劉洋 王國芳 岳二麗 郭留云

羅格列酮對牙周炎大鼠牙齦脂聯素受體表達的影響

劉洋 王國芳 岳二麗 郭留云

目的探討羅格列酮(ROS)對牙周炎大鼠牙齦脂聯素受體1(AdipoR1)mRNA、脂聯素受體2(AdipoR2)mRNA和TNF-α等炎癥因子表達的影響及在牙周炎中對牙槽骨保護的潛能。方法50 只SD大鼠隨機分為5 組(n=10),大鼠不干預處理作為空白對照，40 只大鼠用于制作牙周炎模型后分別用蒸餾水(牙周炎組)、1、3、10 mg/kg ROS(低、中、高劑量組)灌胃1 次/d，持續(xù)4 周。 然后取樣，RT-PCR測定牙齦組織AdipoR1和AdipoR2 mRNA表達水平，ELISA測牙齦組織TNF-α、MMP-9和血漿脂聯素濃度，標準化的數碼攝影測量秞牙骨質界到牙槽骨嵴頂(CEJ-A)距離。結果牙周炎組和空白對照組相比，牙齦組織AdipoR1和AdipoR2 的mRNA表達水平顯著降低(Plt;0.01)，血漿脂聯素水平無差異(Pgt;0.05)，TNF-α和MMP-9濃度顯著上升(Plt;0.01)。和牙周炎組相比，低、中、高劑量治療組牙齦組織AdipoR1 mRNA表達均升高(Plt;0.05)，TNF-α濃度顯著降低(Plt;0.01)；中、高劑量治療組牙齦組織AdipoR2 mRNA表達顯著升高(Plt;0.01)，MMP-9濃度顯著降低(Plt;0.01)，血漿脂聯素濃度升高(Plt;0.05)，牙槽骨吸收量顯著降低(Plt;0.01)。結論ROS可能通過上調牙齦組織中AdipoR1和AdipoR2 mRNA表達水平，降低TNF-α、MMP-9濃度，緩解牙周組織炎癥，降低牙槽骨吸收。

牙周炎； 脂聯素受體； 羅格列酮； 腫瘤壞死因子α； 基質金屬蛋白酶9

炎癥因子在牙周炎中扮演了重要的角色，牙周組織破壞主要是由組織破壞性的酶(MMPs)和炎癥介質(PG，IL)造成的[1]。IL-1β和TNF-α等初級炎癥介質誘導趨化因子和前列腺素等二級介質的合成，導致炎癥加重、連接組織破壞和破骨細胞性骨吸收[2]。脂聯素是脂肪細胞分泌的脂肪因子，作為一種負性調節(jié)因子在多種生理病理過程中起重要作用，例如抗炎、增加胰島素敏感性、保護心血管。對器官有多重保護效應，抑制細胞分泌早期炎癥因子TNF-α[3]。脂聯素與其受體結合發(fā)揮其生理作用，脂聯素受體(AdipoRs)主要有2 種:AdipoR1和AdipoR2，兩者幾乎在所有的組織器官中均有表達。Yamaguchi等[4]認為脂聯素功能的降低可能加重牙周病的發(fā)展。PPAR-γ是II型核受體超家族成員，羅格列酮(ROS)是高效的PPAR-γ受體激動劑，有調節(jié)細胞炎癥反應和免疫反應的功能，可控制炎癥水平，尤其是炎癥介質的產生[5]，目前已在臨床上被用于治療哮喘等一些炎癥性疾病。本實驗研究ROS干預下牙周炎大鼠牙齦組織中AdipoR1和AdipoR2的mRNA表達水平改變，探討其對牙周炎牙齦組織脂聯素抵抗的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物及分組 4 周齡190～230 g雄性SD大鼠50 只(鄭州大學實驗動物中心提供)。隨機分5 組，每組10 只：①空白對照組，不建立牙周炎模型，蒸餾水灌胃;②牙周炎組，建立牙周炎模型，蒸餾水灌胃;③低劑量治療組，建立牙周炎模型，1 mg/kg ROS灌胃;④中劑量治療組，建立牙周炎模型， 3 mg/kg ROS灌胃；⑤高劑量治療組，建立牙周炎模型，10 mg/kg ROS灌胃。

1.1.2 主要試劑以及儀器 ChemiDoc MP凝膠成像系統(Bio-Rad，美國)；SuperRT cDNA逆轉錄試劑盒，Drop PCR mix(康為，北京)；ELISA試劑盒(西唐，上海)；羅格列酮鈉片(太極集團，重慶)。

1.2 方法

1.2.1 建立牙周炎模型 0.2 mm正畸鋼絲置于大鼠左上頜第二磨牙的釉牙骨質界(CEJ)處，牙周炎建模參考了葛超等[6]的方法。

1.2.2 羅格列酮干預 羅格列酮鈉片溶于蒸餾水，結扎前1 h對各組使用不同濃度的ROS溶液或等量蒸餾水灌胃，以后每天1 次持續(xù)4 周。全麻下腹主靜脈取血，離心獲得血漿。處死后取左上頜第二磨牙牙齦組織，上頜骨于10%中性甲醛溶液保存。

1.2.3 RT-PCR檢測 Trizol提取牙齦組織總RNA,SuperRT cDNA逆轉錄試劑盒合成cDNA，引物序列如下：AdipoR1(398 bp)(5′-AACT GGACTATTCAGGGA-3′)和(5′-TGGTTCCAGTCTCATCAG-3′)，AdipoR2(233 bp)(5′-ACCCACAACCTTCCTTCATC-3′)和(5′-GCTAGCC ATGAGCATTAGCC-3′)，GAPDH(307 bp)，(5-TGAACGGGAAG CTCACTGG-3′)和(5′-CCACCACCCTGTTG CTGTA-3′)。95 ℃預變性10 min，94 ℃變性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸60 s，32 個循環(huán)，72 ℃終延伸5 min。電泳，凝膠成像儀拍照，目的基因與GAPDH灰度積分比值表示基因表達水平。

1.2.4 ELISA檢測 稱取牙齦組織，按比例加入PBS制備勻漿，離心取上清。ELISA測定牙齦組織勻漿TNF-α、MMP-9和血漿脂聯素濃度，方法按照說明書。

1.2.5 牙槽骨吸收分析 標準化的數碼攝影(standard digital photographs)測量牙槽骨吸收。步驟參考Cavagni等[7]的方法。Photoshop CS6軟件測量上頜第二磨牙頰腭側各5 個位點的CEJ-A(近中根2 個，根分叉1 個，遠中根2 個)，計算均值，結果以mm表示。

1.3 統計學分析

2 結 果

2.1 RT-PCR檢測結果

和空白對照組相比，牙周炎組牙齦組織中AdiopoR1 mRNA和AdipoR2的mRNA表達水平下降(Plt;0.01)。和牙周炎組相比,低、中、高劑量治療組牙齦組織AdipoR1 mRNA表達水升高(Plt;0.05),中、高劑量治療組AdipoR2 mRNA表達水平升高(Plt;0.01)(圖 1)。

2.2 ELISA檢測結果

和空白對照相比，牙周炎組TNF-α和MMP-9濃度升高(Plt;0.01)，血清脂聯素水平無差異(Pgt;0.05)。和牙周炎組相比，低、中、高治療組牙齦組織中TNF-α濃度下降(Plt;0.01)；中、高劑量治療組牙齦組織MMP-9濃度下降(Plt;0.01)，血漿脂聯素濃度上升(Plt;0.05)(圖 2)。

2.3 牙槽骨吸收測定

和空白對照組相比，牙周炎組頰、腭側牙槽骨吸收顯著增加(Plt;0.01)。和牙周炎組相比，中、高劑量治療組頰、腭側牙槽骨吸收顯著降低(Plt;0.01)(圖 3)。

3 討 論

脂聯素通過抑制巨噬細胞功能和粒-單系組細胞生長抑制炎癥介質的釋放[8]，抑制IL-6等前炎性細胞因子的同時誘導抗炎細胞因子IL-10分泌[9-10]，Iwayama等[11]發(fā)現IL-1β存在的情況下，脂聯素可抑制牙齦成纖維細胞分泌IL-6和IL-8，脂聯素在牙周炎炎癥控制方面可能起到了一定的作用。

圖 1 AdipoRs mRNA表達水平(與空白對照組相比，**：Plt;0.01；與牙周炎組相比， *：Plt;0.05，#：Plt;0.01)

圖 2 牙齦組織TNF-α,MMP-9和血漿脂聯素濃度(與空白對照組相比，**：Plt;0.01；與牙周炎組相比，#：Plt;0.05，##：Plt;0.01)

Fig 2 Concentration of gingival TNF-α,MMP-9 and plasma adiponectin(vscontrol,**：Plt;0.01;vsperiodontitis group,#:Plt;0.05, ##:Plt;0.01)

圖 3 頰腭側牙槽骨喪失測量(紅線: 測量位點牙槽骨吸收水平)

炎癥介質和脂聯素信號通路之間有交聯，高濃度的TNF-α可降低人牙齦成纖維細AdipoR1 mRNA的表達[4]，本研究發(fā)現牙周炎可導致大鼠牙齦組織AdipoR1和AdipoR2 的mRNA表達下調，牙齦組織TNF-α濃度升高，推測牙周炎中牙齦組織TNF-α濃度增高可能是AdipoRs mRNA表達水平下調的原因。脂聯素通過與受體結合發(fā)揮抗炎作用，AdipoRs表達水平降低可能是牙周疾病加重的原因之一，AdipoRs基因表達水平降低導致脂聯素結合減少，生理學效應降低，靶組織對脂聯素敏感性降低，這種現象叫脂聯素抵抗。本研究中，牙周炎大鼠血漿脂聯素和正常大鼠相比無差別，牙齦組織AdipoRs mRNA表達下調，提示單獨牙周炎不能改變循環(huán)脂聯素濃度，受體表達水平降低引發(fā)脂聯素抵抗可能是牙周炎中脂聯素功能下降的關鍵。

Iwaki等[12]提出人脂聯素基因啟動子包含了PPAR-γ反應元件(PPRE)，PPAR-γ可提高脂聯素基因啟動子活性，PPAR-γ激動劑可以激活脂聯素啟動子增加脂聯素mRNA表達，在本研究中，ROS干預上調了牙周炎大鼠血漿脂聯素濃度和牙齦組織AdipoR1和AdipoR2 mRNA表達，提示ROS可通過上調循環(huán)脂聯素水平及AdipoRs的表達緩解牙周炎中牙周組織的脂聯素抵抗。 Sun等[13]認為PPAR-γ并不能直接與AdipoR2基因啟動子上的PPAR反應元件結合激活其轉錄，Liu等[14]發(fā)現肝臟和脂肪組織中脂聯素受體的表達和血漿TNF-α呈負相關，本實驗牙齦組織中TNF-α濃度升高，推測羅格列酮可能通過降低牙齦組織中TNF-α濃度間接調節(jié)脂聯素受體水平，但PPAR-γ激動劑對組織中脂聯素受體mRNA表達上調的具體原因仍然需要更深層的研究。

ROS對牙周組織有保護作用，這可能和羅格列酮直接或間接通過降低TNF-α上調牙齦組織AdipoR1和AdipoR2的mRNA表達水平，提升循環(huán)脂聯素濃度，緩解牙周炎中存在的脂聯素抵抗，降低牙齦組織中MMP-9有關。羅格列酮有潛力作為傳統牙周炎療法的補充，但仍然需要進一步的臨床對照實驗來確定羅格列酮能否對牙周炎產生臨床治療效果。

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(收稿： 2016-10-09 修回： 2016-11-14)

Theeffectsofrosiglitazoneontheexpressionofadiponectinreceptoringingivaltissueofratswithexperimentalperiodontitis

LIUYang，WANGGuofang，YUEErli，GUOLiuyun.

450000,DepartmentofPeriodontology，Schoolofstomatology，ZhengzhouUniversity，China

Objective： To evaluate the effects of rosiglitazone(ROS) on the expression of adiponectin receptors(AdipoR1 and AdipoR2) mRNA in gingival tissue and inflammatory factors, and on the potential of bone loss in the rats with experimental periodontitis.Methods10 male Sprague-Dawley rats without treatment were used as the controls；40 were used for the creation of periodontis models and then treated by rosiglitazone at 0(periodontitis control),1，3，10 mg/kg(low, median and high dose groups) respectively 1/d for 4 weeks. RT-PCR was used to examine the expression of AdipoR1 and AdipoR2 mRNA in gingiva tissue. Levels of gingival TNF-α，MMP-9 and plasma adiponectin was measured by ELISA.CEJ-A was measured for the evaluation of alveolar bone loss by standard digital photographs.ResultsThe expression levels of gingival AdipoR1 and AdipoR2 mRNA in periodontitis group is lower than that in the control group(Plt;0.01). The concentration of plasma adiponectin had no significant difference between control group and periodontitis group(Pgt;0.05). The concentration of gingival TNF-α，MMP-9 in periodontitis group was significantly higher than that in control group(Plt;0.01). Compared with periodontitis group，ROS treatment increased the expression levels of AdipoR1 mRNA(Plt;0.05)and decreased the concentration of TNF-α in gingival tissue. Median and high dose treatment increased the expression levels of AdipoR2(Plt;0.01)and the concentration of plasma adiponectin(Plt;0.05)，decreased the concentration of MMP-9 in gingival tissue(Plt;0.01)and the alveolar bone loss(Plt;0.01).ConclusionRosiglitazone treatment may reduce inflammatory response and suppress the bone resorption probably through up-regulation of the expression of adiponectin receptors and decrease of the concentration of TNF-α，MMP-9 in gingival tissue.

Periodontitis；Adiponectinreceptor；Rosiglitazone；TNF-α；MMP-9

河南省科技廳科技攻關項目(編號: 122300410367)

450000, 鄭州大學附屬河南省口腔醫(yī)院牙周科

郭留云 E-mail：glyun@163.com

R781.4

A

10.3969/j.issn.1001-3733.2017.01.004