ng/mL之間具有良好的線性關(guān)系，線性方程為I=0.631 6C+0.643 24，相關(guān)系數(shù)為R2=0.997 5，檢測下限為0.07 ng/mL。

圖9 免疫傳感器校正曲線

2.7 CRP免疫傳感器選擇性

在最優(yōu)條件下，分別選擇100 ng/mL的癌胚抗原CEA,丙氨酸(Ala) ,甘氨酸(Gly),谷氨酸(Glu)和100 mIU/mL人絨毛促線性激素(HCG)作為干擾物質(zhì)，與濃度為20 ng/mL CRP的響應(yīng)電流對比,檢測傳感器的抗干擾情況如圖10所示，結(jié)果顯示,在相同條件下CEA,Gly,Glu,Ala和HCG的響應(yīng)電流遠(yuǎn)小于CRP的電流。說明干擾物對CRP的檢測基本未造成干擾，傳感器對CRP具有較高的選擇性,如圖10。

圖10 CRP電化學(xué)免疫傳感器選擇性

2.8 回收率測定

通過標(biāo)準(zhǔn)加入法，在稀釋血清中加入3種不同濃度的CRP抗原，在最佳條件下進(jìn)行CRP回收率的測定，結(jié)果如表3所示，3次檢測的平均回收率為101.81 %，結(jié)果較滿意。

表3 CRP回收率

2.9 傳感器重現(xiàn)性與穩(wěn)定性

培育50 ng/mL CRP抗原，在0.1 mol/LPBS緩沖溶液(pH7.4)中測定了電化學(xué)傳感器對CRP測定的重現(xiàn)性。用同一玻碳電極連續(xù)測定5次，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為 1.58 %，具有很好的重現(xiàn)性。并將電極測定后洗脫放置于冰箱中保存，3天后電流保持原來的96.2 %，一周后電流保持原來的93.2 %，一個月后電流保持原來的88.2 %，表明該CRP傳感器具有很好的穩(wěn)定性。

3 結(jié) 論

提出了一種新型的CRP的電化學(xué)免疫傳感器。通過中空石墨烯和金納米顆粒將CRP抗體固定在電極表面，采用Au/SNHKUST—1標(biāo)記CRP抗體，通過夾心法來定量檢測CRP。標(biāo)記在抗體上的Au/SNHKUST—1可直接催化H2O2的還原，從而對CRP的實現(xiàn)定量檢測，通過條件優(yōu)化提高了免疫傳感器的靈敏度。傳感器具有良好的響應(yīng)性能，線性范圍寬，選擇性能好等特點。

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ResearchandfabricationofCRPimmunosensorbasedonMOFsmaterials*

LI Zhi-peng1, LIU Yi1,2, LI Yun-rui1, LU Ming-yue1, DU Xue-ting1, YANG Yun-hui1

(1.CollegeofChemistryandChemicalEngineering,YunnanNormalUniversity,Kunming650500，China;2.ZhaotongCenterforDiseaseControlandPrevention,Zhaotong657008,China)

Au nanoparticles-loaded metal organic framework compounds with ultranano-structured(Au/SNHKUST-1)is synthesized at room temperature and use it as a tag to label anti C-creative protein(CRP).Hollow graphene nanomaterials and Au nanoparticles are also synthesized and utilized as immobilized matrix.The quantitative determination of CRP can be achieved by detecting the catalytic current of label to the reduction of H2O2.The response current has a good linear relationship with CRP concentration at range of 0.2～200 ng/mL with linear correlation coefficient of 0.994 7 and the lowest detection limit is 0.05 ng/mL.This immunosensor of CRP provides a new simple and rapid detection method for CRP.

C-reactive protein(CRP); SNHKUST—1; metal orgamic frameworks(MOFs); immunosensor; hollow graphene

10.13873/J.1000—9787(2017)11—0078—05

O 657.15

A

1000—9787(2017)11—0078—05

2016—09—27

國家自然科學(xué)基金資助項目(21465026,21165023)

李志鵬(1996-), 男, 研究方向為電化學(xué)及生物傳感器。

楊云慧(1963-), 女, 通訊作者，博士,教授, E—mail:yyhui2002@aliyun.com。