李 軍 韓英倫 徐 磊 馬慶華 宋 濤 董彥嬌 劉 欣逄 越 李慶偉

(1. 遼寧師范大學生命科學學院, 大連 116081; 2. 遼寧師范大學七鰓鰻研究中心, 大連 116081; 3. 遼寧省淡水水產(chǎn)科學研究院,遼寧省水生動物病害防治重點實驗室, 遼陽 111000)

日本七鰓鰻胚胎發(fā)育及卵黃囊期仔魚的異速生長

李 軍1,2,3韓英倫1,2徐 磊1,2馬慶華1,2宋 濤1,2董彥嬌1,2劉 欣1,2逄 越1,2李慶偉1,2

(1. 遼寧師范大學生命科學學院, 大連 116081; 2. 遼寧師范大學七鰓鰻研究中心, 大連 116081; 3. 遼寧省淡水水產(chǎn)科學研究院,遼寧省水生動物病害防治重點實驗室, 遼陽 111000)

通過觀察日本七鰓鰻Lampetra japonica(Martens, 1868)胚胎外部形態(tài)和內(nèi)部組織結(jié)構(gòu)變化, 描述受精卵從卵裂至器官形成以及仔魚孵出的發(fā)育階段, 采用實驗生態(tài)學方法研究卵黃囊期仔魚的異速生長模式。結(jié)果表明: 日本七鰓鰻卵子為乳白色, 呈卵圓形; 受精卵卵裂方式為全卵裂; 胚胎發(fā)育過程主要包括卵裂期、囊胚期、原腸胚期、神經(jīng)胚期、頭凸期、孵出前期和孵出期, 歷時11—12d; 初孵仔魚為乳白色, 全長約(3.41±0.24) mm,體質(zhì)量約為0.0006 g。日本七鰓鰻胚胎發(fā)育研究可為了解七鰓鰻胚胎發(fā)育過程, 早期脊椎動物的起源和發(fā)育進化研究提供參考。卵黃囊期內(nèi)仔魚身體各部分中, 頭長和尾長均表現(xiàn)出快速生長, 同在7 日齡出現(xiàn)生長拐點, 且生長拐點后的生長速率都大于生長拐點前的生長速率; 而仔魚體長在卵黃囊期內(nèi)表現(xiàn)出慢速生長。在頭部器官中, 吻長、鰓前長和鰓長均表現(xiàn)出快速生長現(xiàn)象, 吻長和鰓長分別在9日齡和8日齡出現(xiàn)生長拐點; 口笠長在3日齡時出現(xiàn)生長拐點, 在生長拐點前為等速生長, 而在生長拐點后表現(xiàn)出快速生長; 眼徑和眼鰓間距則分別表現(xiàn)出等速生長和慢速生長。泄殖孔在卵黃囊期內(nèi)未出現(xiàn)生長拐點, 生長速率相對于全長生長速率表現(xiàn)出快速生長現(xiàn)象。七鰓鰻卵黃囊期仔魚的異速生長是在長期進化過程中, 適應早期生活環(huán)境和獨特的生活方式而形成特有的發(fā)育機制。

日本七鰓鰻; 胚胎發(fā)育; 卵黃囊期仔魚; 異速生長

七鰓鰻隸屬于脊椎動物亞門(Vertebrata)、圓口綱(Cyclostomata)、七鰓鰻目(Petromyzoniformes)、七鰓鰻科(Petromyzonidae), 在地球上已生活約3.5億年, 是最低等的無頜類脊椎動物之一[1]。七鰓鰻在進化過程中具有特殊地位, 已成為研究脊椎動物起源和進化的關鍵物種, 是聯(lián)系無脊椎動物與脊椎動物間的重要階元。研究表明, 七鰓鰻是研究神經(jīng)嵴、外胚層基板以及有頜等脊椎動物重要特性起源和進化[2—4]、適應性免疫應答機制起源和演化[5,6]以及脊椎動物腦系統(tǒng)發(fā)育[7]的模式動物, 對理解和揭示脊椎動物起源和進化具有重要意義。

胚胎學是研究個體發(fā)生過程和規(guī)律的科學, 包括形態(tài)變化、發(fā)生機理以及影響胚胎發(fā)育的因素。胚胎學不僅對生產(chǎn)實踐有指導作用, 同時對從理論上認識個體發(fā)生規(guī)律具有重要意義。作為研究脊椎動物起源和發(fā)育進化的模式生物[2—4], 胚胎發(fā)育是七鰓鰻研究中一個重要領域[8—12]。七鰓鰻胚胎與爪蟾和斑馬魚胚胎具有相似的生物學特性,如雙層的卵膜、卵膜透明和卵子個體較大[11], 除此以外, 七鰓鰻懷卵量大, 胚胎發(fā)育溫度低, 發(fā)育時間長等特點, 更適于進行胚胎早期進化研究, 是理想的脊椎動物起源和發(fā)育進化研究模型。目前, 對七鰓鰻胚胎發(fā)育已有一些研究報道, 如Damas[12]觀察Lampetra fluviatilis胚胎發(fā)育, Piavis[8]對Petromyzon marinus胚胎發(fā)育時期特征進行了描述, Yamazaki等[10]研究Entosphenus tridentatus胚胎發(fā)育過程, 但以上研究以七鰓鰻胚胎發(fā)育形態(tài)學描述為主, 并未對胚胎內(nèi)部結(jié)構(gòu)的變化開展系統(tǒng)組織學研究。日本七鰓鰻Lampetra japonica(Martens, 1868)是分布在我國3種七鰓鰻中唯一的洄游七鰓鰻[13]。在本研究中結(jié)合日本七鰓鰻胚胎發(fā)育過程中外部形態(tài)和內(nèi)部組織構(gòu)造變化, 系統(tǒng)地描繪了日本七鰓鰻胚胎早期發(fā)育過程, 為早期脊椎動物的起源和發(fā)育進化研究提供參考。

異速生長是指生物體某一特征的相對生長速率不等于第二種特征的相對生長速率, 該現(xiàn)象廣泛存在于動植物的生長模式中[14,15]。生物體的特定器官在早期發(fā)育中具備比身體整體更快或更慢的生長速率, 以這種異速生長的特征確保重要的器官優(yōu)先發(fā)育, 增加存活的機率, 是動植物長期適應外界環(huán)境, 進化保留下來的發(fā)育特征和策略[14]。研究日本七鰓鰻卵黃囊期仔魚早期生長發(fā)育, 可以掌握不同器官在不同發(fā)育階段特征、生長速率以及器官發(fā)育的基礎數(shù)據(jù), 了解各器官在發(fā)育中所起的重要作用, 解釋其在生存環(huán)境中某些行為, 具有重要的生態(tài)學意義。

1 材料與方法

1.1 實驗材料與飼養(yǎng)條件

2015年12月在烏蘇里江撫遠段捕獲生殖洄游的日本七鰓鰻群體為親本, 于12月至次年4月在循環(huán)水養(yǎng)殖水槽暫養(yǎng), 暫養(yǎng)期間水溫為6—10℃。在其繁殖季節(jié), 觀察第二性征來鑒別其性腺成熟度,進行人工繁殖。日本七鰓鰻胚胎發(fā)育時期參照Piavis[8]。將同一批人工授精獲得受精卵為胚胎發(fā)育材料, 并輔以兩批受精卵作為補充材料, 在解剖鏡下, 觀察胚胎發(fā)育形態(tài)特征和記錄起始時間, 當其中50%以上胚胎出現(xiàn)某個時期發(fā)育特征則記為該發(fā)育階段的起始時間。各發(fā)育時期分別隨機選取50—100 枚胚胎, 用4%多聚甲醛固定, 4℃保存,待試驗結(jié)束后, 剔除卵膜, 在解剖鏡下觀察攝像。試驗用水為充分曝氣的自來水, 孵化溫度控制在(20±1)℃, 每天換等溫水2 次, 換水量為孵化缸內(nèi)水量的1/3, 及時清除死卵。

1.2 日本七鰓鰻的各胚胎發(fā)育時期組織切片

參照樓允東和王逸妹[16]的方法固定胚胎, 將50—100枚不同發(fā)育時期胚胎用4%多聚甲醛固定,再置于15—20倍體積的Smith氏液中固定16—24h,用流水充分沖洗后, 剔除卵膜。采用冰凍切片方法制作切片, 切片厚度為2.5 μm, 常規(guī)HE染色, 中性樹膠封片, 拍照, 避光保存。

1.3 日本七鰓鰻卵黃囊期仔魚的異速生長

選取同一天孵出仔魚用于試驗, 直至仔魚的卵黃囊完全吸收即為實驗結(jié)束, 實驗周期為16d。仔魚在養(yǎng)殖缸中(50 cm×50 cm×50 cm)靜水養(yǎng)殖(水高為40 cm), 每天取15尾仔魚, 在解剖鏡下觀察, 測量以及攝像。試驗仔魚用MS-222 (100 mg/L)麻醉, 在解剖鏡下拍照并測量吻長、眼徑、眼鰓間距、口笠長、鰓前長、鰓長、頭長、體長、尾長、泄殖孔長和全長各形態(tài)學指標, 精確至1 μm, 所有量度指標以平行于魚體水平軸為基準(圖1)。養(yǎng)殖溫度控制在(20±1)℃, 每天換等溫水1 次, 換水量為養(yǎng)殖缸水量的1/3, pH在7.2±0.1, 保持水中溶氧在5.0 mg/L以上。

1.4 數(shù)據(jù)處理

圖1 日本七鰓鰻卵黃囊期仔魚測量圖Fig. 1 Illustration of measurement of Lampetra japonica yolk-sac larvae

2 結(jié)果

2.1 日本七鰓鰻胚胎發(fā)育

日本七鰓鰻成熟卵子為乳白色, 卵質(zhì)均勻, 呈卵圓形, 其長徑和短徑分別為(0.846±0.039)和(0.759±0.026) mm。在卵子受精后, 迅速吸水膨脹,受精膜高高舉起, 受精膜外具有膠質(zhì)膜(圖版Ⅰ-1)。

卵裂期受精后約6—8h, 開始第一次卵裂,分裂溝最終將分裂球分成兩個大小相似、緊密相連的半球形細胞(圖版Ⅰ-2)。第一次卵裂后, 約每2h進行一次卵裂, 分裂球分別進入4細胞期 (圖版Ⅰ-3), 8細胞期 (圖版Ⅰ-4、5), 16細胞期 (圖版Ⅰ-6)和32細胞期(圖版Ⅰ-7), 細胞個體逐漸減小, 卵裂溝清晰。卵裂期細胞內(nèi)均勻分布大量橢圓形卵黃粒,呈藍紫色(圖版Ⅱ-1—11)。在4細胞早期, 分裂球中心出現(xiàn)空隙(圖版Ⅱ-3); 隨胚胎發(fā)育, 細胞個體減小, 空隙增大, 形成一空腔(圖版Ⅱ-5), 在以后卵裂期, 分裂球內(nèi)部空腔體積逐漸增大(圖版Ⅱ-7和9)。8細胞期有兩種卵裂方式, 一種是在分裂球表面同時出現(xiàn)2條卵裂溝, 與第一次出現(xiàn)的卵裂溝相垂直,分裂成8個細胞, 細胞排成兩行, 每行4個(圖版Ⅰ-4); 另一種為出現(xiàn)1條卵裂溝, 與第一次和第二次出現(xiàn)的卵裂溝垂直, 分裂球分為上下兩層, 每層4個細胞(圖版Ⅰ-5)。

囊胚期受精后約16—18h, 進入64細胞期(圖版Ⅰ-8)。這一時期分裂球的體積明顯增大, 細胞明顯減小, 卵裂溝清晰。由于動物極細胞分裂比植物極細胞快, 導致動物極細胞個體明顯小于植物極細胞。圖版Ⅱ-12表明, 分裂球由單層細胞組成,形成囊胚腔, 細胞內(nèi)卵黃粒分布均勻(圖版Ⅱ-13)。

原腸期受精后約18—20h, 胚胎進入128細胞期, 細胞減小, 細胞界線明顯(圖版Ⅰ-9), 胚胎發(fā)育成由多層細胞組成的原腸胚(圖版Ⅱ-14)。約2h后, 胚胎進入256細胞期, 細胞進一步減小, 卵裂溝比較清晰(圖版Ⅰ-10)。在128和256細胞期(圖版Ⅱ-14—19), 胚胎內(nèi)部的空腔逐漸減小, 植物極細胞明顯大于動物極細胞; 細胞內(nèi)有大量卵黃粒; 在細胞近中央部位可見藍紫色細胞核, 稍大于卵黃粒,形狀為長條形或近橢圓形; 在細胞核周圍, 卵黃粒數(shù)量少, 個體較小。受精后約22—70h, 隨細胞分裂次數(shù)的增加, 細胞個體減小, 細胞數(shù)量增加, 細胞間界線模糊, 整個胚胎發(fā)育成表面光滑的圓球型(圖版Ⅰ-11), 細胞層加厚(圖版Ⅱ-20), 細胞間結(jié)合緊密(圖版Ⅱ-21和22)。受精后約3—5d, 在胚胎植物極一端形成一拱形狹長的裂縫(圖版Ⅰ-12), 隨動物極細胞的增加、移動和包裹, 胚胎體積明顯減小, 胚孔不斷的內(nèi)陷和擴大, 并逐漸向胚胎的腹面移動(圖版Ⅰ-13、圖版Ⅱ-23—25); 與此同時, 由于胚孔的背側(cè)開始增厚, 胚胎背側(cè)變得平直, 并向動物極一側(cè)延伸(圖版Ⅱ-25—28)。

神經(jīng)胚受精后5—6d, 胚胎進入神經(jīng)胚期。胚孔背側(cè)增厚已延伸至胚胎最前端, 胚體增厚,從而使胚胎背側(cè)較平直, 呈倒三角形(圖版Ⅰ-14和圖版Ⅱ-29—31、33、34), 胚胎背部的外胚層不斷增厚, 形成神經(jīng)基板; 神經(jīng)板兩側(cè)外胚層隆起, 出現(xiàn)兩條縱褶(神經(jīng)褶), 在胚胎背中線形成神經(jīng)溝(圖版Ⅰ-14、15和圖版Ⅱ-35、36), 此時胚體大約環(huán)抱2/3卵黃囊(圖版Ⅰ-14和圖版Ⅱ-29)。胚孔移至胚體的腹面(圖版Ⅰ-14和圖版Ⅱ-31—33)。左右神經(jīng)褶被牽引至背中線合并, 形成神經(jīng)管。

頭凸期受精后6—8d, 胚胎進入頭凸期, 頭部明顯隆起, 凸出于卵黃囊, 在頭部的腹面前部可見凹痕, 胚體增厚, 環(huán)抱3/4卵黃囊, 神經(jīng)管在胚胎背部明顯凸起, 從頭部延伸至胚孔, 胚孔移至卵黃囊末端, 球型的卵黃囊位于胚胎的后部, 約占整個胚胎的1/2(圖版Ⅰ-16)。從胚胎的腹面觀察, 可見頭部咽部凸起, 胚孔位于其頭部的下方(圖版Ⅰ-17),從胚胎的背面可觀測到, 胚胎背部神經(jīng)管明顯凸起(圖版Ⅰ-18)。由圖版Ⅱ-37、38可見, 頭凸期頭部的咽部已形成咽囊腔, 在胚體的背部可見肌節(jié)。

孵出前期受精后8—11d, 胚胎進入孵出前期, 胚體進一步拉伸, 頭部和尾部伸長, 卵黃囊由球型收縮呈長條狀, 胚胎在卵膜內(nèi)卷曲, 不停顫動, 轉(zhuǎn)動(圖版Ⅰ-19)。切片顯示, 其消化道已開始發(fā)育, 咽囊腔進一步擴大, 胚胎具有大大的卵黃囊(圖版Ⅱ-39), 在卵黃囊末端可見肌節(jié)和神經(jīng)管(圖版Ⅱ-40)。

孵出期在受精后11—12d, 仔魚破膜。初孵仔魚為乳白色, 尾部未伸直, 呈“J”型, 側(cè)臥缸底部, 偶爾擺動頭部, 極少游動。在初孵仔魚頭部腹面可見兩凹痕, 分別為鼻和口的雛形, 同時在頭部可見鰓孔雛形。在頭部后面, 卵黃囊的前面, 可見心和肝, 但未見心臟跳動。卵黃囊呈長條型。背部肌節(jié)明顯, 從頭部延伸至尾部(圖版Ⅰ-20)。初孵仔魚全長約(3.41±0.24) mm, 體質(zhì)量約為0.0006 g。

隨仔魚發(fā)育, 卵黃囊逐漸減小, 身體發(fā)育平直。在第2至第3天, 可見其7對鰓孔, 自前向后, 逐漸減小。頭部沉著色素, 在尾部可見肛門雛形。仔魚孵出后第3至第5天, 可見其心臟跳動, 心臟內(nèi)充滿紅色血液。孵出后第5至第7天, 仔魚自由游動,眼點有色素沉著, 仔魚鉆入沙土中, 營穴居生活。卵黃囊在孵出后15—16d, 完全吸收。

2.2 日本七鰓鰻卵黃囊期仔魚的異速生長

圖2 日本七鰓鰻卵黃囊期仔魚日齡與全長的關系Fig. 2 Correlation between total length and day age of Lampetra japonica yolk-sac larvae

全長和日齡的關系 如圖2所示, 日本七鰓鰻卵黃囊期仔魚的全長隨日齡的增加而增長, 全長與日齡的關系符合Brody方程y=7.362(1–0.525e–0.152x),R2=0.9935, 擬合效果較好。初孵仔魚全長為(3.41±0.24) mm, 在卵黃囊期發(fā)育過程中, 卵黃囊隨日齡增加而逐漸減小, 經(jīng)15d生長, 其卵黃囊被完全吸收, 此時仔魚全長可達(7.03±0.18) mm。

卵囊期仔魚身體各部分的異速生長: 日本七鰓鰻仔魚在卵黃囊期發(fā)育過程中, 頭長、體長和尾長均隨日齡增加而增長, 其頭長、體長和尾長均表現(xiàn)出異速生長(圖3)。仔魚頭長和尾長均在7日齡出現(xiàn)生長拐點[頭長(1.472±0.051) mm, 尾長(0.388±0.029) mm, 全長(6.049±0.198) mm], 在生長拐點前其異速生長指數(shù)分別為1.352 (P＜0.05)和2.265 (P＜0.05), 在生長拐點后其異速生長指數(shù)分別為2.458 (P＜0.05)和3.468 (P＜0.05), 頭長和尾長生長速率相對于全長生長速率均表現(xiàn)出快速生長, 生長拐點后異速生長指數(shù)明顯增大。而仔魚體長在卵黃囊期內(nèi)未出現(xiàn)生長拐點, 其異速生長指數(shù)b=0.602 (P＜0.05), 表現(xiàn)出慢速生長。

圖3 日本七鰓鰻卵黃囊期仔魚身體各部分異速生長曲線及表達函數(shù)Fig. 3 Allometric growth curve and function of body parts of Lampetra japonica yolk-sac larvae

圖4 日本七鰓鰻卵黃囊期仔魚頭部各器官的異速生長曲線及表達函數(shù)Fig. 4 Allometric growth curve and function of head organs of Lampetra japonica yolk-sac larvae

頭部器官的異速生長: 在卵黃囊期內(nèi), 日本七鰓鰻仔魚的頭部器官中, 吻長、眼徑、眼鰓間距、口笠長、鰓前長和鰓長均隨日齡的增加而增長, 但其生長速率相對于全長的生長速率并不相同(圖4)。仔魚吻長的生長拐點出現(xiàn)在9日齡[吻長: (0.481±0.051) mm, 全長: (6.469±0.178) mm], 生長拐點前后的異速生長指數(shù)分別為2.929 (P＜0.05)和 2.760(P＜0.05), 吻長生長速率快于全長生長速率, 表現(xiàn)出異速生長現(xiàn)象 (圖4a)。仔魚眼徑的異速生長指數(shù)b為1.078 (P＞0.05), 表現(xiàn)出等速生長, 數(shù)據(jù)分析表明日本七鰓鰻眼徑在卵黃囊期內(nèi)未出現(xiàn)生長拐點(圖4b)。眼鰓間距在卵黃囊期發(fā)育中未出現(xiàn)生長拐點,其異速生長指數(shù)(0.577)與1之間具有顯著性差異(P＜0.05), 表現(xiàn)出慢速生長(圖4c)?？隗议L在3日齡時出現(xiàn)生長拐點[口笠長: (0.227±0.015) mm, 全長:(5.061±0.149) mm], 在生長拐點前其異速生長指數(shù)為1.057 (P＞0.05), 表現(xiàn)出等速生長; 而在出現(xiàn)生長拐點后, 其異速生長指數(shù)為1.729 (P＜0.05), 表現(xiàn)出快速生長(圖4d)。鰓前長在卵黃囊期內(nèi)未出現(xiàn)生長拐點, 其異速生長指數(shù)為1.835 (P＜0.05), 為快速生長(圖4e)。仔魚的鰓長在8日齡出現(xiàn)生長拐點[鰓長: (0.884±0.050) mm, 全長: (6.176±0.226) mm], 生長拐點后的異速生長指數(shù)(2.652,P＜0.05)要明顯高于生長拐點前的異速生長指數(shù)(1.445,P＜0.05), 表現(xiàn)為快速生長(圖4f)。

其他器官的異速生長: 如圖5所示, 日本七鰓鰻仔魚泄殖孔在卵黃囊期內(nèi)未出現(xiàn)生長拐點。泄殖孔的異速生長指數(shù)b為1.214 (P＜0.05), 其生長速率相對于全長生長速率表現(xiàn)出快速生長現(xiàn)象。

3 討論

3.1 日本七鰓鰻的胚胎發(fā)育

圖5 日本七鰓鰻卵黃囊期仔魚泄殖孔異速生長曲線及表達函數(shù)Fig. 5 Allometric growth curve and function of cloacal length of Lampetra japonica yolk-sac larvae

生物在其生活史進化中形成不同的生物學特征, 表明生活史多態(tài)性[17]。卵徑是反映生物生活史進化過程的一個重要的生物學特征, 其大小與環(huán)境相關, 是長期適應環(huán)境的結(jié)果。如生活在淡水中的溪水型七鰓鰻, 其卵徑要大于洄游型七鰓鰻卵徑[18,19],這可能由于七鰓鰻的產(chǎn)卵場位于河流的上游, 其生存環(huán)境惡劣(餌料缺乏, 水溫低, 水流速快), 較大卵子能增加生存的機率[20]。Yamazaki等[19]認為, 七鰓鰻表型特征向具有較小體型(繁殖期)、相對較大卵徑以及低繁殖力的特征進化。在本研究中, 日本七鰓鰻卵子的形態(tài)特征與P. marinus[8]和Lethenteron japonicum[19]相似; 其卵徑[長徑: (0.846±0.039) mm,短徑: (0.759±0.026) mm]與P. marinus卵徑[8](1.0±0.2) mm和L. japonicum[19][長徑: (1.04±0.10) mm,短徑: (0.94±0.11) mm)]相近, 而小于溪水型Lethenteron reissneri[長徑: (1.14±0.07) mm, 短徑: (1.01±0.08) mm]。

作為研究脊椎動物起源和發(fā)育進化的模式生物[2—4], 七鰓鰻早期胚胎發(fā)育研究具有重要的意義。本研究結(jié)合日本七鰓鰻胚胎發(fā)育過程中各時期外部形態(tài)特征和胚胎內(nèi)部結(jié)構(gòu)特點, 劃分日本七鰓鰻胚胎發(fā)育時期。研究表明, 日本七鰓鰻胚胎發(fā)育過程與L. fluviatilis[12]、P. marinus[8]和E. tridentatus[10]相似, 胚胎發(fā)育過程主要有卵裂期、囊胚期、原腸胚期、神經(jīng)胚期和頭凸期、孵出前期和孵出期。Piavis[8]認為, 在P. marinus卵裂過程中32細胞期形成由單層細胞圍繞的空心分裂球, 囊胚期在64細胞期后, 以分裂球呈光滑的圓球型、胚胎體積增大和動物極透明程度等形態(tài)學指標確定囊胚期; 胚胎在囊胚期后進入原腸期, 原腸期標志性事件是胚孔的形成。Yamazaki等[10]僅依據(jù)胚胎發(fā)育的外部形態(tài)特征(分裂球表面光滑程度)確定胚胎囊胚期, 以胚孔形成確定胚胎進入原腸期。囊胚期和原腸期是胚胎發(fā)育的兩個重要時期。劃分這兩個時期不僅依據(jù)其外部形態(tài)特征, 還應結(jié)合胚胎內(nèi)部結(jié)構(gòu)變化特點。囊胚期胚胎內(nèi)部結(jié)構(gòu)特征是形成由單層細胞包圍囊胚腔, 而原腸期主要事件是細胞遷移內(nèi)置囊胚腔以及后期胚孔發(fā)育事件[21]。日本七鰓鰻在64細胞期形成一由單層細胞包圍的分裂球, 在隨后128細胞期, 由于原腸化作用, 其內(nèi)部結(jié)構(gòu)發(fā)生明顯變化, 發(fā)生細胞內(nèi)置事件, 細胞遷移進囊胚腔內(nèi)部, 原腸胚形成。由日本七鰓鰻64細胞期和128細胞期外部形態(tài)和內(nèi)部結(jié)構(gòu)特征可以確定,分裂球在64細胞期和128細胞期分別進入囊胚期和原腸期。本研究通過觀察日本七鰓鰻不同胚胎發(fā)育時期外部形態(tài)變化, 結(jié)合其內(nèi)部組織構(gòu)造, 較為系統(tǒng)地描繪了日本七鰓鰻從受精卵卵裂至器官形成以及仔魚孵出的各個階段, 從形態(tài)和結(jié)構(gòu)2個方面的變化, 了解日本七鰓鰻胚胎發(fā)育過程, 為研究早期脊椎動物的起源和發(fā)育進化研究提供參考。

日本七鰓鰻的卵裂方式為全卵裂, 這與P. marinus[8]和E. tridentatus[10]卵裂方式完全相同, 與頭索動物亞門的文昌魚的卵裂方式[21]相同, 而與魚類的端黃卵的卵裂方式[21]不同。早期卵裂是在母型調(diào)控下進行的過程, 每個物種的卵裂方式由兩個方面決定: (1)卵質(zhì)中卵黃的含量及其分布情況; (2)卵質(zhì)中影響紡綞體方位角度和形成時間的一些因素。七鰓鰻屬全卵裂的卵裂方式。在其早期胚胎發(fā)育過程中, 細胞內(nèi)含有大量的卵黃粒, 卵黃顆粒大而且數(shù)量多, 利用常規(guī)的組織固定和切片法, 致使胚胎脆硬, 卵黃粒容易從胚體脫出致使切片破碎, 難于觀察胚胎內(nèi)部的組織結(jié)構(gòu), 是阻滯七鰓鰻胚胎切片技術發(fā)展的關鍵問題[22], 同時也阻礙七鰓鰻早期胚胎發(fā)育和組織學的深入研究。本研究七鰓鰻胚胎采用的是Smith液固定方法。Smith固定液為凝固型固定劑, 可以均勻凝固卵黃粒, 從而避免含有卵黃粒組織和細胞脆硬, 有效地解決胚胎脆硬問題,這是得到胚胎完整組織切片的前提和基礎。另外冷凍切片技術適用于科研和常規(guī)組織學研究, 減少胚胎處理過程和時間, 可在相對較短的時間內(nèi)得高質(zhì)量的切片。本文在日本七鰓鰻胚胎發(fā)育研究中采用Smith液固定方法結(jié)合利用冷凍切片技術得到了完整的不同發(fā)育時期胚胎切片, 不但完善七鰓鰻胚胎切片技術也為動物早期胚胎發(fā)育組織學研究提供可借鑒方法。

溫度是早期胚胎發(fā)育中的一個重要的環(huán)境因子。在一定的溫度范圍內(nèi), 不同溫度下七鰓鰻胚胎發(fā)育時間不同[8], 隨溫度的增高, 胚胎發(fā)育加快, 發(fā)育時間縮短, 不同發(fā)育時期重疊減小。如表1, 寄生類洄游型七鰓鰻(E. tridentatus、P. marinus和L. japonica)和非寄生類溪水型七鰓鰻(L. reissneri), 在不同溫度下, 胚胎發(fā)育時間略有不同, 七鰓鰻胚胎進入不同的發(fā)育時期的時間有隨溫度的增高而減少的趨勢。

表1 不同七鰓鰻胚胎發(fā)育時間Tab. 1 Post-fertilization times to reach successive developmental stages in Lampetra japonica and other lamprey species

3.2 日本七鰓鰻卵黃囊期仔魚的異速生長

生物體早期發(fā)育過程是重要而又復雜的過程,包括形態(tài)發(fā)生、身體外形、新陳代謝和生活行為等變化[23], 異速生長普遍存在于動植物早期發(fā)育過程中[24], 生物個體為適應生活環(huán)境, 優(yōu)先發(fā)育重要功能器官, 提高存活率, 在長期進化中形成了的個體發(fā)育機制和生存策略。

日本七鰓鰻仔魚頭長和尾長的生長拐點均在7日齡出現(xiàn), 與其開始營穴居生活時間基本一致, 可能與生活環(huán)境和生活方式有關。在生長拐點前, 孵出仔魚大部分時間側(cè)臥孵化缸的底部, 極少游動。而在生長拐點后, 仔魚游動能力增強, 游動時整個身體形成了波浪式擺動, 頭部在運動中保持著相對穩(wěn)定而左右擺動, 呈“S”型, 頭部和尾部在仔魚的游動過程中起到重要的作用, 這2個部分快速發(fā)育增強仔魚的游動能力。與頭部和尾部不同, 仔魚軀干部生長則表現(xiàn)為慢速生長, 這種負異速生長模式能有效控制魚體全長, 減少頭部和尾部之間的距離,利于調(diào)節(jié)身體的平衡, 增強仔魚的游泳能力, 減少運動代價[25,26]。其次頭部是仔魚早期大腦、視覺、呼吸和攝食器官發(fā)育的重要部分, 頭部的快速發(fā)育保證了重要器官的發(fā)育。再次頭部和尾部的正異速生長也為仔魚鉆沙土營穴居生活提供了必要的條件。在試驗中觀察到孵出后第6至第7天, 仔魚鉆入沙土過程中, 先是頭部接觸缸底部的沙土,隨后頭部和尾部擺動劇烈, 整個身體鉆入沙土中,頭部和尾部的快速生長, 大大提高其鉆沙土能力,保證其營穴居生活, 是七鰓鰻在進化過程中形成的個體發(fā)育機制。在生長拐點后, 頭部和尾部異速生長指數(shù)比拐點前明顯增大, 表明生長速率進一步加快。這可能與營穴居生活有關, 在穴居生活中, 仔魚在沙土中活動的阻力要遠遠大于其在水中游動的阻力, 頭部和尾部的快速生長發(fā)育對仔魚的活動能力更顯重要, 特別是要比生長拐點前(在水中)的生長速率還大, 大大增強其在沙土中的活動能力,適應穴居生活, 提高其生存機率, 是對其生活環(huán)境的適應性選擇。頭部和尾部的這種異速生長現(xiàn)象在其他魚類中也普遍存在[25—27], 是魚類長期進化過程中自然選擇的結(jié)果。日本七鰓鰻仔魚身體各部分的異速生長為其穴居生活奠定了物質(zhì)基礎, 有助于仔魚運動和躲避敵害, 適應生存環(huán)境。

在日本七鰓鰻仔魚的頭部器官中, 口笠是攝食的重要器官。在穴居生活期間, 卵黃囊耗盡后, 仔魚開始外源營養(yǎng)期, 以濾食腐植碎片、有機碎屑、浮游動物和浮游植物為生, 經(jīng)過約3—5年變態(tài)成成體[28,29]。仔魚濾食能力的強弱與口笠直接相關, 口笠的快速生長, 促進口笠的發(fā)育, 增強仔魚濾食能力以獲得充足的營養(yǎng)。口笠大小與吻長和和鰓前長密切相關, 吻長和和鰓前長快速發(fā)育為口笠的發(fā)育供了必要的空間。與口笠生長相一致, 仔魚泄殖孔在卵黃囊期內(nèi)也表現(xiàn)出快速生長現(xiàn)象, 消化器官的協(xié)調(diào)生長, 促進消化系統(tǒng)的發(fā)育, 為其從內(nèi)源性營養(yǎng)向外源性營養(yǎng)的轉(zhuǎn)化提供物質(zhì)條件。

鰓是日本七鰓鰻呼吸器官, 日本七鰓鰻仔魚在卵黃囊期內(nèi), 鰓長表現(xiàn)出快速生長, 其在8日齡出現(xiàn)生長拐點, 鰓長的生長拐點出現(xiàn)時間與其開始穴居生活的時間基本在同一時期, 生長拐點后的快速生長速率要明顯高于生長拐點前的生長速率, 這可能與其生活方式有關。在生長拐點前, 仔魚在生活在溶解氧較低的水底, 鰓長的快速生長保證仔魚能夠獲得足夠的溶解氧。而在生長拐點后, 仔魚開始營穴居生活, 其生活環(huán)境中的溶解氧更低, 鰓的快速生長, 促進鰓的發(fā)育和完善, 加大水流的交換量,保證仔魚在低溶氧的環(huán)境中獲得足夠的氧氣, 而眼鰓間距的慢速生長則為鰓的快速生長提供了必要的空間。

眼睛是動物重要的感覺器官, 魚類眼睛能較早完成快速生長階段, 不僅有利于其尋找食物, 而且有助于其感知和躲避敵害[25,27]。與魚類不同, 日本七鰓鰻仔魚眼徑在卵黃囊期內(nèi)表現(xiàn)出等速生長, 這與其生活暗環(huán)境有關。日本七鰓鰻仔魚孵出后在水底短時間營自由生活, 隨后開始漫長的穴居生活,主要生活在較暗的環(huán)境中, 同時其攝食也以濾食為主, 是一種被動攝食方式, 所以眼睛發(fā)育對于七鰓鰻仔魚早期生存作用較小。

通過對日本七鰓鰻卵黃囊期仔魚發(fā)育研究可知, 在早期發(fā)育過程中, 仔魚的攝食、呼吸和游泳器官均存在異速生長現(xiàn)象, 各種器官共同生長, 協(xié)調(diào)發(fā)育, 獲得與其早期生存方式密切相關的各種能力, 仔魚可在最短時間內(nèi)適應生活環(huán)境, 提高逃避敵害和攝食的能力。這是七鰓鰻在長期進化過程中, 適應環(huán)境形成特有的早期發(fā)育機制和獨特的生活方式, 是其能在殘酷的自然界存活的一個重要原因。

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EMBRYOLOGICAL STAGES AND ALLOMETRIC GROWTH DURING YOLKSAC LARVAE OF LAMPETRA JAPONICA (MARTENS)

LI Jun1,2,3, HAN Ying-Lun1,2, XU Lei1,2, MA Qing-Hua1,2, SONG Tao1,2, DONG Yan-Jiao1,2, LIU Xin1,2,PANG Yue1,2and LI Qing-Wei1,2
(1. College of Life Science, Liaoning Normal University, Dalian 116081, China; 2. Lamprey Research Center, Liaoning Normal University, Dalian 116081, China; 3. Liaoning Institute of Freshwater Fisheries Sciences, Liaoning Key Laboratory of Aquatic Animal Infectious Diseases Control and Prevention, Liaoyang 111000, China)

Early embryology of theLampetra japonicahas been studied based largely on external morphology and histology. In current study, ecological experiment was conducted to investigate the allometric growth ofL. japonicayolksac larvae. The results indicated the ovulated egg was creamy-white with the oval shape. The cleavage of zygote was holoblastic cleavage. The early embryology ofL. japonicahad been characterized into cleavage, blastula, gastrula,neural plate and groove, head, prehatching and hatching. The embryo breaks through the fertilization membrane at 11—12 day-post-fertilization. Newly-hatched larvae were (3.41±0.24) mm in total length and about 0.0006 g in weight.Study of the early embryology ofL. japonicamay provide the basis for understanding the origin and evolution development of vertebrates. During yolk-sac stage, head and tail length exhibited positive allometric growth, and trunk exhibited negative allometric growth. The inflection point was at 7 day-post-fertilization for both head and tail length. The head and tail length exhibited positive allometric growth before and after the growth inflection point and the growth was higher post the inflection point. In terms of the dimensions of organs in head, snout length, prebranchial length and branchial length exhibited positive allometric growth. The inflection point appeared at 9 day-post-hatch for snout length and at 8 day-post-hatch for branchial length, respectively. The inflection point of disc length occurred at 3 day-posthatch, and the disc length exhibited isometric allometric growth to the inflection point, then became positive allometric growth. The eye length was characterized by isometric allometric growth and had no inflection point. The postocular length exhibited negative allometric growth. The cloacal slit length exhibited positive allometric increase and hads no inflection point. The allometric growth pattern ofL. japonicayolk-sac larvae enabled rapid development of the organisms which has important function to adapt to the early life stage and increases their survival rate.

Lampetra japonica; Yolk-sac larvae; Early embryology; Allometric growth

Q132.4

A

1000-3207(2017)06-1207-11

2016-11-07;

2017-05-11

國家重大基礎研究發(fā)展規(guī)劃(973)計劃 (2013CB835304); 全國海洋公益項目(201305016); 國家自然科學基金(31170353、31202020、31601865); 遼寧省教育廳項目(L201683651); 遼寧省高等學校杰出青年學者成長計劃(LJQ2014117); 大連市科技計劃(2013E11SF056)資助 [Supported by the National Program on Key Basic Research Project (973 Program, 2013CB835304);National Marine Public Projects (201305016); the National Natural Science Foundation of China (31170353, 31202020, 31601865);Liaoning Provincial Department of Education Foundation (L201683651); Colleges and Universities in Liaoning Province Outstanding Young Scholar Growth Plans (LJQ2014117); Dalian Science and Technology Program (2013E11SF056)]

李軍(1975—), 男, 遼寧遼陽人; 博士研究生, 高級工程師; 主要研究方向為水產(chǎn)種質(zhì)資源。E-mail: lj_nwafu@163.com;韓英倫(1985—), 男, 吉林人; 博士, 講師; 主要研究方向為七鰓鰻免疫防御研究。E-mail: hanyinglun@163.com

逄越(1975—), 女, 遼寧大連人; 副教授, 碩士生導師; 主要從事細胞生物學研究。E-mail: pangyue01@163.com;李慶偉(1955—), 男, 遼寧大連人; 教授, 博士生導師; 主要從事細胞生物學研究。E-mail: liqw@263.net

10.7541/2017.150

圖版Ⅰ 日本七鰓鰻胚胎發(fā)育PlateⅠ Observation of embryonic development of Lampetra japonica

圖版Ⅱ 日本七鰓鰻各胚胎時期組織切片PlateⅡ Sagittal section of embryonic development of Lampetra japonica

doi: 10.7541/2017.151