尚獻(xiàn)會(huì) 李建國 范振海 兌丹華

(遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院小兒普胸泌外科，貴州 遵義 563003)

清胰Ⅱ號(hào)對重癥急性胰腺炎大鼠胰腺及腸組織中MCP-1表達(dá)的影響

尚獻(xiàn)會(huì) 李建國1范振海2兌丹華3

(遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院小兒普胸泌外科，貴州 遵義 563003)

目的探究清胰Ⅱ號(hào)對重癥急性胰腺炎(SAP)大鼠胰腺及腸組織中單核細(xì)胞趨化蛋白(MCP)-1表達(dá)及細(xì)胞凋亡的影響。方法將36只大鼠隨機(jī)分為對照組、模型組、模型+清胰Ⅱ號(hào)組，每組12只，對照組正常飼養(yǎng)，其余各組采用膽胰管逆行注射?；悄懰徕c0.1 ml/100 g的方法建立SAP模型，模型+清胰Ⅱ號(hào)組造模后給予清胰Ⅱ號(hào)10 ml/kg。造模后12、24 h隨機(jī)選取7只大鼠采樣，比較各組腹水量、胰腺和回腸病理學(xué)變化，判斷造模是否成功。酶聯(lián)免疫吸附測定法(ELISA)檢測血清MCP-1、白細(xì)胞介素(IL)-10、二胺氧化酶(DAO)、血清淀粉酶(AMY)活力。實(shí)時(shí)定量PCR(qRT-PCR)檢測胰腺及腸組織中MCP-1 mRNA表達(dá)情況。流式細(xì)胞術(shù)檢測胰腺細(xì)胞的凋亡率。結(jié)果模型組大鼠腹內(nèi)血性腹水及胰腺壞死顯著高于對照組，表明造模成功。造模后12、24 h，模型+清胰Ⅱ號(hào)組大鼠血性腹水、血清MCP-1、IL-10、DAO、AMY活力及胰腺、回腸組織中MCP-1 mRNA的表達(dá)顯著低于模型組(Plt;0.05)；與對照組相比，模型組及模型+清胰Ⅱ號(hào)組胰腺細(xì)胞的凋亡率顯著增加，且模型+清胰Ⅱ號(hào)組SAP顯著高于模型組(Plt;0.05)。結(jié)論清胰Ⅱ號(hào)可下調(diào)炎癥因子MCP-1、IL-10表達(dá)，降低DAO、AMY活力，促進(jìn)胰腺細(xì)胞凋亡，對重癥急性胰腺炎大鼠胰腺及腸組織具有良好的修復(fù)和保護(hù)作用。

清胰Ⅱ號(hào)；重癥急性胰腺炎；二胺氧化酶；單核細(xì)胞趨化蛋白-1

重癥急性胰腺炎(SAP)是一種臨床常見的急性炎癥性疾病，主要發(fā)生在胰腺組織，可由多種原因引起〔1〕。SAP患者常伴發(fā)急性肺損傷、急性呼吸窘迫綜合征、全身炎癥反應(yīng)綜合征等，易導(dǎo)致腸黏膜損傷及功能障礙，與多種炎癥介質(zhì)如白細(xì)胞介素(IL)-10、單核細(xì)胞趨化蛋白(MCP)-1瀑布樣級(jí)聯(lián)反應(yīng)密切相關(guān)〔2〕。目前，臨床診斷和治療水平取得了較大的進(jìn)步，但SAP患者的死亡率仍達(dá)30%～50%〔3〕。清胰Ⅱ號(hào)是一種由梔子、木香、赤芍、大黃、芒硝等制成的中藥復(fù)方制劑，具有疏肝清熱，殺蟲驅(qū)蛔的功效。研究表明清胰Ⅱ號(hào)顆粒劑能夠減輕SAP早期的損傷反應(yīng)，保護(hù)胰臟、腎臟、腸道功能〔4～7〕。研究發(fā)現(xiàn)，清胰Ⅱ顆粒劑能夠抑制胰臟出血、壞死和并發(fā)多器官功能障礙綜合征的發(fā)生，對組織細(xì)胞起保護(hù)功能〔8〕。本文利用SAP模型大鼠，探究清胰Ⅱ號(hào)對其胰腺及腸組織中IL-10、MCP-1、細(xì)胞凋亡等的影響及其作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)主要試劑和器材 ?；悄懰徕c購自美國Sigma公司；10%水合氯醛、清胰Ⅱ號(hào)顆粒劑購自遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院；烏拉坦購自武漢勝天宇生物科技有限公司；MCP-1、IL-10、二胺氧化酶(DAO) 酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)檢測試劑盒購自南京建成科技有限公司；血清淀粉酶(AMY)試劑盒購自上海滬震實(shí)業(yè)有限公司；Trizol試劑、反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自大連TaKaRa公司，細(xì)胞凋亡檢測試劑盒購自美國Sigma公司。BX51-P偏光顯微鏡購自上海巴玖實(shí)業(yè)有限公司，定量PCR儀購自瑞士Roche公司，流式細(xì)胞儀購自美國Beckman Coulter公司。

1.2實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與SAP大鼠模型的建立 36只SPF級(jí)SD大鼠購自重慶第三軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，8～12周齡，體質(zhì)量(200.39±40.39)g，雌雄各半。動(dòng)物飼養(yǎng)在溫度22℃～25℃、濕度55%～60%的環(huán)境中，自由飲食和飲水。實(shí)驗(yàn)隨機(jī)分為對照組、模型組、模型+清胰Ⅱ號(hào)組。實(shí)驗(yàn)干預(yù)前禁食12 h。參考康新等〔9〕的建模方法，模型組、模型+清胰Ⅱ號(hào)組大鼠采取膽胰管逆行給予牛磺膽酸鈉0.1 ml/100 g建立SAP模型，對照組給予等量的生理鹽水。造模后24 h注射10%水合氯醛0.3 ml/100 g處死，蘇木素-伊紅(HE)染色并記錄大鼠腹水量，光鏡下觀察胰腺、回腸病理形態(tài)學(xué)變化判斷造模是否成功。

1.3藥物干預(yù) 模型+清胰Ⅱ號(hào)組大鼠造模后給予清胰Ⅱ號(hào)顆粒劑10 ml/kg，6 h重復(fù)灌胃1次，共3次。對照組與模型組在相同時(shí)間給予等量生理鹽水灌胃。

1.4檢測血清中MCP-1、IL-10、DAO、AMY水平的變化 造模后12、24 h，各組隨機(jī)選取6只大鼠，采用0.5 ml/100 g 20%烏拉坦麻醉，原切口入腹，下腔靜脈取血5 ml，室溫靜置30 min，待出現(xiàn)淡黃色液體時(shí)，2 000 r/min離心15 min，取上清液置于EP管，根據(jù)ELISA檢測試劑盒說明書檢測各組大鼠血清MCP-1、IL-10、DAO、AMY水平。

1.5檢測胰腺和回腸組織MCP-1 mRNA表達(dá)量 采用實(shí)時(shí)定量PCR(qRT-PCR)檢測胰腺和回腸組織MCP-1 mRNA表達(dá)情況。MCP-1基因的引物由上海生工生物有限公司合成，上游序列為5′-CACGTCGTAGCAAACCACCAA-3′，下游序列為5′-GTTGGTTGTCTTTGAGATCCA-3′。造模后12、24 h后取部分胰腺、回腸組織置于液氮中。加入1 ml Trizol提取胰腺和回腸組織中的總RNA并以根據(jù)逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書將所提取RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，GAPDH為參照，采用20 μl體系進(jìn)行擴(kuò)增。擴(kuò)增條件為預(yù)變性94℃ 60 s，94℃ 10 s，54℃ 10 s，72℃ 10 s，50個(gè)循環(huán)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，采用2-ΔΔCt定量分析方法計(jì)算MCP-1 mRNA相對表達(dá)量。

1.6檢測大鼠胰腺細(xì)胞凋亡率 將所取部分胰腺組織置于平

皿中，加入磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗干凈，將胰腺組織剪成小塊后勻漿，使用200目尼龍網(wǎng)過濾，125 r/min離心5 min，PBS清洗3次，300目尼龍網(wǎng)過濾后，500 r/min離心5 min，收集細(xì)胞。加入100 μl 1×膜聯(lián)蛋白-V(Annexin V)緩沖液懸浮細(xì)胞，加入5 μl Annexin V-FITC和10 μl碘化丙啶(PI)，輕輕振蕩混勻，室溫避光反應(yīng)10～15 min，加入400 μl 1×Annexin V緩沖液，混勻后置于流式細(xì)胞儀中1 h內(nèi)檢測細(xì)胞的早期凋亡率。

1.7統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS21.0軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)、單因素方差分析。

2 結(jié) 果

2.1觀察小鼠基本外觀和胰腺、回腸病理形態(tài)學(xué)變化 造模后12、24 h，與對照組相比，模型組、模型+清胰Ⅱ號(hào)組大鼠血性腹水體積顯著增加；模型+清胰Ⅱ號(hào)組〔(4.85±0.58)ml,(3.02±0.31)ml〕顯著低于模型組〔(8.20±1.03)ml、(9.11±1.13)ml〕(Plt;0.05)。

對照組胰腺、回腸組織基本正常，模型組大鼠回腸出現(xiàn)明顯水腫、間質(zhì)血管充血、出血及中性粒細(xì)胞浸潤，胰腺小葉結(jié)構(gòu)紊亂，細(xì)胞腫脹、壞死、出血；模型+清胰Ⅱ號(hào)組大鼠回腸、胰腺組織結(jié)構(gòu)較為完整，壞死病灶、間質(zhì)血管充血現(xiàn)象較輕，周圍有少量中性粒細(xì)胞浸潤，提示造模成功。見圖1。

圖1 造模后12、24 h三組大鼠胰腺光鏡HE染色(×400)

2.2檢測血清中IL-10、DAO、AMY水平 與對照組相比，模型組、模型+清胰Ⅱ號(hào)組大鼠在12、24 h時(shí)間點(diǎn)血清IL-10、DAO、AMY活力水平顯著增高(Plt;0.05)；與模型組相比，模型+清胰Ⅱ號(hào)組均顯著降低(Plt;0.05)。隨著時(shí)間的延長，模型組均逐漸升高，但模型+清胰Ⅱ號(hào)組均逐漸降低。見表1。

表1 檢測大鼠血清中IL-10、DAO、AMY水平

與對照組比較：1)Plt;0.05;與模型組比較：2)Plt;0.05；下表同

2.3大鼠血清、胰腺及腸組織中MCP-1表達(dá)量的變化 與對照組相比，模型組、模型+清胰Ⅱ號(hào)組大鼠血清MCP-1蛋白和胰腺及回腸組織MCP-1 mRNA的表達(dá)量均顯著增加(Plt;0.05)；模型+清胰Ⅱ號(hào)組均顯著低于模型組(Plt;0.05)。隨著時(shí)間的延長，模型組均逐漸升高，但模型+清胰Ⅱ號(hào)組均逐漸降低。見表2。

表2 大鼠血清、胰腺及腸組織中MCP-1表達(dá)量的變化

2.4大鼠胰腺細(xì)胞凋亡率的檢測 造模后12、24 h，模型組、模型+清胰Ⅱ號(hào)組大鼠胰腺細(xì)胞凋亡率顯著高于對照組(Plt;0.05)；與模型組相比，模型+清胰Ⅱ號(hào)組顯著增加(Plt;0.05)。見表3。

表3 大鼠胰腺細(xì)胞凋亡率的檢測

3 討 論

SAP患者體內(nèi)胰腺自身防御機(jī)制障礙，導(dǎo)致胰管阻塞，大量胰酶分泌，誘發(fā)胰酶消化自身周圍組織，引起局部或全身的炎癥反應(yīng)，甚至使全身多器官發(fā)生損傷。多種炎性因子參與SAP的發(fā)生、發(fā)展，發(fā)生瀑布樣級(jí)聯(lián)反應(yīng)。IL-10是一種內(nèi)源性免疫抑制因子，由Th細(xì)胞分泌產(chǎn)生，能夠抑制多種細(xì)胞合成其他細(xì)胞因子，抑制SAP患者胰腺組織中的IL-10的表達(dá)量可減輕炎癥反應(yīng)，對胰臟具有保護(hù)作用。SAP患者隨著病情的減輕，致炎-抗炎因子出現(xiàn)平衡，炎癥反應(yīng)減輕，IL-10水平降低〔10〕。MCP-1是主要的單核/巨噬細(xì)胞趨化因子，能夠調(diào)節(jié)單核/巨噬細(xì)胞分泌量，誘發(fā)炎癥反應(yīng)，參與疾病的演進(jìn)過程。研究表明，MCP-1水平與細(xì)胞的損傷程度、局部并發(fā)癥、病理損害評(píng)分、疾病的嚴(yán)重程度等呈正相關(guān)〔11〕。本實(shí)驗(yàn)表明炎癥反應(yīng)和炎癥因子在SAP的發(fā)生、發(fā)展中起著重要作用。清胰Ⅱ號(hào)可以降低炎癥因子的水平，從而降低炎癥反應(yīng)，延緩SAP進(jìn)程。

腸道是全身的炎癥反應(yīng)的原動(dòng)力，能夠合成諸多炎癥介質(zhì)，SAP發(fā)生時(shí)患者出現(xiàn)胰腺壞死和胰外器官衰竭，阻礙腸道屏障功能，加劇炎癥反應(yīng)〔12，13〕。外周血中DAO活性能反映腸上皮細(xì)胞成熟度及完整性，可作為腸黏膜屏障功能監(jiān)控的主要指標(biāo)〔14，15〕。AMY是臨床診斷中用于檢測SAP的常用指標(biāo)，AMY含量的高低與胰腺炎的發(fā)生有密切關(guān)系〔16〕。臨床上通過檢測血清中AMY的活性能夠評(píng)價(jià)SAP的病情變化〔17，18〕。本研究結(jié)果表明，清胰Ⅱ號(hào)可以減輕腸黏膜損傷，進(jìn)而緩解SAP大鼠的嚴(yán)重程度。

細(xì)胞凋亡是一種程序性死亡方式，可減輕炎癥反應(yīng)，被認(rèn)為具有保護(hù)SAP的作用，對SAP病程的進(jìn)展具有重要作用。研究表明，增加胰腺細(xì)胞的凋亡率，減少細(xì)胞的壞死率可阻礙胰腺損傷〔19〕。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明清胰Ⅱ號(hào)可增加胰腺細(xì)胞的凋亡率，保護(hù)胰腺損傷，緩解SAP進(jìn)程。

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〔2017-09-25修回〕

(編輯 郭 菁/滕欣航)

R69

A

1005-9202(2017)21-5233-04；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.21.007

貴州省科技廳聯(lián)合基金項(xiàng)目(黔科合LH字〔2016〕7480號(hào)LH120170211)；貴州省科技廳中醫(yī)藥現(xiàn)代化攻關(guān)項(xiàng)目(黔科合中藥專字〔2003〕13 號(hào))

1 遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院胃腸外科

2 遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院貴州省細(xì)胞工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室

3 遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院肝膽外科

兌丹華(1957-)，女，教授，主任醫(yī)師，主要從事胰腺疾病基礎(chǔ)與臨床應(yīng)用研究。

尚獻(xiàn)會(huì)(1980-)，男，碩士，主治醫(yī)師，主要從事胰腺疾病基礎(chǔ)研究。