劉祥芳 鄭建波 賈永義 顧志敏 羅 琛

(1. 浙江大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院, 杭州 310058; 2. 浙江省淡水水產(chǎn)研究所, 湖州 313001)

翹嘴紅鲌雌雄基因組差異及太湖野生群體遺傳多樣性現(xiàn)狀的AFLP分析

劉祥芳1鄭建波1賈永義2顧志敏2羅 琛1

(1. 浙江大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院, 杭州 310058; 2. 浙江省淡水水產(chǎn)研究所, 湖州 313001)

為發(fā)展翹嘴紅鲌Erythroculter ilishaeformis(Bleeker)性別控制育種和單性養(yǎng)殖技術(shù), 利用AFLP技術(shù)對翹嘴紅鲌?zhí)吧后w中雌、雄各20個個體的基因組進行了遺傳多樣性和雌雄差異分析。用篩選出的8對AFLP多態(tài)性引物在太湖野生群體基因組中共檢測到319個位點, 其中多態(tài)性位點185個。通過對所有多態(tài)性位點在個體中的分布進行分析, 發(fā)現(xiàn)一個只在雄性個體中穩(wěn)定存在、在雌性個體中缺失的差異位點。在人工雌核發(fā)育翹嘴紅鲌群體只有雌性個體, 其基因組中也檢測不到該差異位點的存在。這些結(jié)果表明翹嘴紅鲌性別分化可能受到嚴格的遺傳調(diào)控, 該差異位點是雄性特有的性別分子標記。翹嘴紅鲌?zhí)吧后w目前的多態(tài)位點比率P=57.99%, 觀測等位基因數(shù)Na=1.5799±0.4943, 有效等位基因數(shù)Ne=1.3859±0.3971, Shannon’s信息指數(shù)I=0.3221±0.2987。這些統(tǒng)計分析結(jié)果與10年前對該群體的AFLP研究結(jié)果(P=51.21%,Na=1.512±0.500,Ne=1.252±0.371,I=0.218±0.275)相比沒有顯著差別(P＞0.05), 說明該群體目前還具有適度的遺傳多樣性。

翹嘴紅鲌; 基因組分析; 雌雄差異; 遺傳多樣性

翹嘴紅鲌Erythroculter ilishaeformis(Bleeker),又名翹嘴鲌, 隸屬鯉科、鲌亞科、鲌屬, 為中上層大型廣溫性淡水魚類, 是我國分布最廣的經(jīng)濟魚類之一。太湖流域的翹嘴紅鲌品質(zhì)優(yōu)良, 與銀魚、白蝦并稱“太湖三白”而名聞天下。近年來, 隨著翹嘴紅鲌人工養(yǎng)殖、繁殖技術(shù)的成熟及推廣, 該魚已經(jīng)成為中國特別是長江三角洲地區(qū)的主要名特淡水養(yǎng)殖品種[1]。翹嘴紅鲌雌魚比雄魚的個體大、生長速度快, 是有性別異形[2]特征的魚類。已有的育種實踐表明開發(fā)性別特異性分子標記, 是發(fā)展性別控制育種技術(shù), 實現(xiàn)這些魚類單性養(yǎng)殖而提高其養(yǎng)殖經(jīng)濟效益的重要技術(shù)途徑[3]。但目前與翹嘴紅鲌性別決定和分化相關(guān)的關(guān)鍵調(diào)控基因以及調(diào)控機制都不清楚, 與性別相關(guān)的基因組分子標記未見報道,限制了性別控制育種和單性養(yǎng)殖技術(shù)在翹嘴紅鲌養(yǎng)殖業(yè)中的應(yīng)用。

擴增片段長度多態(tài)性(Amplified fragment length polymorphism, AFLP)技術(shù)是1993年由Vos等[4]發(fā)明的一種DNA指紋技術(shù)。AFLP結(jié)合了限制性內(nèi)切酶片段長度多態(tài)性(Restriction fragment length polymorphism, RFLP)技術(shù)的穩(wěn)定性與PCR技術(shù)的高效性, 省去了RFLP的繁雜過程, 同時又克服了隨機擴增多態(tài)性DNA (Random amplified polymorphic DNA, RAPD)技術(shù)不穩(wěn)定的缺點, 是一種能有效揭示生物種間和種內(nèi)遺傳差異的高容量標記技術(shù)[5,6]。AFLP篩選信息量很大、可重復(fù)性很高[4], 這些優(yōu)點在性別連鎖標記的篩選中是微衛(wèi)星(Microsatellite)、RAPD等其他遺傳標記無可比擬的[7], 已成功應(yīng)用于多種動植物高密度遺傳圖譜的構(gòu)建、分子標記的篩選以及遺傳多樣性的研究[8—13]。目前, 利用AFLP技術(shù)已篩選到尼羅羅非魚(Oreochromis niloticus)[14]和黃顙魚(Pelteobagrus fulvidraco)[11,12]等重要水產(chǎn)養(yǎng)殖魚類的雄性或雌性特異分子標記并成功轉(zhuǎn)化為SCAR (Sequence characterized amplified regions)標記。黃顙魚的性別分子標記已經(jīng)成功應(yīng)用于性別控制育種和單性養(yǎng)殖[2,11]。因此, 本研究運用AFLP技術(shù)對翹嘴紅鲌?zhí)吧后w中大量雌、雄個體的基因組進行了遺傳多樣性分析, 發(fā)現(xiàn)和確定了翹嘴紅鲌基因組DNA中與性別相關(guān)的分子標記。這些結(jié)果為深入研究翹嘴紅鲌性別決定的遺傳機制[13]、發(fā)展翹嘴紅鲌性別控制育種和單性養(yǎng)殖技術(shù)提供了基礎(chǔ), 也為了解翹嘴紅鲌?zhí)吧后w目前的遺傳多樣性狀況提供了有重要價值的資料。

1 材料與方法

1.1 材料和試劑

從浙江湖州太湖水域多個地點隨機選取野生翹嘴紅鲌雌、雄各20尾, 剪取尾鰭置于液氮中進行快速冷凍處理, 隨后置于–80℃冰箱中保存。實驗中所用引物皆由上海生工生物工程有限公司合成,酶切相關(guān)試劑購自Thermo Scientific和BioLabs公司, 連接、預(yù)擴增及選擇性擴增所用相關(guān)試劑均購自TaKaRa公司。

1.2 DNA的提取

參照改進的酚/氯仿法[15]提取基因組DNA。提取的基因組DNA用分光光度計檢測OD值并進行瓊脂糖凝膠電泳檢查。A260nm/A280nm比值在1.7—2.0,且電泳結(jié)果顯示無降解、無蛋白質(zhì)污染的基因組DNA用于后續(xù)的AFLP分析。

1.3 AFLP分析

AFLP反應(yīng)體系參照Vos等[4]描述的方法進行,并對其中影響實驗結(jié)果的關(guān)鍵因素進行了優(yōu)化。AFLP接頭及預(yù)擴增引物序列見表1。正向和反向各8條選擇性擴增引物序列見表2。由這些正、反向的選擇性擴增引物排列組合成共64對不同的選擇性擴增引物。

限制性酶切使用EcoRⅠ(Thermo Scientific)和MseⅠ(Bio Labs)兩種限制性內(nèi)切酶, 在37℃水浴中同時對300 ng基因組DNA進行酶切, 反應(yīng)4h后于75℃金屬浴中對限制性內(nèi)切酶滅活12min。隨后取少量酶切產(chǎn)物在1%(w/v)的瓊脂糖凝膠中進行電泳檢測, 以確?；蚪MDNA被充分酶切。

連接取10 μL酶切產(chǎn)物, 使用1 μLMseⅠ接頭(50 μmol/ L)和1 μLEcoRⅠ接頭(5 μmol/ L)于22℃水浴中連接過夜。

預(yù)擴增預(yù)擴增反應(yīng)的體系為: 連接產(chǎn)物3 μL,MseⅠ預(yù)擴增引物(Mo 50 ng/μL) 1 μL,EcoRⅠ預(yù)擴增引物(Eo 50 ng/μL) 1 μL, PCR Buffer 2 μL, rTaq酶1 U, dNTP Mix (10 mmol/L)2 μL及ddH2O 10.8 μL。PCR反應(yīng)條件為: 先于94℃預(yù)處理5min; 而后按照94℃ 20s, 56℃ 30s, 72℃ 2min, 循環(huán)20次。預(yù)擴增完成后, 用ddH2O將產(chǎn)物稀釋20倍,–20℃條件下保存。

選擇性擴增取1 μL稀釋的預(yù)擴增產(chǎn)物, 加入14 μL如下反應(yīng)液:EcoRⅠ引物(2.5 μm/L) 1 μL,MseⅠ引物(5 μm/L) 1 μL, dNTP Mix (10 mmol/L)1.2 μL, rTaq酶1 U, PCR Buffer 1.5 μL, ddH2O 9.1 μL,混合后按如下PCR程序擴增: 94℃ 5min; 94℃ 30s,65℃ 30s (每循環(huán)降低 0.7℃), 72℃ 60s, 循環(huán)14次;94℃ 30s, 56℃ 30s, 72℃ 60s, 循環(huán)23次。

聚丙烯酰胺凝膠電泳及銀染選擇性擴增產(chǎn)物經(jīng)8%聚丙烯酰胺凝膠電泳分離, 隨后銀染顯色, 銀染完成后用凝膠成像系統(tǒng)掃描, 保存掃描結(jié)果用于后續(xù)的數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析。

表1 AFLP接頭及預(yù)擴增引物序列Tab. 1 Sequences of adapters and pre-amplified primers in AFLP analysis

表2 用于AFLP分析的選擇性擴增引物的名稱及序列Tab. 2 Selective amplification primers and their sequences used in AFLP analysis

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

AFLP標記為顯性標記, 在后代中的遺傳和分離中符合Mendel式遺傳規(guī)律, 種群中的AFLP標記位點遵循Hardy-Weinberg平衡。首先將重復(fù)性好且清晰的AFLP條帶進行統(tǒng)計, 建立原始數(shù)據(jù)矩陣。然后利用Popgen32軟件統(tǒng)計位點總數(shù)和多態(tài)位點數(shù), 并計算出多態(tài)位點比率(Percentage of polymorphic loci-P)、觀測等位基因數(shù)(Observed number of alleles-Na)、有效等位基因數(shù)(Effective number of alleles-Ne)以及Nei’s多樣性指數(shù)(Nei’s diversity index-H)和Shannon’s信息指數(shù)(Shannon’s information index-I)。

(1)多態(tài)位點比率是指在所有的檢測到的位點中多態(tài)位點所占的比例, 用其作為度量遺傳變異水平高低的指標。一個種群多態(tài)位點比率高, 說明這個種群適應(yīng)環(huán)境的能力強, 遺傳變異水平高; 反之,一個種群多態(tài)位點比率低, 說明這個種群適應(yīng)能力弱, 遺傳變異水平低。

計算公式為:P(%)=多態(tài)位點數(shù)/位點總數(shù)×100

(2)觀測等位基因數(shù)是所檢測到的等位基因數(shù)與所檢測到的總位點數(shù)之比。

計算公式為:Na=(多態(tài)位點數(shù)×2+單態(tài)位點數(shù))/位點總數(shù)。

(3)有效等位基因數(shù)是純合度的倒數(shù), 反映了群體的變異程度。有效等位基因數(shù)越接近觀測等位基因數(shù), 說明等位基因在群體的分布越均勻。

(4)Nei’s多樣性指數(shù)為各個位點的平均雜合度,可以反映各群體在幾個位點上的遺傳差異, 一般認為它是度量群體遺傳變異的一個較適合的參數(shù)。

H的計算公式為:H=1–∑Pi2,Pi為單個位點上的等位基因頻率。

(5)Shannon’s信息指數(shù)用來衡量群體多樣性的高低, 其值越大, 說明群體內(nèi)的變異越大。

I=–∑XiLnXi/N,Xi表示位點i在某個群體中的出現(xiàn)頻率,N表示該群體中檢測到的位點總數(shù)。

最后, 利用SPSS 19.0中的t檢驗對翹嘴紅鲌?zhí)吧后w2007年與2016年的遺傳參數(shù)進行差異顯著性檢驗,P值大于0.05認為差異不顯著。

2 結(jié)果

2.1 多態(tài)性AFLP引物的篩選

為從64對選擇性擴增引物組合中篩選出多態(tài)性引物, 我們在隨機取樣的6條翹嘴紅鲌基因組樣本上用這些引物進行了PCR產(chǎn)物擴增和電泳分析。結(jié)果表明有15對引物組合沒有擴增出清晰穩(wěn)定的產(chǎn)物電泳條帶, 49對引物組合能擴增出清晰穩(wěn)定的產(chǎn)物電泳條帶。對電泳產(chǎn)物條帶的分析顯示有42對引物在不同個體樣品上擴增出了不同的產(chǎn)物, 為多態(tài)性引物; 有7對引物在所有個體樣品上都擴增出同樣的產(chǎn)物, 為單態(tài)性引物(表3)。

然后我們從42對多態(tài)性引物中選擇圖譜清晰、重復(fù)性好且擴增產(chǎn)物條帶數(shù)較多、復(fù)雜程度中等的8對引物組合(E1/M7、E2/M5、E4/M5、E5/M1、E6/M6、E7/M5、E8/M6和E8/M8), 作為對翹嘴紅鲌?zhí)吧后w的所有個體基因組進行擴增分析的引物。

2.2 翹嘴紅鲌?zhí)饔蛉后w遺傳多樣性現(xiàn)狀

用所篩選的8對多態(tài)性引物, 對翹嘴紅鲌?zhí)吧后w40尾(雌、雄各20尾)個體的基因組分別進行PCR擴增和電泳的分析統(tǒng)計結(jié)果見表4。統(tǒng)計時取長度在80—587 bp, 且清晰、穩(wěn)定的電泳條帶(圖1)。8對多態(tài)性引物擴增出的位點數(shù)從35到45不等,擴增出的多態(tài)位點數(shù)從18到31不等。多態(tài)位點比率最高的引物組合是E8/M6(73.81%), 最低的引物組合是E4/M5(46.15%)。8對多態(tài)性引物總共擴增出319個可清楚分辨的位點, 其中多態(tài)性位點185個。遺傳多樣性統(tǒng)計分析結(jié)果顯示太湖流域翹嘴紅鲌野生群體目前的多態(tài)位點比率為57.99%; 觀測等位基因數(shù)為1.5799±0.4943; 有效等位基因數(shù)為1.3859±0.3971; Nei’s多樣性指數(shù)為0.2191±0.2102;Shannon’s信息指數(shù)為0.3221±0.2987(表5)。

表3 選擇性擴增引物篩選結(jié)果Tab. 3 Results of selective amplification primers screening results

表4 八對選擇性擴增引物組合擴增出的位點數(shù)和多態(tài)位點數(shù)Tab. 4 Number of total loci and polymorphic loci amplified by 8 primer pairs

圖1 引物E2/M5擴增產(chǎn)物的電泳圖譜Fig. 1 Gel electrophoretogram of the PCR products amplified by primer pair of E2/M5

太湖流域翹嘴紅鲌群體的遺傳多樣性已有研究報道, 2007年, 李建林等[16]采用RAPD技術(shù), 王偉等[17]采用AFLP和ISSR (Inter-simple sequence repeat)技術(shù)分別對太湖野生和養(yǎng)殖群體的遺傳多樣性進行了分析。為了解太湖流域翹嘴紅鲌野生群體的遺傳多樣性10年來的變化狀況, 我們將目前的遺傳多樣性狀態(tài)與2007年王偉[17]用AFLP方法所得的結(jié)果進行了比較(表5)。分析結(jié)果表明翹嘴紅鲌?zhí)吧后w的遺傳多樣性水平與2007年王偉[17]的AFLP研究結(jié)果差異不顯著(P＞0.05)。這些結(jié)果說明翹嘴紅鲌?zhí)吧后w的遺傳多樣性仍與2007年一樣處在較高的水平, 沒有降低。

2.3 翹嘴紅鲌性別差異的AFLP標記

我們進一步對檢測到的所有多態(tài)位點在翹嘴紅鲌雌、雄個體中的分布進行了分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)在引物組合E8/M6所檢測到的多態(tài)性位點中有一個差異位點在雄性個體中穩(wěn)定存在, 在雌性個體中不存在(圖2A)。這一結(jié)果提示該位點可能是翹嘴紅鲌雄性基因組中特有的位點。為了確定該位點與翹嘴紅鲌性別的關(guān)聯(lián)性, 我們檢測了人工誘導(dǎo)雌核發(fā)育群體的性別。在所檢測的2個不同雌核發(fā)育群體的483條魚和832條魚中, 沒有檢測到雄性個體的存在。我們進一步用E8/M6引物組合對隨機選取的20尾第二代雌核發(fā)育翹嘴紅鲌個體的基因組進行了分析。結(jié)果表明野生群體中存在的很多等位基因在雌核發(fā)育群體中已經(jīng)丟失, 其電泳條帶數(shù)遠少于野生群體, 不同的個體基因型差異很小, 沒有在任何個體電泳圖譜的相應(yīng)位置檢測到可分辨的雄性特有電泳條帶的存在(圖2B)。

表5 翹嘴紅鲌?zhí)吧后w2007年與2016年的遺傳參數(shù)比較(平均值±標準誤)Tab. 5 Comparison of genetic diversity parameters for E. ilishaeformis (Mean±SE)

3 討論

為研究翹嘴紅鲌雌、雄個體的遺傳差異以及其太湖流域野生群體的遺傳多樣性現(xiàn)狀, 我們對翹嘴紅鲌?zhí)吧后w雌、雄各20尾個體的基因組進行了AFLP分析。實驗篩選出8對高效的AFLP多態(tài)性引物, 用這些引物從翹嘴紅鲌?zhí)吧后w大量雌、雄個體的基因組檢測到了185個多態(tài)性位點。通過分析這些多態(tài)性位點在雌、雄個體中的分布, 我們發(fā)現(xiàn)一個在雄性個體中穩(wěn)定存在、在雌性個體中不存在的差異位點。在各有數(shù)個體的2個不同翹嘴紅鲌人工雌核發(fā)育群體中都沒有檢測到雄性個體的存在, 也沒有在其基因組中檢測到該差異位點的存在。這些結(jié)果說明所檢測到的性別差異位點是翹嘴紅鲌雄性特有的性別分子標記; 翹嘴紅鲌可能出現(xiàn)了初步的性染色體分化, 其性別分化受到了嚴格的遺傳調(diào)控。因此, 通過人工誘導(dǎo)雌核發(fā)育獲得全雌性魚, 再對部分雌核發(fā)育魚進行人工誘導(dǎo)性逆轉(zhuǎn)獲得生理上為雄性而遺傳上為雌性的個體即可進行性別控制育種, 實現(xiàn)翹嘴紅鲌的全雌養(yǎng)殖。

雄性特異AFLP分子標記的獲得, 為深入研究翹嘴紅鲌性別決定的遺傳機制、發(fā)展翹嘴紅鲌的性別控制育種和單性養(yǎng)殖技術(shù)提供了基礎(chǔ)。目前我們克隆了該雄性特異AFLP分子標記并進行了測序分析, 確定了該序列為非編碼序列, 并正在對其連鎖基因進行分析, 以將其轉(zhuǎn)換為SCAR標記。

翹嘴紅鲌?zhí)吧后w目前的多態(tài)位點比率P、觀測等位基因數(shù)Na、有效等位基因數(shù)Ne以及Shannon’s信息指數(shù)I與王偉[17]在2007年對太湖野生群體遺傳多樣性進行的AFLP分析數(shù)據(jù)差異不顯著(P＞0.05), 說明該群體目前還具有適度的遺傳多樣性。太湖是中國五大淡水湖之一, 河港縱橫, 河口眾多, 有主要進出河流50余條, 不同群體間基因交流機會大, 良好的自然條件為翹嘴紅鲌?zhí)峁┝藘?yōu)越的生活環(huán)境, 可能是其遺傳多樣性仍然能保持在較高水平的原因。但是過度捕撈、環(huán)境污染以及人工養(yǎng)殖的單一生態(tài)環(huán)境和高近親繁殖機率仍然是翹嘴紅鲌?zhí)吧后w遺傳多樣性的重要威脅, 在漁業(yè)管理中不能過度樂觀。

圖2 引物E8/M6擴增產(chǎn)物的電泳圖譜(箭頭示差異條帶)Fig. 2 Gel electrophoretogram of the PCR products amplified by primer pair of E8/M6(arrows indicate the differential band)

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AFLP ANALYSIS ON GENOMIC SEXUAL DIMORPHISM OF ERYTHROCULTER ILISHAEFORMIS AND CURRENT GENETIC DIVERSITY OF THE TAIHU STRAIN

LIU Xiang-Fang1, ZHENG Jian-Bo1, JIA Yong-Yi2, GU Zhi-Min2and LUO Chen1
(1. College of Life Sciences, Zhejiang University, Hangzhou 310058, China;2. Zhejiang Institute of Freshwater Fisheries, Huzhou 313001, China)

The Taihu strain ofErythroculter ilishaeformisis a premium aquaculture species and is now widely cultivated in the Yangtze River Delta freshwater region. Under captivity, sexual dimorphism in somatic growth is very common with female being faster grower and having larger body size compared with male. Therefore, manipulating sex for all-female population ofE. ilishaeformiscan substantially increase aquaculture production and economic benefits.However, the key regulatory genes and mechanisms affecting sex determination and differentiation ofE. ilishaeformisare still unclear and no gender-related molecular marker has been reported yet. Consequently, developing the technique for the monosexual production ofE. ilishaeformisremains difficult in the breeding program at present. To develop the technology, the genetic diversity and genomic sexual dimorphism of the Taihu strain were analyzed by AFLP (amplified fragment length polymorphism) molecular marker technique. The sampling size was 20 male and 20 female individuals, respectively. A total of 319 loci were detected using 8 pairs of polymorphic primers. Of the 319 detected loci,185 loci displayed polymorphism. By analyzing the distribution of the polymorphic loci in all the examined individuals,we discovered a locus that was only existing among male individuals and was absent among females. In consistent with this observation, no male individual was detected in the artificial gynogenetic group of theE. ilishaeformis, and the locus was not detected in the genome of all examined gynogenetic individuals. The results suggested that sex determination and differentiation in this species may be strictly controlled by genes located in that specific region, and that gender difference locus we detected can be used as a male-specific marker. Our statistical analysis showed that the percentage of polymorphic loci of Taihu strain was 57.99%, the observed number of alleles of Taihu strain was 1.5799±0.4943, the effective number of alleles of Taihu strain was 1.3859±0.3971, and the Shannon’s information index of the population was 0.3221±0.2987. These data indicated that the genetic diversity of Taihu strain is moderate and is maintained at a similar level (P=51.21%,Na=1.512±0.500,Ne=1.252±0.371,I=0.218±0.275) compared with the results obtained 10 years ago.

Erythroculter ilishaeformis; Genome analysis; Sexual dimorphism; Genetic diversity

Q346+.5

A

1000-3207(2017)06-1200-07

2016-12-27;

2017-04-26

浙江省重點研發(fā)計劃(2016C02055-1)資助 [Supported by Zhejiang Science and Technology Major Program (2016C02055-1)]

劉祥芳(1991—), 女, 山東日照人; 碩士; 主要從事魚類遺傳學(xué)研究。E-mail: 1559023141@qq.com

羅琛, 男, 教授, 博士生導(dǎo)師; 主要從事細胞與發(fā)育生物學(xué)研究。E-mail: luoc@zju.edu.cn

10.7541/2017.149