徐文莉 林燕華 羅藝 李康 張洪德

上皮性卵巢癌血漿中microRNA?30a?5p含量與分級(jí)及分期的關(guān)系

徐文莉 林燕華 羅藝 李康 張洪德★

目的 研究上皮性卵巢癌患者血漿中microRNA?30a?5p與卵巢癌分級(jí)、分期的關(guān)系，探討其在卵巢癌中的診斷價(jià)值。 方法 選取111例上皮性卵巢癌患者，患者病理分級(jí)為低級(jí)上皮性卵巢癌52例，高級(jí)上皮性卵巢癌59例，根據(jù)國際婦產(chǎn)科聯(lián)盟（International Federation of Gynecology and Obstetrics，F(xiàn)IGO）分期標(biāo)準(zhǔn)：Ⅰ期24例，Ⅱ期27例，Ⅲ期32例，Ⅳ期28例；同期健康女性體檢者20例，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測血漿中microRNA?30a?5p的表達(dá)，分析microRNA?30a?5p表達(dá)與上皮性卵巢癌分級(jí)及分期的關(guān)系。 結(jié)果 與正常對(duì)照組比較，上皮性卵巢癌患者血漿中microRNA?30a?5p明顯下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），高級(jí)上皮性卵巢癌患者血漿中microRNA?30a?5p表達(dá)量明顯低于低級(jí)（P＜0.05）；隨著腫瘤分期惡性度的升高，microRNA?30a?5p相對(duì)表達(dá)量下降，但Ⅰ期與Ⅱ期結(jié)果差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），其余各組差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。 結(jié)論 microRNA?30a?5p的表達(dá)與上皮性卵巢癌發(fā)生、發(fā)展以及腫瘤的惡性度有關(guān)，為腫瘤的靶向治療提供了依據(jù)。

上皮性卵巢癌；microRNA；血漿；實(shí)時(shí)熒光定量PCR

上皮性卵巢癌在女性腫瘤中致死率極高，在過去的幾十年，卵巢癌患者生存率有了明顯升高。卵巢癌早期診斷5年生存率可達(dá)90%，但是大部分患者確診時(shí)已是腫瘤晚期，長期生存率低于30%［1］。臨床上常用血清標(biāo)志物CA125作為對(duì)疾病的診斷，但是其靈敏度僅為40%［2］。從而使得發(fā)現(xiàn)一種敏感性及特異性的標(biāo)志物顯得尤為重要。MicroRNA（miRNA）是一類長18～24個(gè)核苷酸的非編碼小分子單鏈RNA。miRNA通過完全或部分堿基配對(duì)與靶分子 3′?非翻譯區(qū)（3′?untranslated region，3′?UTR）結(jié)合，降解或抑制 mRNA 的翻譯，從而抑制靶基因的表達(dá)。研究表明miRNA參與生長、發(fā)育、細(xì)胞增殖、細(xì)胞分化細(xì)胞周期及凋亡等重要過程［3］。miRNA在腫瘤形成方面主要通過干擾細(xì)胞周期、細(xì)胞凋亡、細(xì)胞遷移基因的表達(dá)發(fā)揮關(guān)鍵作用，如引發(fā)腫瘤生長、腫瘤發(fā)展、分化等。研究顯示miRNA在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中呈不同程度的表達(dá)［4］，扮演著致癌與抑癌不同的角色。研究證實(shí)miRNA不僅在腫瘤組織內(nèi)穩(wěn)定表達(dá)，而且能穩(wěn)定存在于血清、血漿、全血中［5］，從而表明循環(huán)miRNA可作為一種無創(chuàng)的腫瘤診斷標(biāo)志物。Shapira等［5］研究發(fā)現(xiàn)卵巢癌患者血漿和全血microRNA?30a?5p的表達(dá)量明顯下降。但是目前的研究僅僅局限于卵巢癌患者與正常健康者間的表達(dá)差異，研究不同分級(jí)、分期上皮性卵巢癌microRNA?30a?5p表達(dá)差異的報(bào)道不多。本研究通過檢測上皮性卵巢癌血漿中microRNA?30a?5p的水平，分析其與上皮性卵巢癌分級(jí)、分期的關(guān)系，為臨床醫(yī)生更好地診治上皮性卵巢癌提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 一般資料

收集2014年6月到2016年11月在我院住院病理檢查證實(shí)為上皮性卵巢癌患者111例，年齡38～71歲，平均（52.5±3.5）歲。所有患者術(shù)前均未接受化療、放療及免疫治療。病理分級(jí)為低級(jí)上皮性卵巢癌52例，高級(jí)上皮性卵巢癌59例；根據(jù)國際婦產(chǎn)科聯(lián)盟（International Federation of Gyne?cology and Obstetrics，F(xiàn)IGO）分期標(biāo)準(zhǔn)［6］：Ⅰ期 24例，Ⅱ期27例，Ⅲ期32例，Ⅳ期28例。另取同期健康女性體檢者20例作為對(duì)照，年齡36～69歲，平均（50.5±4.5）歲，兩組人群年齡差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

1.2 試劑與儀器

Roche總RNA提取試劑盒購于上海浩然生物技術(shù)有限公司，反轉(zhuǎn)錄試劑盒及實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒購于寶生物工程（大連）有限公司。microRNA?30a?5p與內(nèi)參U6上下游引物由廣州銳博生物有限公司完成。主要儀器：美國ABI7500實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀，德國Sigina 3K30高速冷凍離心機(jī)，美國熱電Multiskan go酶標(biāo)分析儀，日本三洋MDF?382E超低溫冰箱。

1.3 方法

1.2.1 標(biāo)本采集

靜脈采血3 mL，EDTA抗凝，4000 r/min離心15 min，取血漿放入干凈Eppendorf管中，在10℃13000 r/min離心5 min，去除細(xì)胞碎片，處理好的血漿于-80℃冰箱中保存，以備RNA提取，該步驟在2 h內(nèi)完成。

1.2.2 血漿總RNA提取

凍存的血漿標(biāo)本復(fù)溫，按照羅氏RNA提取試劑說明書提取血漿總RNA。Multiskan go酶標(biāo)分析儀檢測RNA純度及濃度，OD260與OD280比值在1.8～2.0滿足要求。

1.2.3 逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)

應(yīng)用TaKaRa反轉(zhuǎn)錄試劑盒中的特異性反轉(zhuǎn)錄引物并按照說明書逐步合成cDNA，反轉(zhuǎn)錄體系20 μL，反轉(zhuǎn)錄條件：37℃ 15 min，85℃ 5 s，4℃保存反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物。

1.2.4 real?time PCR 反應(yīng)

實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)體系為20 μL，具體包括 ：SYBR Premix Ex Tap 10 μL，PCR Forward Primer 0.8 μL，PCR Reverse Primer 0.8 μL，ROX Reference Dye 0.4 μL，RT 反應(yīng)液2 μL，dH2O 6 μL，反應(yīng)條件：95℃ 30 s；95℃ 5 s，60℃ 30 s，40 個(gè)循環(huán)。所有樣本做3個(gè)復(fù)孔。以U6為內(nèi)參照，采用相對(duì)定量法計(jì)算microRNA?30a?5p的相對(duì)表達(dá)量，以 2?ΔCt表示，ΔCt=CtmicroRNA?30a?5p?CtU6，Ct為每個(gè)反應(yīng)管中的熒光信號(hào)達(dá)到所設(shè)定閾值時(shí)所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

運(yùn)用SPSS 19.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，計(jì)量數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，兩組間比較采用t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 上皮性卵巢癌患者血漿中microRNA?30a?5p表達(dá)量下調(diào)

經(jīng)實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測，結(jié)果顯示上皮性卵巢癌患者血漿中microRNA?30a?5p明顯下降，為2.42±1.43，對(duì)照組為6.33±2.01，通過t檢驗(yàn)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。結(jié)果顯示，詳見圖1。

圖1 microRNA?30a?5p在上皮性卵巢癌患者及對(duì)照組中的表達(dá)Figure 1 Expression of microRNA?30a?5p in epithelial ovarian cancer patients and control group

2.2 不同分級(jí)上皮性卵巢癌患者血漿中microR?NA?30a?5p 表達(dá)量的比較

低級(jí)上皮性卵巢癌患者血漿中microRNA?30a?5p表達(dá)量為3.13±0.04，高級(jí)上皮性卵巢癌患者血漿中microRNA?30a?5p表達(dá)量為1.67±1.41，二者結(jié)果差異具有統(tǒng)計(jì)意義（P＜0.05）。結(jié)果顯示，詳見圖2。

2.3 上皮性卵巢癌患者血漿中microRNA?30a?5p與腫瘤分期的關(guān)系

不同分期microRNA?30a?5p值分別為TⅠ：3.98±0.36，TⅡ：3.78±0.97，TⅢ：1.88±0.21，TⅣ：0.15±0.13；隨著腫瘤分期惡性度的增加microRNA?30a?5p表達(dá)逐漸降低，各期患者血漿中microRNA?30a?5p間比較采用方差分析，TⅠ與TⅡ期上皮性卵巢癌患者血漿中microRNA?30a?5p表達(dá)量沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P=0.804），TⅠ與TⅢ期間、TⅠ與TⅣ期間、TⅡ與TⅢ期間、TⅡ與TⅣ期間、TⅢ與TⅣ期間上皮性卵巢癌患者血漿中microRNA?30a?5p表達(dá)量均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P值分別為0.031、0.019、0.038、0.023、0.045）。結(jié)果顯示，詳見圖3。

圖2 上皮性卵巢癌患者血漿中microRNA?30a?5p在不同分級(jí)的表達(dá)Figure 2 Expression of microRNA?30a?5p in different grading of ovarian cancer patients

圖3 上皮性卵巢癌患者血漿中microRNA?30a?5p在不同腫瘤分期的表達(dá)Figure 3 Expression of microRNA?30a?5p in different staging of ovarian cancer patients

3 討論

在全球，卵巢癌是女性死亡的第五大原因［1］，大部分原因在于缺乏對(duì)卵巢癌早期診斷有效的檢測手段。目前生存率低的一個(gè)重要因素是人們對(duì)該疾病的發(fā)生及發(fā)展機(jī)制尚不完全清楚，因此探索腫瘤的發(fā)病機(jī)制，尋找對(duì)腫瘤診斷敏感性及特異性高的標(biāo)志物顯得尤為重要。隨著近年miRNA在癌癥中的研究，有助于對(duì)癌癥發(fā)生發(fā)展的進(jìn)一步理解，為癌癥的早期診斷提供新的思路。目前超過1000多種miRNAs在人類基因中被發(fā)現(xiàn)。研究發(fā)現(xiàn)miRNA在癌癥的發(fā)生發(fā)展、血管再生及免疫反應(yīng)方面扮演著重要的角色［7］。2008年Law?rie首次測定血清中miRNA的表達(dá)后，越來越多科研者注重循環(huán)中miRNA在腫瘤中的診斷價(jià)值。miRNA作為新興標(biāo)志物受到重視，microRNA?30作為miRNA的一個(gè)成員，其也參與多種生物學(xué)功能的控制，如上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化、成骨細(xì)胞分化、腫瘤的發(fā)生發(fā)展等［8?9］。microRNA?30位于人類第1、6和8號(hào)染色體上，包括 microRNA?30a、microRNA?30b、microRNA?30c、microRNA?30d、microRNA?30e等主要成員。microRNA?30a?5p是由 microRNA?30a 5′端臂加工修飾而來，在多種惡性腫瘤中表達(dá)下降，扮演腫瘤抑制因子的作用，如microRNA?30a?5p在肺癌、肝癌、乳腺癌、前列腺癌、結(jié)腸癌、胰腺癌、胃癌及上皮性卵巢癌等腫瘤中表達(dá)明顯下降［10?13］。Taylor及Resnike等［14］研究證實(shí)卵巢癌患者外周血與癌組織中miRNA的表達(dá)未見明顯差異，以及外周血miRNA具有良好的穩(wěn)定性，從而提示血液中腫瘤來源的miRNA可以便捷、可靠地提供卵巢癌病灶中miRNA的實(shí)際水平。所有上述研究結(jié)果表明外周血microRNA?30a?5p的出現(xiàn)為上皮性卵巢癌的無創(chuàng)診斷提供了希望。本研究結(jié)果顯示上皮性卵巢癌患者血漿microRNA?30a?5p較正常對(duì)照組明顯降低，這與文獻(xiàn)報(bào)道一致［5］，但是目前的研究僅僅局限于卵巢癌患者與正常健康者間的表達(dá)差異，未對(duì)腫瘤分級(jí)與分期中的表達(dá)進(jìn)行研究，本研究進(jìn)一步深入研究，對(duì)上皮性卵巢癌進(jìn)行精確地分級(jí)及分期，具體到腫瘤病理分級(jí)以及Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ期，觀察microRNA?30a?5p是否與腫瘤病變程度有關(guān)。本研究結(jié)果表明，不同分級(jí)、分期上皮性卵巢癌血漿之間microRNA?30a?5p表達(dá)有差異，隨著腫瘤惡性度的升高，microRNA?30a?5p表達(dá)逐漸降低，尤其在Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ期間的降低幅度尤為明顯。因此血漿中microRNA?30a?5p的水平可作為上皮性卵巢癌患者的預(yù)后評(píng)價(jià)指標(biāo)。

研究證明miRNA通過與靶基因的結(jié)合共同發(fā)揮作用，實(shí)現(xiàn)對(duì)腫瘤發(fā)生發(fā)展的調(diào)控，文獻(xiàn)報(bào)道m(xù)icroRNA?30a?5p以MTDH/PTEN/AKT及AEG?1、PIK3D、Wnt/β?Catenin/BCL9等為作用靶點(diǎn)，調(diào)節(jié)癌細(xì)胞的生長及凋亡、侵襲與轉(zhuǎn)移及耐藥［13，15］。但是miRNA與靶基因間的連接也不是一對(duì)一的，一個(gè)miRNA可以與上百種靶基因結(jié)合發(fā)揮作用，一個(gè)mRNA可以被其它多種miRNAs調(diào)節(jié)。但本研究只是描述不同分期與分級(jí)上皮性卵巢癌血漿中microRNA?30a?5p的表達(dá)差異，沒有涉及microRNA?30a?5p作用靶點(diǎn)，因此，microRNA?30a?5p在上皮性卵巢癌中具體的分子作用機(jī)制還有待于進(jìn)一步研究。

綜上所述，血漿microRNA?30a?5p表達(dá)水平與上皮性卵巢癌分級(jí)、分期有關(guān)，可能是上皮性卵巢癌分期發(fā)生發(fā)展的重要因素，可作為一個(gè)重要的無創(chuàng)檢測指標(biāo)。但是miRNA的作用是眾多miRNA分子及靶基因共同調(diào)控完成的。因此，應(yīng)同時(shí)分析與其它上皮性卵巢癌特異性標(biāo)志物以及靶基因之間的相互關(guān)系，以便進(jìn)一步深入了解上皮性卵巢癌的發(fā)生機(jī)制，為疾病的診治提供理論依據(jù)和治療靶點(diǎn)，從而進(jìn)一步提高病人的生存率。

［1］ Siegel R，Ma JM，Zou ZH，et al.Cancer statistics，2014［J］.CA Cancer J Clin，2014，64（1）：9?29.

［2］ Jacobs IJ，Menon U.Progress and challenges in screen?ing for early detection of ovarian cancer［J］.Mol Cell Proteomics，2004，3（4）：355?366.

［3］ Ambros V.The functions of animal microRNAs［J］.Nature，2004，431（7006）：350?355.

［4］ Croset M，Kan C，Clézardin P.Tumour?derived miR?NAs and bone metastasis［J］.Bonekey Rep，2015，4：688.

［5］ Shapira I，Oswald M，Lovecchio J，et al.Circulating biomarkers for detection of ovarian cancer and predict?ing cancer outcomes［J］.Br J Cancer，2014 ，110（4）：976?983.

［6］ Prat J，F(xiàn)IGO Committee on Gynecologic Oncology.Staging classification for cancer of the ovary，fallopian tube，and peritoneum［J］.Int J Gynaecol Obstet，2014，124（1）：1?5.

［7］ 方堅(jiān)鴻，熊玉娟，莊詩美.MicroRNA與腫瘤血管生成［J］.中國科學(xué)（C輯：生命科學(xué)），2009，39（1）：58?63.

［8］ Fu J，Xu X，Kang L，et al.miR?30a suppresses breast cancer cell proliferation and migration by targeting Eya2［J］.Biochem Biophys Res Commun，2014，445（2）：314?319.

［9］ Li WF，Dai H，Ou Q，et al.Overexpression of mi?croRNA?30a?5p inhibits liver cancer cell proliferation and induces apoptosis by targeting MTDH/PTEN/AKT pathway［J］.Tumour Biol，2015，21：1?11.

［10］ He R，Yang L，Lin X，et al.MiR?30a?5p suppresses cell growth and enhances apoptosis of hepatocellular carcinoma cells via targeting AEG?1［J］.Int J Clin Exp Pathol，2015，8（12）：15632?15641.

［11］ Ouzounova M，Vuong T，Ancey PB，et al.MicroR?NA miR?30 family regulates non?attachment growth of breast cancer cells［J］.BMC Genomics，2013，14：139.

［12］ Shi XB，Tepper CG.MicroRNAs and prostate cancer［J］.Journal of cellular and molecular medicine，2008（5a）：1456?1465.

［13］ Baraniskin A，Birkenkamp?Demroder K，Maghnouj A，et al.MiR?30a?5p suppresses tumor growth in co?lon carcinoma by targeting DTL［J］.Carcinogenesis，2012，33（4）：732?739.

［14］ Iorio MV，Visone R，Di Leva G，et al.MicroRNA signatures in human ovarian cancer［J］.Cancer Res，2007，67：8699?8707.

［15］ Zhao JJ，Lin J，Zhu D，et a1.miR?30?5p functions as a tumor suppressor and novel therapeutic tool by target?ing the oncogenic Wnt/b?Catenin/BCL9 Pathway［J］.Cancer Res，2014，74：1801?1813.

Relationship between plasma microRNA?30a?5p content and grading and staging in epithelial ovarian cancer

XU Wenli，LIN Yanhua，LUO Yi，LI Kang，ZHANG Hongde★
（Central Laboratory of Longgang Center Hospital，Shenzhen，Guangdong，China，518116）

Objective To investigate the relationship between plasma microRNA?30a?5p level and grading and staging of ovarian cancer,and to explore the diagnostic significance for epithelial ovarian cancer.Methods A total of 111 cases of patients with epithelial ovarian cancer were recruited,52 cases of patients with pathological grading for low?grade epithelial ovarian cancer,59 case for advanced epithelial ovarian cancer.The patients were divided into 4 groups:stageⅠ(24 cases),Ⅱ(27cases),Ⅲ (32 cases)andⅣ(28 cases),according to the International Federation of Gynecology and Obstetrics(FIGO).20 healthy female subjects were served as controls.The expression of microRNA?30a?5p in plasma was detected by quantitative real?time PCR,and the relationship between the expression of microRNA?30a?5p and the grading and staging of epithelial ovarian cancer was analyzed. Results Compared with the normal control group,microRNA?30a?5p in the plasma of patients with epithelial ovarian cancer was significantly decreased(P＜0.05).The expression of microRNA?30a?5p in patients with advanced epithelial ovarian cancer was significantly lower than that in low ?grade ovarian cancer(P＜0.05).With the malignant degree of tumor staging increased,the relative expression of microRNA?30a?5p decreased among the other groups(P＜0.05),except stageⅠandⅡ (P＞0.05).Conclusion The expression of microRNA?30a?5p is related to the occurrence,development and malignant degree of epithelial ovarian cancer,which may served as a novel diagnostic marker,and be used as a therapeutic target for the treatment of epithelial ovarian cancer.

Epithelial ovarian cancer;MicroRNA;Plasma;Quantitative real?time PCR

深圳市龍崗中心醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室，廣東，深圳518116

★通訊作者：張洪德，E?mail：labzhd@126.com