吳 飛 李雅麗 顧田甜 馬旗聯(lián) 郝麗莉 劉江云,*

1.蘇州大學(xué)醫(yī)學(xué)部藥學(xué)院，江蘇 蘇州 215123；2.新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院，新疆 烏魯木齊 830011

HPLC法測(cè)定楊梅中兩種黃酮的含量研究

吳 飛1李雅麗2顧田甜1馬旗聯(lián)1郝麗莉1劉江云1,2*

1.蘇州大學(xué)醫(yī)學(xué)部藥學(xué)院，江蘇 蘇州 215123；2.新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院，新疆 烏魯木齊 830011

目的：建立楊梅中二種主要黃酮類成分的同時(shí)含量測(cè)定方法。方法：采用Cosmosil -5C18-PAQ 色譜柱(250mm×4.6mm，5μm)；流動(dòng)相為乙腈-0.1% 乙酸溶液梯度洗脫；流速1.0mL/min；二極管陣列檢測(cè)器，檢測(cè)波長(zhǎng)520nm(1)和360nm(2)，同時(shí)測(cè)定楊梅中矢車菊素-3-葡萄糖苷(1)、楊梅苷(2)的含量。結(jié)果：二種黃酮類成分色譜分離良好，線性范圍依次為20.08～200.8g/mL(r=0.9996，1)、3.984～39.84 g/mL(r=0.9995，2)，加樣回收率依次為97.5%、96.2%。結(jié)論：該測(cè)定方法快速準(zhǔn)確，可為楊梅的質(zhì)量分析方法提供參考。

楊梅；HPLC；矢車菊素-3-葡萄糖苷；楊梅苷

楊梅(MyricarubraSieb.et Zucc.)是我國的特產(chǎn)水果之一，主要種植在長(zhǎng)江流域以南的浙江、江蘇、云南、廣西等地區(qū)。楊梅具有消食、除濕、解暑、生津止咳、助消化、御寒、止瀉、利尿、防治霍亂等多種功效，有“果中瑪瑙”之譽(yù)[1]。《本草綱目》記載楊梅有“止渴、和五臟、滌腸胃等功能”。研究表明，楊梅中含有花色素、楊梅素等黃酮類物質(zhì)，以及豐富的有機(jī)酸、糖類、維生素、蛋白質(zhì)等活性成分，具有抗氧化、抗炎、抗菌、增強(qiáng)機(jī)體免疫力、降血糖、降血脂等多種藥理作用[1]。楊梅中的紅色素(楊梅紅)是一種花色苷類天然色素，其中主要成分為矢車菊素-3-葡萄糖苷(1)，已于2015年獲批為食用添加劑[2]。市售品楊梅提取物可從樹皮、葉、果中提取，楊梅苷(2)是其中主要有效成分之一。

楊梅果實(shí)成熟期集中在高溫多雨的6、7月份梅雨季節(jié)，不耐貯運(yùn)，有“一日味變，二日色變，三日質(zhì)變”的說法，采摘、運(yùn)輸過程中稍稍擠壓和碰撞極易變質(zhì)，常溫貨架期僅2～3天，這極大限制了新鮮楊梅的產(chǎn)銷和深加工[3]。本文對(duì)楊梅鮮果中兩種主要成分1和2的含量同時(shí)測(cè)定方法進(jìn)行研究，為楊梅的質(zhì)量分析和深入開發(fā)應(yīng)用提供科學(xué)參考。

1 儀器與材料

1.1 儀器 Agilent 1260高效液相色譜系統(tǒng)(包括1260 Infinity VL 型四元泵，1260 DAD VL 檢測(cè)器，LC-Solution色譜工作站，美國Agilent 公司)；ODS色譜柱(5C18- PAQ，4.6mm×250mm，日本Cosmosil公司)；MP2002電子天平(上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司)；ME215S型電子天平(德國Starorious公司)；SB-5200DTDN超聲波清洗機(jī)(寧波新芝生物科技股份有限公司)。

1.2 材料 楊梅果實(shí)(MR161001；凍存)購自常熟虞山寶巖，經(jīng)蘇州大學(xué)藥學(xué)院陸葉博士鑒定為楊梅科植物楊梅(Myricarubra)的果實(shí)。矢車菊素-3-葡萄糖苷對(duì)照品為本實(shí)驗(yàn)室自制(按液相相對(duì)峰面積計(jì)，HPLC純度為93.2%)；楊梅苷對(duì)照品(HPLC純度大于98%，南京森貝伽生物科技有限公司)。乙腈(色譜純，瑞士Oceanpak公司)；純凈水(杭州娃哈哈公司)；冰乙酸、乙醇、甲醇等其他試劑均為分析純(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)。

2 方法與結(jié)果

2.1 對(duì)照品溶液的制備 精密稱取矢車菊素-3-葡萄糖苷對(duì)照品10.04mg置10mL棕色容量瓶中，加50%甲醇超聲溶解，定容，作為對(duì)照品1儲(chǔ)備液(1.004mg/mL)；分別精密量取對(duì)照品1儲(chǔ)備液0.2、0.4、0.8、1.2、1.6、2.0mL于10mL棕色容量瓶中，用50%甲醇定容，制成系列矢車菊素-3-葡萄糖苷對(duì)照品溶液。

另精密稱取楊梅苷對(duì)照品9.96mg 置10mL棕色容量瓶中，同法制成對(duì)照品2儲(chǔ)備液(0.996mg/mL)；分別精密量取對(duì)照品2儲(chǔ)備液0.2、0.4、0.8、1.2、1.6、2.0mL于50mL容量瓶中，用50%甲醇定容，制成系列楊梅苷對(duì)照品溶液。

2.2 供試品溶液的制備 取供試品10枚，解凍至常溫，去核，稱重為55.04g。楊梅果肉樣品搗碎，超聲破碎，取約5.0g，精密稱定，置50mL棕色容量瓶中，加50%甲醇適量，超聲(功率250W，頻率40kHz)提取30min，室溫下定容，經(jīng)0.45μm濾膜濾過，即得。

2.3 色譜條件 色譜柱：Cosmosil-5C18-PAQ色譜柱(4.6mm×250mm)；以0.1%乙酸溶液(A)- 乙腈(B)為流動(dòng)相梯度洗脫(0～30min，5%B ～ 53%B)；流速1.0mL/min；柱溫40℃；檢測(cè)波長(zhǎng)：360、520nm。進(jìn)樣量20μL。在該色譜條件下，繪制對(duì)照品及供試品色譜圖,如圖1所示。圖中對(duì)照品及供試品中的各色譜峰分離良好，分離度均大于1.5。

2.4 線性關(guān)系考察 分別取對(duì)照品1、2系列溶液，按“2.3”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定。以對(duì)照品濃度為橫坐標(biāo)，以峰面積值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算回歸方程。得到矢車菊素-3-葡萄糖苷的線性方程為Y=3.8747X-34.419，R2=0.9996，線性范圍20.08-200.8μg/mL；楊梅苷的線性方程為Y=19.513X-2.3965，R=0.9995，線性范圍3.984～39.84μg/mL。結(jié)果表明各成分在各自濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.5 精密度考察 精密吸取供試品溶液20μL，重復(fù)進(jìn)樣6次，以峰面積指標(biāo)計(jì)算RSD(n=6)，考察方法的精密度。結(jié)果測(cè)得成分1和2的RSD分別為1.94%和0.77%，表明儀器的精密度符合分析要求。

2.6 重復(fù)性考察 按“2.2”項(xiàng)下方法平行制備6份樣品供試品溶液，按“2.3”項(xiàng)色譜條件測(cè)定2種成分的含量。以含量為指標(biāo)計(jì)算RSD，考察方法的重復(fù)性。結(jié)果測(cè)得成分1和2按鮮品計(jì)的含量依次為580.9、56.53mg/g，RSD依次為1.61%、1.88%，表明本法重復(fù)性符合分析要求。

2.7 穩(wěn)定性考察 取供試品溶液分別于0、4、8、12、16和24 h進(jìn)樣分析，測(cè)定2種成分峰面積，以峰面積值為指標(biāo)計(jì)算RSD(n=6)。結(jié)果測(cè)得成分1和2的RSD依次為2.15%、1.92%，表明本法供試品24h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.8 加樣回收實(shí)驗(yàn) 精密稱取已知含量的楊梅果肉樣品2.5g，共稱取6份，分別加入精密對(duì)照品混合溶液(其中含對(duì)照品1和2依次為1.535、0.1594 mg/mL)1mL，按照“2.2”項(xiàng)下供試品溶液的制備方法制備。成分1和2的平均回收率分別為97.5%、96.2%，詳見表1。

表1 加樣回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果 (n=6)

2.9 樣品測(cè)定 按“2.2”項(xiàng)下制備供試品溶液，按“2.3”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定，計(jì)算供試品溶液中2個(gè)成分的含量，按鮮品計(jì)為586.2、56.97 mg/g。照《中國藥典》2015年版水分測(cè)定法第二法，檢測(cè)供試品中水分含量為86.22%。結(jié)果：楊梅果肉中矢車菊素-3-葡萄糖苷和楊梅苷的含量按干燥品計(jì)，依次為4.254mg/g、0.4134mg/g。

3 討論

楊梅果實(shí)中富含花色苷、有機(jī)酸、糖類、維生素、蛋白質(zhì)等多種營養(yǎng)物質(zhì)，相關(guān)成分分析報(bào)道較多[1]，但對(duì)其中的楊梅苷等黃酮的含量分析報(bào)道較少。本文根據(jù)花色苷(520nm)、黃酮苷(360nm)兩類成分結(jié)構(gòu)導(dǎo)致的紫外-可見光譜特征吸收波長(zhǎng)差異，參考相關(guān)研究[4-5]，采用雙波長(zhǎng)法同時(shí)定量分析花色苷和楊梅苷含量，研究結(jié)果表明,該法靈敏度高、簡(jiǎn)便快捷，可為楊梅的質(zhì)量分析方法提供參考。此外，在供試品的制備過程中發(fā)現(xiàn)，楊梅及其中的花色苷、楊梅苷化學(xué)性質(zhì)不太穩(wěn)定，在室溫25℃以下不宜久置超過24h。

[1]黃海智. 楊梅酚類化合物抗氧化和抗癌功能及機(jī)理研究[D].杭州：浙江大學(xué)，2015.

[2]本社.GB 2760—2011食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品添加劑使用標(biāo)準(zhǔn)[M].北京：中國質(zhì)檢出版社，2011.

[3]楊琴. 楊梅果實(shí)劣變機(jī)制及保鮮研究[D].杭州：浙江師范大學(xué)，2014.

[4]Shaohuan Zhou, Zhongxiang Fang, Yuan Lv, et al. Phenolics and antioxidant properties of bayberry (Myrica rubra Sieb. et Zucc.) pomace [J]. Food Chemistry, 2009(112): 394-399.

[5]齊潔,萬竹青,李默影,等. HPLC法測(cè)定楊梅葉中楊梅苷的含量[J].中國野生植物資源, 2012 (1): 35-37.

Determination of Two Flavonoids in Myrico rubra by HPLC

WU Fei1LI Yali2GU Tiantian1MA Qilian1HAO Lili1LIU Jiangyun1，2*

1.College of Pharmaceutical Sciences, Suzhou University, Suzhou 215123, China；2.The First Affiliated Hospital of Xinjiang Medical University, Urumqi 830011, China

Objective To establish an HPLC method for the simultaneous determination of two flavonoids in the fruits ofMyricorubra. Methods The chromatographic separation was performed on a Cosmosil - 5C18-PAQ column (250 mm × 4.6 mm, 5 μm) with a gradient elution of acetonitrile and 0.1% acetic acid solution, at a flow rate of 1.0 mL/min, and detected at both 520 nm (for cyanidin-3-glucoside, 1) and 360 nm (for myricetrin 2) using diode array detector. Results The two compounds were separated with satisfaction, with linearity ranges between 20.08～200.8 g/mL (r=0.9996, 1) and 3.984～39.84 g/mL (r=0.9995, 2), and average recovery rates to be 97.5% and 96.2%. Conclusion The method is accurate and selective, which could be applied for the quality analysis ofMyricorubra.

Myricorubra; HPLC; Cyanidin-3-glucoside;Myricetrin

R285

A

1007-8517(2017)20-0024-03

新疆維吾爾自治區(qū)自然科學(xué)基金(2015211C053)。

吳飛(1986-)，男，漢族，碩士研究生在讀，研究方向?yàn)樘烊划a(chǎn)物研究與開發(fā)。E-mail: wufeit@sina.com

劉江云(1972-)，男，漢族，博士研究生，副教授，研究方向?yàn)樘烊划a(chǎn)物研究與開發(fā)研究。E-mail: liujiangyun@suda.edu.cn

2017-08-24 編輯：穆麗華)