鐘全福，陳 斌，樊海平，林 煜，卓玉琛，張晶晶

(福建省淡水水產(chǎn)研究所，福建 福州 350002)

饑餓是引起初次開口攝食期仔魚死亡的主要因素之一，不同種屬魚類仔魚對饑餓具有不同的耐受能力和適應(yīng)性[1-3]。目前，對早期仔魚耐受饑餓能力及饑餓不可逆點(diǎn)(PNR)的研究已較為深入，已經(jīng)對多種淡水魚類早期仔魚的初次開口攝食和饑餓耐受能力等方面進(jìn)行詳細(xì)的研究[4]，避免了早期仔魚進(jìn)入饑餓狀態(tài)，對提高仔魚早期階段的成活率具有重要的意義。

似魚句(Pseudogobiovaillanti)屬鯉科(Cyprinidae)、似魚句屬(Pseudogobio)，為小型底棲性魚類，俗稱“棍子魚”，分布于東亞大陸，在我國主要產(chǎn)于長江中游、閩江、北江、錢塘江、靈江、黃河和淮河等水系[5]；為溫帶魚類，以水生昆蟲幼蟲為主食，兼食硅藻、藍(lán)藻等，是一種因肉質(zhì)豐腴、味道鮮美而深受廣大消費(fèi)者喜愛的土著魚類[6]。隨著其自然資源量急劇減少，以及人們對自然資源保護(hù)意識的提高，似魚句魚類的資源保護(hù)和人工養(yǎng)殖技術(shù)研發(fā)受到了重視。近年來，似魚句在馴養(yǎng)繁育方面的研究工作也相繼開展并取得一些成果[7-8]，但研究報(bào)告僅見關(guān)于不同開口餌料對似魚句仔魚早期生長和存活的影響[9]、繁殖特性調(diào)查[10]和耐溫性研究[11]、肌肉氨基酸組成分析[12]以及系統(tǒng)發(fā)育[13]和地理分化[14-15]等研究。目前尚未見有關(guān)饑餓對似魚句早期仔魚卵黃囊的消化吸收、開口攝食和生長發(fā)育等影響及PNR的確定等方面的研究報(bào)道。由于饑餓對早期仔魚的影響極為明顯，因此本研究探討了饑餓脅迫對似魚句早期仔魚初次開口攝食和生長的影響，并確定了饑餓仔魚的PNR，以期為似魚句大規(guī)模人工育苗生產(chǎn)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)仔魚及生物餌料

試驗(yàn)于2020年5月在福建省南平市順昌縣兆興魚種養(yǎng)殖有限公司開展，似魚句初孵仔魚為該基地人工催產(chǎn)、孵化獲得的出膜時(shí)間較一致的同批次剛破膜的健康仔魚；對照組投喂的生物餌料為經(jīng)60篩網(wǎng)過濾后的池塘小型浮游動(dòng)物，其種類主要為臂尾輪蟲(Brachionus)、多枝輪蟲(Polyarthra)、龜甲輪蟲(Keratella)和象鼻溞(Bosmina)、裸腹溞(Moina)、溞(Daphnia)和秀體溞(Diaphanosoma)等枝角類及其幼體，其中枝角類及幼體所占比例約70%，輪蟲占30%左右。

1.2 試驗(yàn)方法

采用實(shí)驗(yàn)生態(tài)學(xué)方法觀測了饑餓脅迫對似魚句早期仔魚生長發(fā)育的影響，試驗(yàn)設(shè)置了饑餓脅迫試驗(yàn)組(以下簡稱“饑餓組”)、饑餓死亡“不可逆點(diǎn)”(PNR)試驗(yàn)組(以下簡稱“PNR組”)和正常投喂的對照組，每組設(shè)3個(gè)平行。試驗(yàn)容器為60 cm×50 cm×50 cm水簇箱，水位35 cm。試驗(yàn)用水為經(jīng)72 h完全曝氣的機(jī)井水，經(jīng)500目篩絹網(wǎng)過濾后使用。試驗(yàn)期間水溫為(25.5±1.2)℃，pH 7.3，水體適量充氣增氧，維持溶解氧大于5 mg/L。

試驗(yàn)開始時(shí)，每個(gè)水簇箱放養(yǎng)600尾初孵仔魚，饑餓組和PNR組始終不予投餌直至100%死亡；對照組在仔魚開口的前一天開始投喂小型浮游動(dòng)物，每天08：00 和17：00 各投喂1 次，每次投喂密度達(dá)10～15個(gè)/mL水體。每天吸污換水1次，每次換水1/3，并觀察仔魚行為和外部形態(tài)的變化，統(tǒng)計(jì)各組仔魚死亡情況。

試驗(yàn)開始后，每隔24 h從饑餓組和對照組中的每個(gè)水簇箱里各隨機(jī)取樣10 尾仔魚，在Leica EZ4D 雙目體視顯微鏡下測量仔魚全長、卵黃囊的長徑和短徑，ATY224 分析天平測量仔魚體質(zhì)量(稱量精度為0.1 mg)。仔魚卵黃囊體積測算參照汪帆等[16]的方法，當(dāng)卵黃囊為棒槌狀時(shí)，其體積按公式(1)計(jì)算；當(dāng)卵黃囊吸收縮成棒狀時(shí)，其體積按公式(2)計(jì)算。以仔魚全長、體質(zhì)量特定增長率(SGR)比較饑餓組和對照組的生長速率，SGR按照公式(3)、(4)[17-18]計(jì)算。仔魚肥滿度的計(jì)算參照黃真理等[19]和覃寶利等[20]的方法，求導(dǎo)仔魚全長與體質(zhì)量的冪函數(shù)回歸方程，采用相對狀態(tài)指數(shù)，按照公式(5)計(jì)算仔魚相對肥滿度。相關(guān)指標(biāo)的計(jì)算公式如下：

公式(2)：棒狀卵黃囊體積(V，mm3)=R×r2×π/12，式中R和r分別是棒狀卵黃囊長徑和短徑；

公式(3)：全長特定增長率(SGRL，%/d)=(lgL2-lgL1)/[0.434 3×(t2-t1)]×100%，式中L1和L2分別表示發(fā)育至?xí)r間t1和t2時(shí)的全長；

公式(4)：體質(zhì)量特定增長率(SGRW，%/d)=(lgW2-lgW1)/[0.434 3×(t2-t1)]×100%，式中：W1和W2分別表示發(fā)育至?xí)r間t1和t2時(shí)的體質(zhì)量；

公式(5)：相對肥滿度(F)=(W/Lb)×100，式中W和L分別為仔魚的體質(zhì)量和全長，b為仔魚全長與體質(zhì)量關(guān)系式回歸得到的冪函數(shù)指數(shù)。

在PNR組中的每個(gè)水簇箱里各隨機(jī)取樣20 尾仔魚，分別放入有效容積1 000 mL的燒懷中，微充氣，按照10～15個(gè)/mL水體的密度投喂小型浮游動(dòng)物，投喂3 h后將仔魚取出，在Leica DM750 生物顯微鏡下逐尾解剖檢查其攝食情況，參照韓曉磊等[21]的方法，按公式(6)計(jì)算初次攝食率，并確定饑餓仔魚的PNR，當(dāng)初次攝食率低于最高初次攝食率的1/2時(shí)，即為饑餓仔魚的PNR，用孵化后日齡表示。初次攝食率計(jì)算公式(6)：初次攝食率=(消化道內(nèi)有食物的仔魚尾數(shù)/測定仔魚總尾數(shù))×100%。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

采用 Excel 2007對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)、運(yùn)算和作圖處理；采用SPSS Statistics 17.0軟件進(jìn)行顯著性差異分析和相關(guān)方程回歸分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 饑餓仔魚卵黃囊的吸收及生長變化

在水溫(25.5±1.2)℃條件下，似魚句仔魚卵黃囊的吸收及生長變化情況詳見表1。似魚句初孵仔魚全長(3.87±0.07)mm，平均體質(zhì)量為(1.82±0.08)mg，卵黃囊顯棒槌形，體積為(0.102 1±0.013 8)mm3，無油球，前端膨大部顯橢球形，后端狹長部顯長棒形。由表1可知，0～4日齡饑餓組和對照組仔魚卵黃囊吸收基本一致，沒有顯著差異(P>0.05)，0～1日齡仔魚卵黃囊吸收最快，1日齡仔魚卵黃囊體積約為初孵仔魚的31%，顯長棒形，1～3日齡仔魚卵黃囊吸收相對較慢，至4日齡仔魚卵黃囊約為初孵仔魚的2.4%～2.5%；4日齡仔魚開口后，對照組仔魚卵黃囊在當(dāng)天就已消耗吸收完，而饑餓組仔魚卵黃囊的吸收明顯慢于對照組，在5日齡還可見卵黃囊為一細(xì)棒狀貼于仔魚腹部，體積約為(0.000 9±0.000 2)mm3，至6日齡才消耗殆盡，說明饑餓脅迫延緩了似魚句早期仔魚對卵黃囊的消耗吸收。對似魚句早期仔魚卵黃囊體積(V)和日齡(t)進(jìn)行回歸分析結(jié)果表明，仔魚對卵黃囊的吸收利用符合三項(xiàng)式：V=-0.005t3+0.040t2-0.101t+0.101(R2=0.995)。

表1 饑餓仔魚的生長及卵黃囊的吸收情況

仔魚在4日齡開口前完全依靠卵黃囊營養(yǎng)，與對照組相比，0～4日齡饑餓組仔魚全長和體質(zhì)量增長與對照組一致，沒有顯著差異(P>0.05)，5日齡饑餓組仔魚全長略低于對照組，但不存在顯著差異(P>0.05)，6日齡后均顯著低于對照組(P<0.05)，6日齡卵黃囊消失后，仔魚全長還能緩慢增長，8日齡達(dá)到最大值(5.26±0.19)mm，9～12日齡出現(xiàn)明顯萎縮；而5日齡后饑餓組仔魚體質(zhì)量顯著低于對照組(P<0.05)，饑餓組仔魚體質(zhì)量在5日齡達(dá)到最大值(2.11±0.11)mg，之后不斷下降，出現(xiàn)負(fù)增長。

對照組仔魚發(fā)育正常，集群在底層游動(dòng)，活力強(qiáng)，仔魚開口攝食后全長和體質(zhì)量均明顯增長，經(jīng)回歸分析得知，仔魚體質(zhì)量(W)與全長(L)呈冪函數(shù)關(guān)系，其回歸方程為W=0.052L2.340(R2=0.900)，其冪函數(shù)指數(shù)b<2.5，表明似魚句早期仔魚的生長屬于非均勻生長類型[17]。

在似魚句仔魚全長、體質(zhì)量特定增長率(圖1、圖2)方面，0～4日齡饑餓組與對照組之間的差異不顯著(P>0.05)，但5日齡后饑餓組均顯著低于對照組(P<0.05)。其中饑餓組體質(zhì)量特定增長率從6日齡起出現(xiàn)負(fù)增長，全長特定增長率從9日齡起出現(xiàn)負(fù)增長。

2.2 饑餓仔魚的形態(tài)、行為和死亡情況

饑餓組與對照組相比，0～5日齡仔魚的形態(tài)和行為組間差異不顯著(P>0.05)，但6日齡后出現(xiàn)明顯差別，饑餓仔魚生長停滯，頭大體瘦，眼睛明顯突出，活動(dòng)能力下降，分散靜臥于水底，但在PNR期未出現(xiàn)“胸角”現(xiàn)象。

由圖3可見，饑餓組仔魚的相對肥滿度一直呈現(xiàn)下降的趨勢，0～5日齡仔魚相對肥滿度與對照組無顯著差異(P>0.05)，5日齡后迅速下降，之后緩慢下降，6日齡后低于0.04，極顯著低于對照組(P<0.01)；而對照組仔魚相對肥滿度在5～6日齡迅速上升，在6～10日齡期間逐步下降，但均高于0.05，極顯著高于饑餓組(P<0.01)，11日齡后又逐步回升。

由圖4可見，0～4日齡饑餓組仔魚的累計(jì)死亡率與對照組基本一致，5日齡略高于對照組，但差異不顯著(P>0.05)，6日齡后迅速上升，顯著高于對照組，至10日齡累計(jì)死亡率達(dá)到(81.41±0.74)%，而對照組為(19.50±1.16)%，至13日齡饑餓組仔魚累計(jì)死亡率達(dá)到100%，而對照組僅為(22.62±1.05)%。饑餓組仔魚50%的累計(jì)死亡率出現(xiàn)時(shí)間為8～9日齡間，而同期對照組的仔魚累計(jì)死亡率低于18%。

2.3 初次攝食率及饑餓死亡“不可逆點(diǎn)”(PNR)的確定

似魚句饑餓仔魚初次攝食率變化情況如圖5所示。似魚句仔魚4日齡開口攝食，初次攝食率僅(23.33±2.89)%，4～5日齡為混合營養(yǎng)期，5、6日齡初次攝食率達(dá)到100%，PNR組仔魚的初次攝食率7日齡開始下降，9日齡下降到最高初次攝食率的一半以上，僅(33.33±2.89)%，11日齡饑餓仔魚的初次攝食率下降為0%，已喪失了開口攝食的能力，隨后PNR組仔魚于13日齡全部死亡。由此可確定在水溫(25.5±1.2)℃條件下，似魚句仔魚的PNR為8～9日齡，仔魚從開口攝食到PNR的時(shí)間僅4～5 d，其初次投喂最佳時(shí)間為5日齡。

3 討論

3.1 似魚句仔魚的不同營養(yǎng)期與PNR

卵黃囊是早期仔魚生長發(fā)育所需營養(yǎng)物質(zhì)和能量的主要來源[22]，似魚句仔魚屬于混合營養(yǎng)類型，4日齡仔魚開口攝食后，在其體內(nèi)仍可見卵黃囊殘余，5日齡時(shí)卵黃囊消耗殆盡，進(jìn)入外源性營養(yǎng)期，其卵黃囊的吸收與線紋尖塘鱧(Oxyeleotrislineolatus)仔魚[23]、鴨綠江水系唇魚骨(Hemibarbuslabeo)仔魚[24]、稀有魚句鯽(GobiocyPrisrarus)仔魚[25]、雅羅魚(Leuciscusmerzbacheri)仔魚[26]和美洲西鯡(Alosasapidissima)仔魚[27]基本相似，混合營養(yǎng)期僅1 d時(shí)間。參照單秀娟等[28]及秦志清[29]提出的早期仔魚相對混合營養(yǎng)期參數(shù)基準(zhǔn)△R(△R為仔魚開口攝食到卵黃囊完全吸收的時(shí)長與仔魚孵化出膜后到開口攝食的時(shí)長的比值)，當(dāng)△R≥1，仔魚相對混合營養(yǎng)期較長，開口攝食較快，不易受饑餓脅迫；當(dāng)1>△R>0.1，相對混合營養(yǎng)期較短，容易遭受饑餓脅迫；當(dāng)0<△R≤0.1，相對混合營養(yǎng)期極短，極易受饑餓脅迫。在水溫(25.5±1.2)℃時(shí)，似魚句早期仔魚的△R為1/3(1>△R>0.1)，屬于混合營養(yǎng)期相對較短、容易遭受到饑餓威脅的魚類。

大多數(shù)魚類在早期仔魚期均存在一個(gè)饑餓不可逆點(diǎn)(PNR)，其是衡量早期仔魚耐受饑餓能力的一個(gè)指標(biāo)，不同種屬的魚類仔魚進(jìn)入PNR的時(shí)間長短也不完全相同[28，30]。本試驗(yàn)中，似魚句4日齡仔魚初次開口的初次攝食率平均為23.33%，5、6日齡初次攝食率迅速達(dá)最高值100%，最高初次攝食率持續(xù)時(shí)間2 d，這與齊口裂腹魚(Schizothoraxprenanti)仔魚[31]最高初次攝食率100%持續(xù)2 d的結(jié)果相似。早期仔魚從開口攝食到達(dá)PNR的時(shí)間是其建立外源性營養(yǎng)的關(guān)鍵階段，本試驗(yàn)結(jié)果表明，在水溫(25.5±1.2)℃下，似魚句早期仔魚耐受饑餓不可逆點(diǎn)發(fā)生在孵化后8～9日齡，初次開口攝食到PNR的時(shí)間為4～5 d。從仔魚初次開口攝食到達(dá)PNR的時(shí)間長短比較，似魚句仔魚與花魚骨(Hemibarbusmaculatus)仔魚[32](25℃～29℃，從開口攝食到PNR的時(shí)間為4～5 d)相接近，略短于葉爾羌高原鰍(Triplophysayarkandensis)仔魚[33](20℃，5～6 d)、斑鱖(Sinipercascherzeri)仔魚[30](23℃，5～6 d)和泥鰍(Missgurnusarguillicaudatus)仔魚[34](25℃～27℃，6.1～6.2 d)，但長于細(xì)鱗斜頜鲴(Plagiognathopsmicrolepis)仔魚[35](25℃～27℃，3 d)和條石鯛(Oplegnathusfasciatus)仔魚[36](22℃～24℃，2.5～3.0 d)，說明似魚句仔魚具有相對較強(qiáng)的攝食能力，但在饑餓脅迫下，其耐受饑餓的能力較差。因此，在水溫25℃左右，人工繁育似魚句仔魚投喂開口餌料的最佳時(shí)間為孵化后的第6天(5日齡)左右，以提高苗種培育成活率。

3.2 饑餓脅迫對似魚句早期仔魚生長、形態(tài)及存活的影響

饑餓使早期仔魚的生長、發(fā)育和存活受到嚴(yán)重的影響，在卵黃囊耗盡時(shí)，如不能建立外源性營養(yǎng)便進(jìn)入了饑餓期，不同種類仔魚對饑餓脅迫的適應(yīng)性特征不同[3，37]。本試驗(yàn)中，似魚句饑餓仔魚在初次開口攝食期體質(zhì)量和全長特定增長率急劇下降，卵黃囊消耗吸收減緩，饑餓仔魚在卵黃囊耗盡時(shí)(5日齡)體質(zhì)量出現(xiàn)負(fù)增長，全長在到達(dá)PNR點(diǎn)時(shí)也出現(xiàn)負(fù)增長。這與鴨綠江水系唇魚骨仔魚[25]、美洲西鯡仔魚[27]等的研究結(jié)果相似，表明了似魚句仔魚面臨饑餓脅迫條件下也存在這種適應(yīng)性的生態(tài)對策。

饑餓仔魚發(fā)育受阻，某些體態(tài)特征也會(huì)隨著饑餓程度發(fā)生改變，反映了仔魚的饑餓程度或營養(yǎng)狀況，因而可采用體形特征變化作為判斷饑餓仔魚的指標(biāo)[38]。如南方鲇(Silurusmeridionalis)饑餓仔魚外形萎縮、腦頂下凹[39]；黑莓鱸(Pomoxisnigromacufatus)[29]和胭脂魚(Myxocyprinusasiaticus)[40]饑餓仔魚在PNR期“胸角”明顯；處于PNR期的食蚊魚(Gambusiaaffinis)仔魚腹部萎縮呈弧形，體長/體高>5.0，顯著大于投喂組仔魚(體長/體高<4.5)[41]；黃鱔(Monopterusalbus)饑餓仔魚PNR期肥滿度<0.062 5，極顯著小于健康仔魚(肥滿度>0.075 8)(P<0.01)[42]。本試驗(yàn)中，似魚句早期仔魚在饑餓脅迫下也表現(xiàn)出了一系列明顯的因饑餓所導(dǎo)致的外部形態(tài)特征的改變，頭大體瘦、眼球外凸明顯，但與泥鰍[34]、食蚊魚[41]饑餓仔魚一樣，在PNR期并未出現(xiàn)特殊饑餓體征“胸角”。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)饑餓脅迫試驗(yàn)組仔魚PNR期的相對肥滿度與正常投喂對照組差異極顯著(P<0.01)，對照組仔魚相對肥滿度>0.05，而饑餓脅迫試驗(yàn)組仔魚相對肥滿度<0.04。因此，可將相對肥滿度作為判斷似魚句仔魚饑餓程度的指標(biāo)。

饑餓是導(dǎo)致早期仔魚存活率下降的主要因素之一，饑餓一旦超出了仔魚的耐受限度，便無法繼續(xù)存活[36]。在水溫(25.5±1.2)℃下，饑餓2 d的似魚句仔魚累計(jì)死亡率顯著上升，8～9日齡累計(jì)死亡率達(dá)到50%，與仔魚的PNR時(shí)間點(diǎn)(8～9日齡)出現(xiàn)在同一天，這與白甲魚(Onychostomasima)仔魚的研究結(jié)果相似，意味著在此時(shí)間點(diǎn)之前，饑餓仔魚若能開口攝食而獲得外源性營養(yǎng)，則尚有較大的恢復(fù)可能[43]，也進(jìn)一步提示了在苗種培育生產(chǎn)中應(yīng)盡早讓仔魚開口攝食，獲得較高的仔魚開口攝食率，建立外源性營養(yǎng)，是提高仔魚成活率的重要途徑。

4 結(jié)論

在水溫(25.5±1.2)℃條件下，似魚句仔魚4日齡開口攝食，混合營養(yǎng)期僅1 d，PNR發(fā)生在8～9日齡，耐受饑餓的能力較差，進(jìn)入PNR期的饑餓仔魚相對肥滿度極顯著低于正常仔魚，可將其作為判別似魚句饑餓仔魚的重要依據(jù)；人工繁育的似魚句仔魚可在4日齡開始投喂，初次投喂最佳時(shí)間為5日齡，但初次投喂最遲不宜超過7日齡。