吳劍平，周悅榕，張 婧，李丹妮，嚴(yán) 鳳，潘 娟

(上海市獸藥飼料檢測所，上海 201103)

超高效液相色譜-靜電軌道阱質(zhì)譜同時篩查定量飼料中的31種氨基甲酸酯類農(nóng)藥殘留

吳劍平，周悅榕，張 婧，李丹妮*，嚴(yán) 鳳，潘 娟

(上海市獸藥飼料檢測所，上海 201103)

建立了超高效液相色譜-靜電軌道阱質(zhì)譜法檢測飼料中31種氨基甲酸酯類農(nóng)藥殘留的檢測方法和目標(biāo)化合物的質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫。飼料樣品經(jīng)100 mol/L HCl-甲醇(1∶3)提取，高速離心，經(jīng)稀釋后進(jìn)樣分析。采用Thermo Syncronis C18色譜柱(150 mm×2.1 mm,3 μm)作為固定相，0.1%甲酸和0.1%甲酸乙腈作為流動相進(jìn)行梯度洗脫。質(zhì)譜采用正離子掃描，以1對母離子和子離子的精確質(zhì)量數(shù)進(jìn)行定性，以母離子的峰面積進(jìn)行定量分析。31種氨基甲酸酯類化合物在最優(yōu)化條件下分離良好，在定量范圍內(nèi)線性良好，相關(guān)系數(shù)(r2)大于0.98，回收率達(dá)50.6%～109%,相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)不大于8.9%。該方法具有簡便、快速、靈敏、準(zhǔn)確等特點，適用于飼料中氨基甲酸酯類化合物的同時定性篩查和定量分析。

氨基甲酸酯類農(nóng)藥；超高效液相色譜；靜電軌道阱質(zhì)譜；定性與定量；飼料

隨著現(xiàn)代畜牧業(yè)養(yǎng)殖技術(shù)的不斷進(jìn)步發(fā)展，飼料的品質(zhì)和安全越來越受廣大養(yǎng)殖戶的重視。針對飼料質(zhì)量安全問題，為了杜絕飼料生產(chǎn)過程中的違禁物質(zhì)添加現(xiàn)象，全國已開展了每年一度的跨省飼料抽樣篩查工作，但對于飼料基質(zhì)的谷物或油類作物中的農(nóng)藥殘留尚未給予足夠的重視。我國目前已發(fā)布的針對農(nóng)藥殘留進(jìn)行監(jiān)管的主要法規(guī)公告包括：農(nóng)業(yè)部公告194號(禁止11種高毒農(nóng)藥在果類作物上使用)，農(nóng)業(yè)部公告199號(禁止19種高毒農(nóng)藥用于蔬菜、果樹、茶葉、中草藥材)，農(nóng)農(nóng)發(fā)〔2010〕2號文(禁止銷售和使用23種高毒農(nóng)藥，限制19種農(nóng)藥在蔬菜、果樹、茶葉、中草藥材等作物上使用)；農(nóng)業(yè)部等5部門1586號公告(取消部分高毒農(nóng)藥的生產(chǎn)和使用許可)；農(nóng)業(yè)部193號公告和235公告(規(guī)定在動物可食組織中不得檢出的農(nóng)藥種類)，于2017年6 月正式實施的《中國食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)：食品中農(nóng)藥最大殘留限量》(GB 2763—2016)，規(guī)定了433種農(nóng)藥在10大類食品中的4140項農(nóng)藥最大殘留限量，成為我國農(nóng)藥殘留食品安全市場監(jiān)管的唯一強(qiáng)制性國家標(biāo)準(zhǔn)。綜上所述，所有相關(guān)法規(guī)公告中對于谷物、油料作物、蔬菜、水果等食品中的農(nóng)藥殘留監(jiān)管十分有力，而對作為畜牧業(yè)重要投入品的飼料中的農(nóng)藥殘留并沒有明確規(guī)定，既未提出受監(jiān)管的種類，也未提出相應(yīng)的限量標(biāo)準(zhǔn)。國內(nèi)對水果、蔬菜和谷物中多種農(nóng)藥殘留檢測方法的研究較多[1-3]，而關(guān)于飼料中多種農(nóng)藥殘留的檢測方法卻鮮見文獻(xiàn)報道[4-5]。

目前，檢測食品中多種農(nóng)藥殘留的方法主要有高效液相色譜法(HPLC)、氣相色譜法(GC)、色譜質(zhì)譜聯(lián)用法、生物傳感器法和酶聯(lián)免疫法等。氣相色譜結(jié)合FPD或ECD檢測器同時檢測多種農(nóng)藥殘留具有靈敏度高和特異性好的特點[6-7]，但對于熱不穩(wěn)定和高沸點的化合物難以檢測。液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法可以較好地彌補(bǔ)這一缺點，同時也具有高靈敏度和高特異性的優(yōu)點[8-9]，有報道采用液相色譜-串聯(lián)四極桿質(zhì)譜法檢測蔬菜、水果中65種農(nóng)藥殘留[10]，其檢測靈敏度可達(dá)20 μg/kg。靜電軌道阱質(zhì)譜(Orbitrap mass)作為高分辨率質(zhì)譜，相比串聯(lián)四極桿質(zhì)譜具有更高的質(zhì)量精確度，同時也具有較高的靈敏度和較寬的線性范圍，在多殘留分析中可以兼顧較多質(zhì)量數(shù)接近的化合物的定性準(zhǔn)確性和濃度差別較大的化合物的定量精密性[11-13]。本研究利用靜電軌道阱作為高分辨質(zhì)譜的高靈敏度和高質(zhì)量精度的特點，建立了31種常見氨基甲酸酯類化合物的色譜與質(zhì)譜特征數(shù)據(jù)庫和樣品前處理方法，同時實現(xiàn)了對飼料樣品中的氨基甲酸酯類農(nóng)藥殘留的篩查、定性、確證和定量。該方法相比原有液質(zhì)聯(lián)用或氣質(zhì)聯(lián)用方法大大提高了工作效率，方法的性能指標(biāo)能達(dá)到國際標(biāo)準(zhǔn)，并為今后對飼料中農(nóng)殘化合物的預(yù)警監(jiān)測和安全評估提供了技術(shù)保障。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

Ultimate 3000雙三元超高效液相色譜、Excalibur控制軟件、Trace Founder數(shù)據(jù)處理軟件，Mass Frontier化合物結(jié)構(gòu)推斷軟件，四極桿串聯(lián)靜電軌道阱質(zhì)譜帶HESI電離噴霧源(Q Exactive)、高速冷凍離心機(jī)(Allegra X-22R，Beckman Coulter)；AL204電子天平(梅特勒-托利多儀器有限公司)；水浴控溫氮吹儀(N-EVAP，上海安譜公司)。C18分析柱(Syncronis C18,150 mm×2.1 mm× 3.0 μm，Thermo Fisher，美國)；2,3,5-混殺威、3,4,5-混殺威、涕滅威、涕滅威亞砜、滅害威、惡蟲威、丁酮威、丁酮威亞砜、丁酮砜威、甲萘威、克百威、3-羥基克百威、乙硫苯威、仲丁威、呋霜靈、異丙威、滅梭威、滅多威、速滅威、滅殺威、殺線威、抗蚜威、猛殺威、殘殺威、特草靈、硫雙威、久效威、滅除威、乙霉威、苯硫威、涕滅威砜(50 μg/mL，Bepure?，北京振翔科技有限公司)；乙腈、甲酸(色譜純，Merk公司，德國)；去離子水(自制，電阻率≥18 MΩ·cm)；高純氮、高純氬(純度均為99.999%，上海佳杰特種氣體公司)。

1.2 色譜條件

色譜柱：Syncronis C18(150 mm×2.1 mm×3 μm，美國Thermo公司)。流動相：A為0.1%甲酸，B為0.1%甲酸乙腈，采用梯度洗脫程序：0～1 min，5%B；1～8 min,5%～95%B；8～13 min，95%B；13.0～13.1 min，95%～5%B；13.1～17 min，5%B。柱溫：30 ℃，流速：0.3 mL/min，進(jìn)樣量：10 μL。

1.3 質(zhì)譜條件

使用Thermo Fisher公司的Q Exactive四極桿靜電軌道阱質(zhì)譜帶HESI電離噴霧源質(zhì)譜檢測器對1 μg/mL的31種氨基甲酸酯類化合物標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行建庫優(yōu)化，兼顧各目標(biāo)化合物優(yōu)化后的質(zhì)譜條件為：選擇正離子模式，正電壓3 200 V，鞘氣壓力344 kPa，輔助氣流速5 L/min，吹掃氣流速0.3 L/min，碰撞氣壓力0.2 Pa，毛細(xì)管溫度 325 ℃，輔助氣加熱溫度350 ℃，離子透鏡射頻電壓50.0 V；掃描模式為全掃描加目標(biāo)物二級離子碎片掃描模式，一級母離子掃描范圍為m/z100～800，母離子掃描分辨率為70 000，靜電軌道阱離子捕獲器門限值(AGC Target)為3×106，最大注入捕獲器時間為100 ms，二級碎片離子掃描分辨率為17 500，二級碎片離子捕獲器門限值(dd-MS2 AGC Target)為1×105，最大注入捕獲器時間(dd-MS2 Maximum inject time)為50 ms，同時最大響應(yīng)離子(Top N)選取5個，動態(tài)排除時間5 s，數(shù)據(jù)處理軟件提取離子質(zhì)量精度為5 ppm，精確至小數(shù)點后5位。

1.4 定性與定量方法

按歐盟相關(guān)規(guī)定[14]，以“1.2～1.3”的儀器方法，對目標(biāo)農(nóng)藥進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)品的進(jìn)樣并建庫分析，獲得最合適的目標(biāo)物母離子精確質(zhì)量數(shù)、保留時間以及其二級碎片離子的全掃描圖譜，結(jié)合Mass Frontier所推斷的子離子找出豐度最高的子離子和母離子一并作為確證所需的定性離子。以31種氨基甲酸酯類農(nóng)藥的保留時間、母離子精確質(zhì)量數(shù)和子離子精確質(zhì)量數(shù)相結(jié)合作為定性依據(jù)(表1)。定量時用一級母離子的精確質(zhì)量數(shù)對總離子流圖提取色譜，對目標(biāo)物的色譜峰進(jìn)行積分，通過曲線校準(zhǔn)或單點校準(zhǔn)進(jìn)行定量分析。

表1 氨基甲酸酯類化合物的質(zhì)譜分析條件Table 1 Mass spectrometry analysis conditions of carbarmates

1.5 樣品前處理方法

準(zhǔn)確稱取飼料樣品4.00 g，加入5.00 mL 0.1 mol/L鹽酸溶液振蕩濕潤2 min，再加入15 mL甲醇，振蕩2 min后室溫下超聲15 min，然后于8 000 r/min轉(zhuǎn)速下離心5 min，取上層清液0.5 mL，加入0.1%甲酸0.5 mL混勻后14 000 r/min離心3 min，上清液經(jīng)0.22 μm濾膜過濾后上機(jī)測定。

2 結(jié)果與討論

2.1 定性定量方法依據(jù)

根據(jù)歐盟相關(guān)規(guī)定[14]，以識別分(Identification points，IPs)為基礎(chǔ)進(jìn)行化合物的定性分析，對于不同法規(guī)要求的殘留物，確證所需的IPs也不同，A類(違禁)需滿足4 IPs，B類(限用)需滿足3 IPs，農(nóng)藥殘留適用違禁物質(zhì)A類，因此需要4 IPs進(jìn)行確證；不同的技術(shù)所獲得的IPs也不同，靜電軌道阱質(zhì)譜作為高分辨質(zhì)譜獲得的1個母離子有2.0 IPs，相對應(yīng)的1個子離子有2.5 IPs，因此建立目標(biāo)化合物庫時選出1對合適的母離子與子離子即可確證1個農(nóng)殘化合物。另外，化合物的元素組成決定其同位素峰的豐度比，因此一級和二級離子的同位素峰匹配分值也是重要的定性判斷依據(jù)。由于靜電軌道阱質(zhì)譜的工作特性，其二級子離子精確質(zhì)量數(shù)的分辨率(17 500)遠(yuǎn)低于一級母離子(70 000)，特異性相對較差，且靈敏度遠(yuǎn)不如一級母離子的響應(yīng)強(qiáng)度，因此本方法選擇一級母離子的精確質(zhì)量數(shù)為提取色譜質(zhì)譜峰作為定量依據(jù)。

2.2 同分異構(gòu)體的定性

本研究涉及的目標(biāo)化合物包含多對同分異構(gòu)體，比如丁酮威亞砜和涕滅威亞砜、丁酮威砜和涕滅威砜、丁酮威和涕滅威、滅除威和滅殺威等，它們具有相同的分子組成，因此即使靜電軌道阱質(zhì)譜擁有高達(dá)140 000分辨率的質(zhì)量精度也無法區(qū)分這些化合物，但多殘留篩查過程中不可排除這些化合物同時存在的可能，經(jīng)實驗驗證，可采用3種不同方法解決這一問題∶①通過質(zhì)譜前端的液相部分對元素組成相同但分子結(jié)構(gòu)差異較大的化合物采用優(yōu)化梯度洗脫條件、增加色譜分離度的方法，使同分異構(gòu)體目標(biāo)化合物的保留時間有較大差異，從而實現(xiàn)分離定性，例如本方法中丁酮威亞砜和涕滅威亞砜等；②通過質(zhì)譜源區(qū)對同分異構(gòu)體目標(biāo)化合物母離子帶電離行為的差異，分別檢測其不同的加合物形式進(jìn)行區(qū)分，例如將丁酮威和涕滅威，丁酮威砜和涕滅威砜這兩對化合物經(jīng)單標(biāo)進(jìn)樣后發(fā)現(xiàn)，涕滅威和丁酮威砜在ESI+離子源作用下難以獲得[M+H]+的母離子，而主要以[M+Na]+離子形式存在，而丁酮威和涕滅威砜母離子則主要以[M+H]+形式存在，因此在保留時間接近難以區(qū)分時，檢測不同形式的母離子加合物也可以起到區(qū)分同分異構(gòu)體的目的；③有些同分異構(gòu)體化合物的保留時間非常接近，母離子加合物形式也相同，該情況下可通過單標(biāo)進(jìn)樣后分析其所產(chǎn)生的特征碎片離子的差異進(jìn)行區(qū)分。優(yōu)化后所得典型特征離子的質(zhì)量色譜(XIC)圖見圖1。

2.3 前處理方法的研究

考察了固相萃取法、分散固相萃取法和直接萃取后稀釋進(jìn)樣法的前處理效果，結(jié)果發(fā)現(xiàn)固相萃取法和分散固相萃取法會對某些化合物產(chǎn)生歧視效應(yīng)，因目標(biāo)化合物的范圍廣泛，性質(zhì)差異較大，因此選擇直接萃取后稀釋作為本方法的前處理方法。實驗同時考察了0.1 mol/L鹽酸溶液-甲醇(1∶3、1∶1、3∶1)以及0.1 mol/L鹽酸溶液-乙腈(1∶3、1∶1、3∶1)對濃度為1倍定量下限(1LOQ)、2LOQ、5LOQ的31種氨基甲酸酯類化合物的提取效率，并將回收率結(jié)果在均值±40%以外的數(shù)據(jù)定義為乖離數(shù)據(jù)，統(tǒng)計其個數(shù)，實驗結(jié)果見表2。結(jié)果發(fā)現(xiàn)使用0.1 mol/L鹽酸溶液-甲醇(1∶3和1∶1)以及0.1 mol/L鹽酸溶液-乙腈(1∶3)提取的回收率均值可達(dá)到70%以上，回收率較高；而使用0.1 mol/L鹽酸溶液-甲醇(1∶3)提取時具有更小的歧視效應(yīng)，因此選擇其作為提取溶劑。

表2 飼料中31種氨基甲酸酯類化合物提取效率研究Table 2 Research on extraction efficiency of 31 carbarmates in feed

2.4 線性定量范圍的確定

將31種氨基甲酸酯類化合物先用甲醇配制成50 mg/L的混合標(biāo)準(zhǔn)貯備液，再將空白飼料按“1.5”方法處理后獲得空白樣品基質(zhì)溶液，用此溶液將標(biāo)準(zhǔn)貯備液分別稀釋成1、2、5、10、20、50、100、500 μg/L標(biāo)準(zhǔn)曲線工作溶液，在優(yōu)化條件下上機(jī)檢測，獲得各目標(biāo)化合物的標(biāo)準(zhǔn)曲線，實驗結(jié)果表明，在1～500 μg/L范圍內(nèi)31種化合物的線性良好，r2>0.98。

圖1 定量下限濃度典型XIC圖Fig.1 Typical XIC chromatograms of LOQ

2.5 檢出限與定量下限

選擇20個空白樣品，按優(yōu)化條件進(jìn)行處理后上機(jī)測定，取與標(biāo)準(zhǔn)品圖譜中相同保留時間的噪音信號平均值，以3倍信噪比(S/N≥3)為檢出限(LOD)，S/N≥10為定量下限(LOQ)，確定該方法的LOD與LOQ，有關(guān)國家規(guī)定對不在其肯定列表目錄中的農(nóng)殘化合物一律要求不得高于10 μg/kg的限量[15]，因此本方法在結(jié)合信噪比和實際檢測需要的情況下選擇10 μg/kg作為方法檢出限，20 μg/kg作為方法定量下限。實際樣品檢出限處的XIC圖譜見圖1。結(jié)果表明，檢出限附近峰形良好，定性準(zhǔn)確。

2.6 基質(zhì)效應(yīng)的考察

為驗證方法基質(zhì)效應(yīng)，選取不同種類空白飼料6批，按“1.5”方法進(jìn)行前處理，將其空白溶液中分別加入1LOQ的31種氨基甲酸酯類化合物標(biāo)準(zhǔn)溶液，測得其回收率為80%～120%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)小于10%，證明該前處理方法的基質(zhì)效應(yīng)影響不大。

2.7 方法準(zhǔn)確度與精密度

為驗證方法精密度與準(zhǔn)確度，采用標(biāo)準(zhǔn)添加法。使用6批不同飼料，每批稱取等量6份，6份1組分3組，每組分別加入1LOQ、2LOQ、5LOQ的31種氨基甲酸酯類化合物標(biāo)準(zhǔn)溶液，結(jié)果見表3。實驗結(jié)果表明，該方法檢測飼料中31種氨基甲酸酯類化合物的回收率為50.6%～109%，RSD為3.9%～8.9%，證明該方法具有較高的準(zhǔn)確度與精密度。

表3 31種氨基甲酸酯類化合物的加標(biāo)回收率及相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(n=6)Table 3 Recoveries and RSDs of 31 carbarmates in feed(n=6)

2.8 方法選擇性的驗證

選擇20個空白樣品，按優(yōu)化條件處理后上機(jī)測定，未發(fā)現(xiàn)假陽性結(jié)果，表明該方法的選擇性良好。

2.9 實際樣品檢測

取隨機(jī)采集的某省份生產(chǎn)豆粕、玉米粉、玉米粒、谷糠、淀粉和玉米梗發(fā)酵物等飼料100批次，按本方法進(jìn)行實際樣品檢測，將所得原始數(shù)據(jù)文件以Trace Founder數(shù)據(jù)處理軟件進(jìn)行篩查和定量處理，將篩查所得疑似陽性結(jié)果經(jīng)保留時間，母離子精確質(zhì)量數(shù)和同位素豐度比，以及子離子的精確質(zhì)量數(shù)和豐度比進(jìn)行確證。將確證后的陽性樣品以外標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行定量校準(zhǔn)分析，結(jié)果如表4。據(jù)表4實驗結(jié)果，該省份所抽取的100份樣品中檢出滅害威、苯硫威、乙霉威、3-羥基克百威和滅殺威，陽性率均未超過5%，其含量均遠(yuǎn)低于LD50(GB 2763-2016食品中農(nóng)藥最大殘留限量)，不會對生物造成毒害。但目前樣本數(shù)量較少，所涵蓋的農(nóng)殘化合物種類有限，在今后的工作中將進(jìn)一步拓展采樣數(shù)量和篩查范圍。

表4 100批飼料的篩查和定量結(jié)果 Table 4 Screening and quantitation results for 100 feed

3 結(jié) 論

建立了超高效液相色譜-靜電軌道阱質(zhì)譜檢測飼料中的31種氨基甲酸酯類農(nóng)藥的檢測方法和目標(biāo)化合物的質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫。飼料樣品經(jīng)100 mol/L HCl-甲醇(1∶3)提取，高速離心，經(jīng)稀釋后進(jìn)樣分析。實驗結(jié)果表明，31種氨基甲酸酯類化合物分離良好，在定量范圍內(nèi)均線性良好，相關(guān)系數(shù)(r2)均大于0.98，回收率為50.6%～109%,RSD不大于8.9%。本方法具有簡便、快速、靈敏、準(zhǔn)確等特點，適用于飼料中氨基甲酸酯類化合物的同時篩查和定量分析。

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Simultaneous Screening and Quantitation of 31 Carbamate Pesticide Residues in Feed by Ultra Performance Liquid Chromatography-Orbitrap Mass Spectrometry

WU Jian-ping,ZHOU Yue-rong,ZHANG Jing,LI Dan-ni*,YAN Feng,PAN Juan

(Shanghai Municipal Supervisory Institute Veterinary Drugs and Feedstaff,Shanghai 201103,China)

To screen and quantify 31 carbamate pesticide residues in feed simultaneously,an ultra performance liquid chromatography-orbitrap mass spectrometric method and the target compounds data base were established.The feed sample was extracted with 100 mol/L HCl-methanol(1∶3).The extract was high-speedily centrifuged,purified with acid,then diluted and injected for analysis.Thermo Syncronis C18column(150 mm×2.1 mm,3 μm)was chosen as the solid phase with 0.1%formic acid and 0.1%formic acid acetonitrile as liquid phase by gradient elution.The mass spectrometer was operated in positive scan mode.One pair of parent ion and daughter ion were chosen for qualitation,and the response of the parent ion was used to achieve the quantitation.Under the optimal conditions,31 carbamates were separated well.Good linearities were obtained in their respective quantitative ranges with correlation coefficients(r2) more than 0.98.The average recoveries were in the range of 50.6%-109%and the relative standard deviations(RSDs) were not more than 8.9%.The method was convenient,economical,sensitive and accurate,and was applicable for the qualitation and quantitation of 31 carbamate pesticide residues in feed.

carbamate pesticides；ultra performance liquid chromatography;orbitrap mass spectrometry；qualitation and quantitation；feed

2017-06-29；

2017-08-04

上海市市級農(nóng)口系統(tǒng)青年人才成長計劃(滬農(nóng)青字(2016)第2-5號)

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李丹妮，碩士，高級畜牧師，研究方向：獸藥安全評價及殘留測定，Tel：021-62687816,E-mail：yure@sina.com

10.3969/j.issn.1004-4957.2017.11.012

O657.63；O657.7

A

1004-4957(2017)11-1363-07