周萍 楊柳 李金潔 王曉琴

HCV RNA水平與HCV基因型別的相關(guān)性研究

周萍1★楊柳2李金潔2王曉琴1

目的 探討丙型肝炎病毒（hepatitis C virus，HCV）載量水平與HCV基因型別的相關(guān)性。方法 選取255例丙型肝炎患者，采用實(shí)時(shí)熒光定量逆轉(zhuǎn)錄PCR（reverse transcription quantitative real time PCR，RT?qPCR）檢測HCV病毒載量水平，采用PCR?反向點(diǎn)雜交法（polymerase chain reaction?reverse dot blot，PCR?RDB）進(jìn)行HCV基因分型檢測。 結(jié)果 255例樣本中，PCR?RDB法成功分型的246例（96.47%），未明確分型的9例（3.53%）；其中，1b型121例（47.45%），2a型107例（41.96%），3a型16例（6.27%），3b型6例（2.35%），6a型5例（1.96%）；5種HCV基因亞型中3b型和6a型病毒載量較高，顯著高于其他3個(gè)亞型（P＜0.05）。 結(jié)論 采用PCR?RDB法進(jìn)行HCV基因分型時(shí)需參考樣本定量結(jié)果，低病毒載量會(huì)影響基因分型成功率；HCV RNA水平與HCV基因型別可能具有相關(guān)性。

丙型肝炎病毒；PCR?反向點(diǎn)雜交法；基因型；病毒載量

丙型肝炎病毒（hepatitis C virus，HCV）感染嚴(yán)重危害人類的健康。全世界約有1.7億人受到HCV的感染［1］，我國更是一個(gè)HCV感染大國。丙型肝炎病毒感染可導(dǎo)致肝臟發(fā)生炎癥壞死和纖維化，部分丙型肝炎患者可以發(fā)展為肝硬化甚至肝癌，給社會(huì)和家庭帶來沉重負(fù)擔(dān)［2］。HCV基因型分布具有明顯的地域差異性和人群差異性，不同基因型病毒生物學(xué)特性不同，對(duì)藥物的反應(yīng)敏感性也不同。因此，HCV基因分型對(duì)丙型肝炎患者的診斷和治療至關(guān)重要。丙型肝炎病毒基因分型方法很多，直接測序法是“金標(biāo)準(zhǔn)”，但操作費(fèi)時(shí)費(fèi)力，檢測周期長、成本高，對(duì)醫(yī)院人力、物力和財(cái)力要求嚴(yán)格，并不利于臨床廣泛使用。PCR與反向斑點(diǎn)雜交技術(shù)相結(jié)合的方法，在以往的HCV基因分型檢測中表現(xiàn)出較好的特異性和準(zhǔn)確性［3］，且操作簡便、高效、經(jīng)濟(jì)，中小型醫(yī)院即可實(shí)現(xiàn)檢測，利于丙肝分型檢測的普及。但其分型結(jié)果往往受到HCV RNA水平的限制，本研究基于PCR?反向點(diǎn)雜交法（polymerase chain reaction?reverse dot blot，PCR?RDB）探討了HCV RNA水平對(duì)HCV基因分型效果的影響，并分析了HCV基因型別與HCV核酸水平的相關(guān)性，為丙型病毒性肝炎的治療及其疫苗研制提供科學(xué)依據(jù)。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象

2015年1月至2016年12月間來自西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院和西京醫(yī)院住院及門診就診的丙型肝炎病毒感染患者255份標(biāo)本，其中男性105份，女性150份，年齡16～83歲，平均年齡（48.21±13.65）歲?；颊咴\斷均符合中華醫(yī)學(xué)會(huì)肝病學(xué)分會(huì)和感染病學(xué)分會(huì)聯(lián)合發(fā)布的中國《丙型肝炎防治指南（2015年更新版）》中的診斷標(biāo)準(zhǔn)［4］。

1.2 試劑及儀器

丙型肝炎病毒實(shí)時(shí)熒光定量試劑盒（RT?qP?CR法）和丙型肝炎病毒基因分型檢測試劑盒（PCR?RDB），由中山大學(xué)達(dá)安基因股份有限公司生產(chǎn)。儀器包括美國ABI 7500型熒光定量PCR儀，德國Hermle Z216 MK微量高速冷凍型離心機(jī)，杭州奧盛儀器有限公司生產(chǎn)的干式恒溫器，常州菲普實(shí)驗(yàn)儀器廠生產(chǎn)的電熱恒溫振蕩水槽。1.3 HCV RNA定量與HCV基因分型

1.3.1 血漿HCV總RNA提取

用EDTA抗凝采血管抽取受檢者靜脈血4 mL，1500 r/min離心2 min，吸取上層血漿200 μL用于RNA的制備。取滅菌的1.5 mL離心管，加入 50 μL 蛋白酶 K，取 200 μL 血漿，再加入200 μL病毒裂解液（已含Carrier RNA，主要成分為 Triton X?100），振蕩混勻，高速離心 10 s，72℃放置 10 min，最后加洗脫液 50 μL（72℃預(yù)熱），備用。

1.3.2 HCV RNA定量擴(kuò)增

參照中山大學(xué)達(dá)安基因股份有限公司生產(chǎn)的丙型肝炎病毒實(shí)時(shí)熒光定量試劑盒（RT?qPCR法）說明書操作要求和ISO15189實(shí)驗(yàn)室操作程序進(jìn)行反應(yīng)體系的操作，體系完成后在ABI 7500型實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀上檢測標(biāo)本中的HCV RNA載量。

1.3.3 反轉(zhuǎn)錄 PCR（reverse transcription PCR，RT?PCR）分型擴(kuò)增

按照中山大學(xué)達(dá)安基因股份有限公司丙型肝炎病毒基因分型檢測試劑盒（PCR?RDB）的說明書進(jìn)行 RT?PCR 擴(kuò)增。擴(kuò)增總體系 50 μL：酶系、引物、PCR buffer混合液20 μL，1.3.1中RNA 提取液30 μL（待測標(biāo)本及陰、陽性質(zhì)控品），兩者混合后瞬時(shí)離心，將反應(yīng)管放入PCR儀，按下列條件擴(kuò)增：50℃逆轉(zhuǎn)錄 25 min；95℃預(yù)變性 15 min；94℃30 s、55℃ 40 s、72℃ 45 s，共 45 次循環(huán)；72℃延伸7 min。PCR產(chǎn)物可直接進(jìn)行雜交反應(yīng)，或置于4℃短期保存，或置于?20℃長期凍存。

1.3.4 雜交反應(yīng)及結(jié)果判讀

嚴(yán)格按照中山大學(xué)達(dá)安基因股份有限公司生產(chǎn)的丙型肝炎病毒基因分型檢測試劑盒中雜交反應(yīng)說明書進(jìn)行。其步驟包括預(yù)雜交、雜交、洗膜、顯色、結(jié)果判讀。HCV基因分型雜交膜條上共12個(gè)位點(diǎn)，其中位點(diǎn)G1～G10為各型別檢測探針，PC為擴(kuò)增控制點(diǎn)，CC為顯色控制點(diǎn)，位點(diǎn)排列如圖1所示。根據(jù)說明書要求，可將CC點(diǎn)、PC點(diǎn)和各型別位點(diǎn)cut off值預(yù)設(shè)在分析軟件中，分析結(jié)束后由軟件自動(dòng)生成各位點(diǎn)信號(hào)值、陰陽性和相應(yīng)的HCV型別；也可參照結(jié)果分析表肉眼進(jìn)行結(jié)果判讀，HCV基因型常見結(jié)果分析表見表1。患者HCV型別均由肉眼判讀所得。

圖1 HCV基因分型雜交膜條位點(diǎn)排列Figure 1 Sequencing of hybridization membrane strip sites of HCV genotyping

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

所有數(shù)據(jù)采用SPSS 16.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料應(yīng)用方差分析，計(jì)數(shù)資料用χ2檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表1 HCV基因分型常見結(jié)果分析表Table 1 Analysis of major HCV genotypes

2 結(jié)果

2.1 HCV RNA定量檢測

對(duì)255例所選患者標(biāo)本進(jìn)行HCV RNA定量檢測，病毒載量為103～108IU/mL。其中103IU/mL 15例，104IU/mL 67例，105IU/mL 82例，106IU/mL 66例，107IU/mL 24例，＞108IU/mL 1例，定量結(jié)果滿足HCV基因分型要求。

2.2 HCV基因分型結(jié)果

255例樣本中，PCR?RDB法成功分型246例，分型率為96.47%（246/255），9例不能明確分型的樣本經(jīng)直接測序法明確分型結(jié)果。HCV基因分型結(jié)果為：1b型121份，占47.45%；2a型107份，占41.96%；3a型 16份，占 6.27%；3b型 6份，占2.35%；6a型5份，占1.96%。

2.3 HCV核酸水平與PCR?RDB法HCV基因分型成功率的相關(guān)性

將255例樣本按不同病毒載量水平進(jìn)行分組，觀察不同病毒載量時(shí)PCR?RDB法HCV基因分型成功率，結(jié)果見表2。9例未成功分型的樣本包括：103IU/mL 2例，分別為1b型和6a型；104IU/mL 2例，均為3a型；105IU/mL 2例，均為2a型；106IU/mL 1例，均為 2a型；107IU/mL 2例，分別為2a型和6a型。核酸水平在103IU/mL（PCR?RDB法基因分型載量要求臨界值）時(shí)分型成功率最低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.4 HCV RNA核酸水平與HCV基因型別相關(guān)性

對(duì)5種基因亞型的患者病毒載量水平進(jìn)行統(tǒng)計(jì)與分析，如表3所示。結(jié)果顯示，HCV 1b型的平均病毒載量最低，為（5.42±0.97）log IU/mL，3b型的平均病毒載量最高，為（5.76±0.73）log IU/mL。對(duì)5組亞型病毒載量進(jìn)行單因素方差分析（one?way ANOVA），發(fā)現(xiàn)5種基因亞型之間病毒載量存在顯著差異（F=2.793，P＜0.05）。再采用Tukey?test法進(jìn)行兩兩比較（表4），發(fā)現(xiàn)3b型和6a型患者病毒載量顯著高于其他3個(gè)亞型。

3 討論

HCV是一種單股線性正鏈RNA黃病毒，最初于1975年在一名輸血后的患者血清中被發(fā)現(xiàn)［5］。1989年Michael等首次克隆其基因組，并命名本病及其病毒分別為丙型肝炎和丙型肝炎病毒［6］。HCV感染是一個(gè)世界性的健康問題，其致病性強(qiáng)，且較易轉(zhuǎn)為慢性，導(dǎo)致肝臟慢性炎癥壞死和纖維化，并可發(fā)展為肝硬化和肝細(xì)胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）。

表2 HCV核酸水平與PCR?RDB法分型成功率Table 2 The success ratios of HCV genotyping by PCR?RDB among different viral loads

表3 HCV不同基因型患者平均病毒載量（x±s）Table 3 Patients'average viral loads among different genotypes of HCV（x±s）

表4 HCV不同基因亞型患者平均病毒載量的兩兩比較Table 4 Pairwise comparison of the viral loads between different genotypes of HCV

HCV基因型具有高度異質(zhì)性。根據(jù)Sim?monds［7］建議，利用核酸測序和進(jìn)化樹分析結(jié)果，將HCV分為6種主要的基因型（用數(shù)字1～6表示）和100多個(gè)基因亞型（用小寫英文字母表示）。HCV基因型分布具有明顯地域差異，我國常見的丙肝病毒基因型為1b和2a，6a型主要見于香港和澳門地區(qū)［8］。本研究的患者多來自中國北方地區(qū)，結(jié)果表明仍以1b型和2a型為主，其他型別所占比例很少，這與以往的報(bào)道基本一致［9］。以往報(bào)道顯示，不同基因型別的臨床表現(xiàn)和治療效果也不同［10?11］，深入 HCV 基因分型的研究，對(duì)丙型肝炎嚴(yán)重程度的評(píng)估以及抗病毒藥物敏感性的預(yù)測具有重要意義［12］。1型HCV感染無論在干擾素治療或口服抗病毒藥物治療中均較難獲得病毒學(xué)持續(xù)應(yīng)答（sustained virologic response，SVR），且預(yù)后效果較其他型別欠佳［13?14］。蔣玲麗等人［12］研究發(fā)現(xiàn)，患者體內(nèi)抗HCV水平和HCV的基因型別有關(guān)，1b、2a、6a型患者抗體濃度分布均勻，1a型患者的抗體濃度相對(duì)較高，3b型的患者的抗HCV水平相對(duì)較低。由此猜想可能機(jī)體對(duì)3b型HCV的中和作用較弱，其病毒核酸水平較高。本文研究發(fā)現(xiàn)，HCV基因型別和病毒核酸水平具有相關(guān)性，且3b型的患者的病毒核酸水平明顯高于1b型、2a型及3a型患者病毒核酸水平，這與蔣玲麗等人［12］的發(fā)現(xiàn)具有一致性。不同病毒基因型在患者體內(nèi)的核酸水平具有差異，是不同丙肝病毒基因型別在患者體內(nèi)的抗體應(yīng)答機(jī)制有差異的另一個(gè)體現(xiàn)［15］，抗體中和能力強(qiáng)，其對(duì)應(yīng)型別的病毒增殖受到抑制，因此其核酸水平則較低；排除中和抗體的影響，不同型別的病毒本身的增殖是否有差異還需要進(jìn)一步研究和探索。由于本研究中部分型別標(biāo)本量較少，相關(guān)性需要更大標(biāo)本量的研究證實(shí)。

目前用于HCV基因分型的方法較多，包括全基因組直接測序分析法、序列特異性引物擴(kuò)增法（polymerase chain reaction?sequence specific prim?ers，PCR?SSP）、限制性片段長度多態(tài)性分析法（re?striction fragment length polymorphism，RELP）、序列特異性核酸探針雜交法（PCR sequence specific oligonueleotide，PCR?SSO）、PCR?反向點(diǎn)雜交法等。全基因組直接測序分析法，是目前HCV基因分型方法中最經(jīng)典、最準(zhǔn)確的方法，分型結(jié)果最為可靠，是HCV基因分型的“金標(biāo)準(zhǔn)”。但此法耗時(shí)、費(fèi)力且昂貴，并不適合所有的實(shí)驗(yàn)室使用［16］。PCR?SSP 法是較早普遍使用的方法，由于每份樣品需同時(shí)進(jìn)行多次檢測才能最終確定基因型，因此操作繁瑣檢測周期長，使其臨床應(yīng)用受到限制［17］。RELP法是經(jīng)PCR擴(kuò)增靶基因后，用多種特定的限制性內(nèi)切酶對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行酶切，不同的基因型或亞型就可以得到長度大小不同的酶切片段，根據(jù)酶切后電泳所表現(xiàn)的片段大小及多態(tài)性進(jìn)行HCV基因分型，該方法具有快速、經(jīng)濟(jì)等優(yōu)點(diǎn)，但僅用少數(shù)幾個(gè)內(nèi)切酶，檢測基因型別有限［18］。PCR?SSO法是利用RT?PCR擴(kuò)增HCV基因片段，將擴(kuò)增產(chǎn)物與膜上特異性探針雜交，經(jīng)顯色反應(yīng)后實(shí)現(xiàn)HCV基因分型。該方法操作比較簡便，但價(jià)格昂貴，不宜在實(shí)驗(yàn)室廣泛推廣應(yīng)用［19］。PCR?RDB法，是通過將生物素或熒光素標(biāo)記型特異性探針固相化在尼龍膜上，再與RT?PCR擴(kuò)增的病毒產(chǎn)物進(jìn)行雜交后，最終經(jīng)肉眼判讀出HCV基因型的分型方法。該方法特異性和準(zhǔn)確性高，且不需要昂貴復(fù)雜的儀器設(shè)備，易于在臨床廣泛開展［3，20］。但 PCR?RDB 法對(duì) HCV 核酸水平要求較高，尤其在PCR?RDB法基因分型載量要求臨界值時(shí)，分型效果和結(jié)果均受到影響。本文對(duì)255份HCV?RNA檢測陽性的患者進(jìn)行HCV基因分型，PCR?RDB法的分型成功率為96.47%，對(duì)9份PCR?RDB法未能明確分型的標(biāo)本，采用直接測序分析法檢測均分型成功，表明測序法為HCV基因分型金標(biāo)準(zhǔn)。因此，臨床上對(duì)PCR?RDB法分型效果較差或者不能成功分型的樣本，建議進(jìn)行測序法驗(yàn)證，以確保結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性。

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Study on the correlation between HCV RNA level and HCV genotypes

ZHOU Ping1★，YANG Liu2，LI Jinjie2，WANG Xiaoqin1
（1.Department of Clinical Laboratory，the First Affiliated Hospital of Xi'an Jiaotong University，Xi'an，Shanxi，China，710061；2.Department of Clinical Laboratory，Xijing Hospital，F(xiàn)ourth Military Medical University，Xi'an，Shanxi，China，710032）

Objective To investigate the correlation between the HCV?RNA load and viral genotype. Methods 255 serum samples of chronic hepatitis C patients were collected.HCV RNA load were detected by RT?qPCR；HCV genotypes were detected with PCR?RDB. Results Of all 255 cases，96.47%（246/255）was typed successfully by PCR?RDB，but 3.53%（9/255）was not.121 cases（47.45%）were genotype 1b，107 cases（41.96%）were genotype 2a，16 cases（6.27%）were genotype 3a，6 cases（2.35%）were genotype 3b，5 cases（1.96%）were genotype 6a.Interestingly,the genotypes of HCV 3b and 6a had higher HCV?RNA load，compared to other genotypes(P＜0.05).Conclusion When the PCR ?RDB method was used for HCV genotyping,the quantitative results of the reference sample are required.The low viral load can affect the success rate of genetyping,suggesting the level of HCV RNA may be correlated with HCV genotypes.

Hepatitis C virus；PCR?RDB；Genotypes；Virus load

1.西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科，陜西，西安7100612.空軍軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院檢驗(yàn)科，陜西，西安710032

★通訊作者：周萍，E?mail：Zhouping_xa@163.com