蕭培珍 吉 紅 張寶彤 葉元土 孫 健 楊 洲 李雪賢 田晶晶

(1. 西北農(nóng)林科技大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院, 楊陵 712100; 2. 北京市營(yíng)養(yǎng)源研究所水產(chǎn)動(dòng)物系統(tǒng)營(yíng)養(yǎng)研究開(kāi)放實(shí)驗(yàn)室, 北京 100069;3. 蘇州大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院, 蘇州 215123)

水飛薊素抑制草魚(yú)肝細(xì)胞脂質(zhì)蓄積的作用及其機(jī)制研究

蕭培珍1吉 紅1張寶彤2葉元土3孫 健1楊 洲1李雪賢1田晶晶1

(1. 西北農(nóng)林科技大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院, 楊陵 712100; 2. 北京市營(yíng)養(yǎng)源研究所水產(chǎn)動(dòng)物系統(tǒng)營(yíng)養(yǎng)研究開(kāi)放實(shí)驗(yàn)室, 北京 100069;3. 蘇州大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院, 蘇州 215123)

為探究水飛薊素(Silymarin)對(duì)草魚(yú)肝細(xì)胞脂質(zhì)蓄積的作用及其機(jī)理, 體外培養(yǎng)草魚(yú)肝細(xì)胞, 在用400 μmol/L油酸對(duì)其進(jìn)行蓄脂誘導(dǎo)的同時(shí), 采用不同質(zhì)量濃度的水飛薊素處理24h, 檢測(cè)了肝細(xì)胞活力、脂質(zhì)蓄積狀況、抗氧化指標(biāo)和脂質(zhì)代謝相關(guān)基因表達(dá)狀況。結(jié)果顯示, 水飛薊素質(zhì)量濃度在75—125 μg/mL對(duì)草魚(yú)肝細(xì)胞活力無(wú)影響(P＞0.05); 與單獨(dú)采用油酸進(jìn)行蓄脂誘導(dǎo)的油酸組比較, 水飛薊素和油酸共同處理的水飛薊素組中, 隨著水飛薊素質(zhì)量濃度的增加, 肝細(xì)胞內(nèi)的脂質(zhì)含量逐漸降低, 且水飛薊素質(zhì)量濃度在100—150 μg/mL時(shí)的肝細(xì)胞脂質(zhì)蓄積水平顯著降低(P＜0.05); 與油酸組相比, 100 μg/mL水飛薊素處理組的脂質(zhì)含量以時(shí)間依賴性的模式顯著降低(P＜0.05), 還原型谷胱甘肽含量顯著升高(P＜0.05), 脂肪酸合成酶和硬脂酰輔酶A去飽和酶1的mRNA表達(dá)量顯著下調(diào)(P＜0.05)。研究表明, 水飛薊素能夠抑制草魚(yú)肝細(xì)胞脂質(zhì)蓄積, 其作用可能與其抑制脂質(zhì)合成基因的表達(dá)有關(guān); 同時(shí), 水飛薊素可能通過(guò)提高肝細(xì)胞的抗氧化能力發(fā)揮保護(hù)肝細(xì)胞的作用。

水飛薊素; 脂質(zhì)蓄積; 肝細(xì)胞; 草魚(yú); 油酸

飼料油脂不僅能夠?yàn)轸~(yú)體提供能量, 而且是養(yǎng)殖魚(yú)類必需脂肪酸的重要來(lái)源[1]。研究表明, 提高飼料中脂肪水平能夠節(jié)約蛋白質(zhì), 提高魚(yú)體生長(zhǎng)性能, 這已成為當(dāng)前水產(chǎn)飼料配方技術(shù)發(fā)展的主要方向之一[2,3]。然而, 過(guò)量的脂肪攝入, 會(huì)抑制養(yǎng)殖對(duì)象生長(zhǎng), 引發(fā)脂質(zhì)在魚(yú)體組織如肝胰臟和腹腔脂肪組織中的過(guò)度蓄積, 進(jìn)而引起魚(yú)類出現(xiàn)高脂血癥、脂肪肝和脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)等癥狀[4—8]。由于飼料能量攝入過(guò)多或營(yíng)養(yǎng)素不平衡導(dǎo)致肝細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)過(guò)度蓄積, 引起肝細(xì)胞脂肪變, 稱為魚(yú)類營(yíng)養(yǎng)性脂肪肝[9]。當(dāng)前幾乎所有的主要養(yǎng)殖魚(yú)類均有發(fā)生脂肪肝的報(bào)道, 脂肪肝不僅造成魚(yú)體對(duì)攝入能量的浪費(fèi),而且嚴(yán)重威脅著魚(yú)類健康[10,11]。因此, 預(yù)防養(yǎng)殖魚(yú)類脂肪肝的發(fā)生, 對(duì)提高魚(yú)類生產(chǎn)性能、改善魚(yú)類健康狀況具有重要意義。

水飛薊素(Silymarin)是一種黃酮類植物提取物, 從紫花水飛薊(Silybum marianumL.)的干燥果實(shí)中提取, 主要由4種黃酮類化合物組成, 包含水飛薊賓A和B (Silibinin A and B)、異水飛薊素賓A和B(Isosilibinin A and B)、水飛薊亭(Silychristin)、水飛薊寧(Silydianin)[12,13]。在哺乳動(dòng)物上, 水飛薊素具有保護(hù)肝臟、抗氧化、抗炎、抗癌等作用[14—16]。在魚(yú)類上, 水飛薊素能夠修復(fù)CCl4誘導(dǎo)的鯉肝損傷[17], 降低虹鱒血漿膽固醇含量[18], 抑制斑馬魚(yú)的脂質(zhì)蓄積[19]。本研究室前期研究發(fā)現(xiàn), 水飛薊素能夠降低高脂日糧誘導(dǎo)的草魚(yú)肝臟脂質(zhì)含量的增加[20]。

草魚(yú)(Ctenopharyngodon idellus)屬于草食性魚(yú)類, 是我國(guó)主要的淡水養(yǎng)殖品種之一, 2015年總產(chǎn)量為5.68×109kg, 占全國(guó)淡水魚(yú)總產(chǎn)量的20.91%(中國(guó)漁業(yè)統(tǒng)計(jì)年鑒, 2016)。有學(xué)者指出, 草魚(yú)對(duì)飼料脂肪的利用能力較低[4,21]。然而, 在實(shí)際生產(chǎn)中, 草魚(yú)飼料脂質(zhì)水平越來(lái)越高, 導(dǎo)致魚(yú)體脂肪肝現(xiàn)象頻繁發(fā)生。研究報(bào)道, 過(guò)量的游離脂肪酸攝入引起肝臟脂質(zhì)過(guò)度蓄積, 導(dǎo)致肝細(xì)胞出現(xiàn)脂肪變性, 同時(shí)過(guò)量的游離脂肪酸也是產(chǎn)生脂毒性的重要介質(zhì), 引起細(xì)胞受損[22]。因此, 研究草魚(yú)脂肪肝防控技術(shù)具有重要的理論和應(yīng)用上的意義。目前, 關(guān)于水飛薊素降脂作用的研究有一些報(bào)道[19,23—25], 但評(píng)價(jià)手段較為單一。在哺乳動(dòng)物上, 有學(xué)者通過(guò)構(gòu)建細(xì)胞離體培養(yǎng)體系, 采用游離脂肪酸誘導(dǎo)建立脂肪肝細(xì)胞模型, 對(duì)一些功能性成分進(jìn)行篩選[26—30], 在魚(yú)類上,杜金梁等[31]用油酸構(gòu)建了建鯉原代脂肪肝細(xì)胞損傷模型, 并獲得了澤瀉提取物對(duì)油酸誘導(dǎo)的脂肪肝具有保護(hù)作用, 而有關(guān)就水飛薊素作用離體評(píng)價(jià)的研究還未見(jiàn)報(bào)道。因此, 本研究采用油酸與水飛薊素共同處理草魚(yú)肝細(xì)胞的技術(shù)路線, 探討水飛薊素對(duì)草魚(yú)肝細(xì)胞脂質(zhì)蓄積的作用和分子機(jī)制, 為養(yǎng)殖魚(yú)類脂肪肝的防治和功能性飼料添加劑的開(kāi)發(fā)提供參考資料。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

M199培養(yǎng)基、胎牛血清和無(wú)脂肪酸牛血清白蛋白購(gòu)自Gibco公司, 水飛薊素、油紅O、MTT和油酸均購(gòu)自Sigma公司, 二甲亞砜(Dimethyl sulfoxide, DMSO)、碳酸氫鈉、無(wú)水乙醇等化學(xué)試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。Trizol、反轉(zhuǎn)錄試劑盒及熒光定量試劑盒購(gòu)自TaKaRa公司。

1.2 草魚(yú)肝細(xì)胞的培養(yǎng)

草魚(yú)肝細(xì)胞(L8824)購(gòu)自中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(China Center for Type Culture Collection,CCTCC)。將肝細(xì)胞置于10%胎牛血清的M199培養(yǎng)液中, 并于28℃、5% CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。隔天換液, 待細(xì)胞生長(zhǎng)至匯合后, 用于試驗(yàn)。

1.3 油酸溶液和水飛薊素溶液的配制

油酸用無(wú)水乙醇配制成100 mmol/L貯存液, 保存于–20℃, 使用前用2%無(wú)脂肪酸牛血清白蛋白的M199培養(yǎng)基將油酸稀釋成10 mmol/L儲(chǔ)備液。之后用10%胎牛血清的M199培養(yǎng)液配置成400 μmol/L油酸溶液待用。

水飛薊素用DMSO溶液配制成10 mg/mL貯存液, 保存于–20℃, 使用前用10%胎牛血清的M199培養(yǎng)液配制成不同質(zhì)量濃度(5、25、50、75、100、125、150和200 μg/mL, 簡(jiǎn)寫(xiě)為SM5、25、50、75、100、125、150和200)的水飛薊素工作液待用。

1.4 試驗(yàn)處理

根據(jù)本實(shí)驗(yàn)室前期研究成果, 選用400 μmol/L油酸處理草魚(yú)肝細(xì)胞, 作為誘導(dǎo)肝細(xì)胞脂肪化的濃度[32]。

試驗(yàn)組別設(shè)為對(duì)照組、油酸組和水飛薊素處理組。其中: 對(duì)照組為不經(jīng)任何處理的, 用10%胎牛血清的M199培養(yǎng)液培養(yǎng)肝細(xì)胞24h, 為正常肝細(xì)胞組(Control); 油酸組(OA組)為用含400 μmol/L油酸的培養(yǎng)液培養(yǎng)肝細(xì)胞24h; 水飛薊素處理組(SM組)為用含有400 μmol/L油酸并同時(shí)添加不同質(zhì)量濃度的水飛薊素的培養(yǎng)液培養(yǎng)肝細(xì)胞24h。

1.5 MTT法評(píng)估水飛薊素對(duì)肝細(xì)胞活力的影響

采用MTT法, 分別評(píng)估了不同質(zhì)量濃度水飛薊素對(duì)未加油酸和同時(shí)添加油酸的草魚(yú)肝細(xì)胞活力的影響。具體操作如下:

(1) 將草魚(yú)肝細(xì)胞均勻接種于96孔板(150 μL/孔), 28℃, 5% CO2培養(yǎng)24h。之后, 更換為含有不同質(zhì)量濃度(5、25、50、100和200 μg/mL)水飛薊素的培養(yǎng)液培養(yǎng)肝細(xì)胞24h, 然后MTT法評(píng)估水飛薊素對(duì)未加油酸的肝細(xì)胞活力的影響。

(2) 將草魚(yú)肝細(xì)胞均勻接種于96孔板(150 μL/孔), 28℃, 5% CO2培養(yǎng)24h。之后, 更換為含有油酸和不同質(zhì)量濃度(75、100、125 μg/mL)水飛薊素的培養(yǎng)液培養(yǎng)肝細(xì)胞24h, 然后MTT法評(píng)估水飛薊素對(duì)添加油酸的肝細(xì)胞活力的影響。

MTT法操作步驟為: 細(xì)胞經(jīng)上述處理后, 向每孔加入20 μL的MTT溶液(5 mg/mL), 在28℃、5%CO2條件下繼續(xù)培養(yǎng)4h, 吸棄培養(yǎng)液, 用PBS洗1次,吸棄, 每孔加入150 μL DMSO, 于28 ℃孵育10 min,溶解細(xì)胞中的甲臢。用Gen5 酶標(biāo)儀于490 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光值, 每組6個(gè)重復(fù)。

1.6 油紅O染色提取法及試劑盒法測(cè)定細(xì)胞甘油三酯含量

將草魚(yú)肝細(xì)胞均勻接種于96孔板, 根據(jù)1.4方式處理肝細(xì)胞后, 吸棄培養(yǎng)基, 每孔用PBS洗2次, 加入10%的甲醛溶液固定30min, PBS洗2次, 加入新鮮配制的油紅O染液浸染15min, 之后用PBS清洗2次,于倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞內(nèi)脂滴的染色情況, 拍照記錄。之后每孔加入150 μL的異丙醇萃取脂質(zhì), 用Gen5 酶標(biāo)儀于490 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光值。每組6個(gè)重復(fù)。

此外, 用甘油三酯試劑盒定量測(cè)定細(xì)胞內(nèi)甘油三酯含量(北京普利萊基因技術(shù)有限公司), 進(jìn)一步確定水飛薊素抑制脂質(zhì)積累的質(zhì)量濃度。

1.7 抗氧化指標(biāo)的檢測(cè)

將草魚(yú)肝細(xì)胞均勻接種于24孔板, 按照1.4方式處理肝細(xì)胞后, 吸棄培養(yǎng)基, 胰蛋白酶消化細(xì)胞, 待細(xì)胞接近圓球形時(shí), 立即加入含10%胎牛血清的M199培養(yǎng)液終止消化, 用移液器反復(fù)輕輕吹打, 收集細(xì)胞懸液, 1000 r/min離心5min, 棄上清液, 加PBS吹打均勻, 1000 r/min離心5min, 棄上清液, 收集細(xì)胞待用, 用于抗氧化指標(biāo)測(cè)定。

抗氧化指標(biāo)包括超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase, SOD)和還原型谷胱甘肽(Reduced glutathione, GSH), 均采用試劑盒進(jìn)行測(cè)定(南京建成生物工程研究所)。細(xì)胞蛋白含量用Bradford蛋白濃度測(cè)定試劑盒測(cè)定蛋白含量(碧云天生物技術(shù)有限公司)。

1.8 實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)脂質(zhì)代謝相關(guān)基因mRNA的表達(dá)

將草魚(yú)肝細(xì)胞均勻接種于24孔板, 按照1.4方式處理肝細(xì)胞后, 吸棄培養(yǎng)基, PBS清洗2次, 提取總RNA, 并反轉(zhuǎn)錄。采用CFX-96實(shí)時(shí)定量PCR儀(Bio-Rad, USA)測(cè)定相關(guān)基因的mRNA表達(dá)量。20 μL反應(yīng)體系, 包括: 上下游引物(10 mmol/μL)各0.6 μL、cDNA 1 μL、2×SYBR Premix ExTaqTMII 10 μL、滅菌雙蒸水加至20 μL。反應(yīng)條件是: 95℃,10s; 95℃, 15s; 57℃, 15s; 40個(gè)循環(huán)。實(shí)時(shí)定量檢測(cè)基因β-actin、FAS、ACC、SCD1、ATGL、HSL、CPT1的引物序列見(jiàn)表1。在反應(yīng)結(jié)束后, 利用溶解曲線對(duì)產(chǎn)物的唯一性進(jìn)行分析。β-actin作為內(nèi)參,相對(duì)定量法比較Ct值(2–ΔΔCt), 計(jì)算基因表達(dá)量, 并作圖分析, 每組3個(gè)重復(fù)。

1.9 統(tǒng)計(jì)分析

所有數(shù)據(jù)均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤(Mean±SE)表示。采用SPSS18.0軟件中的單因素方差分析(Oneway ANOVA)以及Duncan氏多重比較,t-檢驗(yàn)對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。顯著水平為P＜0.05, 極顯著水平為P＜0.01。

表1 實(shí)時(shí)定量PCR引物序列Tab. 1 Primers used in real-time quantitative PCR

2 結(jié)果

2.1 水飛薊素對(duì)草魚(yú)肝細(xì)胞活力的影響

首先評(píng)估了水飛薊素對(duì)未加油酸的草魚(yú)肝細(xì)胞活力影響(圖1), 結(jié)果顯示, 與對(duì)照組比較, 水飛薊素質(zhì)量濃度在25—100 μg/mL時(shí)顯著增加了細(xì)胞活力(P＜0.05), 而在5和200 μg/mL時(shí)均與對(duì)照組無(wú)顯著差異(P＞0.05)。

進(jìn)一步評(píng)估了水飛薊素和油酸共同處理草魚(yú)肝細(xì)胞24h后, 對(duì)肝細(xì)胞活力的影響(圖2), 結(jié)果顯示, 與對(duì)照組比較, 油酸組(OA組)顯著提高了肝細(xì)胞活力(P＜0.05)。與油酸組(OA組)比較, SM75、SM100組均顯著提高了細(xì)胞活力(P＜0.05), 而SM125組無(wú)顯著影響(P＞0.05)。這表明水飛薊素質(zhì)量濃度在75—125 μg/mL并同時(shí)添加400 μmol/L油酸對(duì)草魚(yú)肝細(xì)胞活力無(wú)抑制作用。

2.2 水飛薊素對(duì)草魚(yú)肝細(xì)胞脂質(zhì)蓄積的抑制作用

采用不同質(zhì)量濃度的水飛薊素和油酸處理草魚(yú)肝細(xì)胞24h后, 通過(guò)油紅O染色對(duì)細(xì)胞形態(tài)進(jìn)行了觀察(圖3A), 隨著水飛薊素質(zhì)量濃度的增加, 草魚(yú)肝細(xì)胞內(nèi)紅色脂滴含量呈現(xiàn)出減少的趨勢(shì), 且脂滴變小, 顏色變淺。同時(shí), 用油紅O染色提取比色法定量分析細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)含量(圖3B), 結(jié)果顯示, 與對(duì)照組比較, 油酸組(OA組)的脂質(zhì)含量顯著增加(P＜0.05)。與油酸組(OA組)比較, SM5組的脂質(zhì)含量顯著增加(P＜0.05), 之后隨著水飛薊素質(zhì)量濃度的增加, 肝細(xì)胞內(nèi)的脂質(zhì)含量逐漸降低, 且水飛薊素質(zhì)量濃度在100—150 μg/mL時(shí)的脂質(zhì)含量顯著降低(P＜0.05)。

進(jìn)一步用甘油三酯試劑盒定量檢測(cè)肝細(xì)胞甘油三酯含量(圖4), 結(jié)果顯示水飛薊素100 μg/mL處理肝細(xì)胞24h后, 肝細(xì)胞內(nèi)甘油三酯含量顯著低于油酸組(OA組), 但高于對(duì)照組(P＜0.05); 油酸組(OA組)肝細(xì)胞內(nèi)甘油三酯含量則顯著高于對(duì)照組(P＜0.05)。

2.3 水飛薊素對(duì)草魚(yú)肝細(xì)胞脂質(zhì)蓄積抑制作用的時(shí)間依賴關(guān)系

研究了水飛薊素對(duì)草魚(yú)肝細(xì)胞脂質(zhì)蓄積抑制作用的時(shí)間依賴關(guān)系(圖5)。選擇質(zhì)量濃度為100 μg/mL的水飛薊素處理肝細(xì)胞, 油紅O染色提取比色法定量分析細(xì)胞脂質(zhì)含量(圖5B)。結(jié)果顯示, 與油酸組(OA組)相比, 隨著水飛薊素處理時(shí)間的延長(zhǎng), 在12h時(shí)肝細(xì)胞脂質(zhì)含量出現(xiàn)顯著降低(P＜0.05), 在18h和24h時(shí)肝細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)含量均極顯著降低(P＜0.01)。油紅O染色后光學(xué)顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)(圖5A), 隨著水飛薊素處理時(shí)間的延長(zhǎng), 在同一時(shí)間點(diǎn)肝細(xì)胞內(nèi)的紅色脂滴少且顏色淺于油酸組。

圖1 水飛薊素對(duì)草魚(yú)肝細(xì)胞活力的影響(平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤, n=6)Fig. 1 Effect of silymarin on the viability of grass carp hepatocytes (mean±SE, n=6)

圖2 水飛薊素和油酸共同處理24h對(duì)草魚(yú)肝細(xì)胞活力的影響(平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤, n=6)Fig. 2 Effect of silymarin and oleic acid on the viability of grass carp hepatocytes (means±SE, n=6)

2.4 水飛薊素對(duì)草魚(yú)肝細(xì)胞抗氧化能力的影響

結(jié)果表明(圖6), SM100組的GSH含量顯著高于油酸組(OA組)(P＜0.05), 但與對(duì)照組無(wú)差異(P＞0.05); 油酸組(OA組)的GSH含量低于對(duì)照組, 但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)(圖6B)。SOD活性在對(duì)照組、油酸組(OA組)和SM100組間均無(wú)顯著差異(P＞0.05)(圖6A)。

2.5 水飛薊素對(duì)草魚(yú)肝細(xì)胞脂質(zhì)代謝相關(guān)基因表達(dá)的影響

與對(duì)照組相比(圖7), 油酸組(OA組)SCD1的mRNA表達(dá)量顯著上調(diào), 而ATGL、HSL和CPT1的mRNA表達(dá)量則顯著下調(diào)(P＜0.05); 油酸組(OA組)FAS的mRNA表達(dá)量呈增加趨勢(shì), 但與對(duì)照組間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)。與油酸組(OA組)比較,SM100組的FAS和SCD1的mRNA表達(dá)量均顯著下調(diào)(P＜0.05)。SM100組的ACC、ATGL、HSL、CPT1的mRNA表達(dá)量與油酸組相比呈降低趨勢(shì), 但均無(wú)顯著差異(P＞0.05)。

3 討論

3.1 水飛薊素對(duì)肝細(xì)胞活力的影響

在哺乳動(dòng)物上, 體外建立脂肪肝細(xì)胞模型, 進(jìn)行外源性活性功能成分篩選, 是一種常用研究手段,而在魚(yú)類上的相關(guān)研究報(bào)道較少。Okamoto等[26]用0.1和1 mmol/L油酸培養(yǎng)HepG2 24h, 成功造成肝細(xì)胞脂肪變性。Ricchi等[27]用0.66和1.32 mmol/L油酸成功誘導(dǎo)3種肝細(xì)胞系(HepG2, WRL-68和HuH-7細(xì)胞)脂肪變性。本研究室用油酸成功誘導(dǎo)了草魚(yú)肝細(xì)胞脂質(zhì)蓄積, 即油酸濃度在400 μmol/L培養(yǎng)24h時(shí)能夠促進(jìn)草魚(yú)肝細(xì)胞脂質(zhì)蓄積且有利于增強(qiáng)細(xì)胞活力[32]。因此, 本研究選用400 μmol/L油酸用于誘導(dǎo)草魚(yú)肝細(xì)胞脂質(zhì)蓄積。MTT和油紅O染色法提取脂質(zhì)結(jié)果顯示油酸組的細(xì)胞活力和脂質(zhì)含量均顯著高于對(duì)照組, 表明400 μmol/L油酸能夠增加草魚(yú)肝細(xì)胞的活力并誘導(dǎo)脂質(zhì)蓄積, 進(jìn)一步證實(shí)了上述研究結(jié)果。有研究報(bào)道指出, 水飛薊素(30 μmol/L)和水飛薊賓(100 μmol/L)對(duì)原代培養(yǎng)的大鼠肝細(xì)胞產(chǎn)生損傷作用[33]。Venkataramanan等[34]報(bào)道0.25 mmol/L (48h)水飛薊素對(duì)原代培養(yǎng)的人肝細(xì)胞活力無(wú)抑制作用, 而水飛薊素在0.5 mmol/L (48h)時(shí)對(duì)細(xì)胞活力產(chǎn)生抑制作用。Zhang等[35]用水飛薊素(100 μmol/L)和棕櫚酸(200 μmol/L)共同處理HepG2和BRL-3A細(xì)胞, 發(fā)現(xiàn)添加水飛薊素后能夠降低棕櫚酸對(duì)細(xì)胞的毒性作用。在本研究中, 水飛薊素處理未加油酸的肝細(xì)胞結(jié)果表明, 水飛薊素質(zhì)量濃度在5—200 μg/mL時(shí)對(duì)細(xì)胞活力無(wú)抑制作用,且25—100 μg/mL時(shí)能夠增強(qiáng)細(xì)胞活力。進(jìn)一步分析水飛薊素和油酸共同處理草魚(yú)肝細(xì)胞結(jié)果, 發(fā)現(xiàn)水飛薊素質(zhì)量濃度在75—125 μg/mL并同時(shí)添加400 μmol/L油酸對(duì)肝細(xì)胞活力無(wú)抑制作用。

3.2 水飛薊素對(duì)肝細(xì)胞脂質(zhì)蓄積的抑制作用及其調(diào)控機(jī)制

圖3 油紅O染色法評(píng)估水飛薊素對(duì)草魚(yú)肝細(xì)胞脂質(zhì)蓄積的影響(平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤, n=6)Fig. 3 Effects of silymarin on intracellular lipid accumulation in grass carp hepatocytes (mean±SE, n=6)

水飛薊素是一種黃酮類植物提取物, 具有保護(hù)肝臟和緩解胰島素耐受, 影響糖脂代謝的作用[36—38]。在大鼠上發(fā)現(xiàn), 水飛薊素降低了高脂血癥或CCl4誘導(dǎo)增加的大鼠血液總脂質(zhì), 甘油三酯和膽固醇含量[25,39]。Zhang等[35]用水飛薊素與棕櫚酸共同處理BRL-3A和HepG2細(xì)胞, 發(fā)現(xiàn)水飛薊素抑制了細(xì)胞脂質(zhì)蓄積。在本實(shí)驗(yàn)中, 水飛薊素顯著降低了油酸誘導(dǎo)草魚(yú)肝細(xì)胞中甘油三酯的蓄積, 這與我們先前在體研究中發(fā)現(xiàn)的水飛薊素能夠降低高脂日糧誘導(dǎo)增加的草魚(yú)肝脂含量結(jié)果一致[20], 表明水飛薊素對(duì)草魚(yú)肝細(xì)胞脂質(zhì)蓄積具有抑制作用, 有利于保護(hù)肝臟。此外, 時(shí)間依賴關(guān)系結(jié)果表明, 隨著水飛薊素處理肝細(xì)胞時(shí)間的延長(zhǎng), 抑制脂質(zhì)蓄積的效果顯著。

本研究進(jìn)一步分析了水飛薊素對(duì)肝細(xì)胞脂質(zhì)蓄積抑制的調(diào)控機(jī)制。乙酰輔酶A羧化酶(Acetyl-CoA carboxylase, ACC)和脂肪酸合酶(Fatty acid synthase, FAS)是調(diào)節(jié)脂質(zhì)合成的關(guān)鍵限速酶[40,41],硬脂酰輔酶A去飽和酶1(Stearoyl-CoA desaturases 1, SCD1)是軟脂酸去飽和合成單不飽和脂肪酸的調(diào)控酶[42]。甘油三酯脂酶(Adipose triglyceride lipase, ATGL)和激素敏感酶(Hormone-sensitive lipase, HSL)是調(diào)控甘油三酯水解的關(guān)鍵酶[43]。肉毒堿棕櫚酰轉(zhuǎn)移酶(Carnitine palmitoyltransferase 1,CPT1)是影響線粒體脂肪酸β-氧化的限速酶[44]。在本研究中, 與對(duì)照組相比, 油酸組脂質(zhì)分解相關(guān)基因(ATGL、HSL、CPT1)的mRNA表達(dá)量顯著下調(diào),而脂質(zhì)合成基因SCD1的mRNA表達(dá)量顯著上調(diào),同時(shí)FAS的mRNA表達(dá)量呈增加趨勢(shì), 表明油酸能夠抑制肝細(xì)胞中脂質(zhì)分解, 促進(jìn)脂質(zhì)合成, 這可能是導(dǎo)致肝細(xì)胞脂質(zhì)增加的主要原因[28]。黃酮可降低非酒精性脂肪肝大鼠的肝臟脂質(zhì)蓄積, 其抑制作用與抑制脂質(zhì)合成有關(guān)[45]。在體研究指出, 水飛薊素可降低高果糖日糧飼喂大鼠的FAS基因表達(dá)量[37]。在本研究中, 與油酸組比較, 水飛薊素處理組的FAS和SCD1基因表達(dá)量顯著下調(diào), 表明水飛薊素可能通過(guò)下調(diào)肝細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)合成來(lái)抑制脂質(zhì)蓄積, 這可能是導(dǎo)致肝細(xì)胞內(nèi)甘油三酯含量降低, 改善油酸誘導(dǎo)肝細(xì)胞脂肪蓄積的主要原因。

圖4 水飛薊素對(duì)草魚(yú)肝細(xì)胞甘油三酯含量的影響(平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤, n=3)Fig. 4 Effect of silymarin on triacylglycerol (TG) contents in grass carp hepatocytes (mean±SE, n=3)

3.3 水飛薊素對(duì)肝細(xì)胞抗氧化能力的影響

圖5 水飛薊素對(duì)草魚(yú)肝細(xì)胞脂質(zhì)蓄積的時(shí)間依賴關(guān)系(平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤, n=6)Fig. 5 Effect of silymarin on lipid accumulation in grass carp hepatocytes for 0, 4h, 8h, 12h, 18h or 24h (mean±SE, n=6)

圖6 水飛薊素對(duì)草魚(yú)肝細(xì)胞抗氧化能力的影響(平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤, n=3)Fig. 6 Effect of silymarin on antioxidant capabilities in grass carp hepatocytes (mean±SE, n=3)

肝細(xì)胞對(duì)甘油三酯的儲(chǔ)存能力有限。當(dāng)過(guò)量游離脂肪酸蓄積在肝細(xì)胞內(nèi), 導(dǎo)致產(chǎn)生過(guò)量的活性氧(Reactive oxygen species, ROS), 引起氧化應(yīng)激發(fā)生, 造成脂毒性, 導(dǎo)致細(xì)胞損傷或死亡[46,47], 并使得營(yíng)養(yǎng)性脂肪肝進(jìn)一步向肝纖維化和肝壞死轉(zhuǎn)變[9]。ROS是不穩(wěn)定的活性分子, 依賴于細(xì)胞內(nèi)抗氧化系統(tǒng)的清除作用。SOD屬于抗氧化酶, 可清除游離的自由基進(jìn)而保護(hù)細(xì)胞的抗脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)[48];GSH用于維持細(xì)胞內(nèi)氧化還原狀態(tài)的平衡, 作為谷胱甘肽過(guò)氧化物酶和谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶的底物, 對(duì)清除自由基起了關(guān)鍵作用[49]。水飛薊素具有抗氧化、抗炎、抗癌等作用[16,17]。已有研究發(fā)現(xiàn), 水飛薊素處理棕櫚酸誘導(dǎo)的HepG2細(xì)胞后, 不僅提高了細(xì)胞中GSH含量, 而且改善了棕櫚酸誘導(dǎo)的AKT酶活性的降低, 并緩解了細(xì)胞死亡[50]。在體研究中, 水飛薊賓不僅能夠調(diào)節(jié)脂質(zhì)平衡, 而且可顯著降低酒精性脂肪肝炎大鼠ROS含量, 抑制氧化應(yīng)激介導(dǎo)的脂毒性作用, 最終阻止了肝臟損傷的發(fā)展[38]。在本研究中, 水飛薊素處理肝細(xì)胞后, GSH含量增加, 表明水飛薊素能夠促進(jìn)肝細(xì)胞的抗氧化能力的提高, 這將有助于抵抗細(xì)胞內(nèi)ROS的產(chǎn)生, 保護(hù)肝細(xì)胞[17]。然而, 有關(guān)水飛薊素對(duì)肝細(xì)胞氧化應(yīng)激和脂質(zhì)蓄積影響的內(nèi)在作用機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

4 結(jié)論

本研究發(fā)現(xiàn), 水飛薊素能夠抑制油酸誘導(dǎo)的草魚(yú)肝細(xì)胞脂質(zhì)蓄積, 改善肝細(xì)胞的脂肪變性狀況,其作用機(jī)制可能與其抑制脂質(zhì)合成基因的表達(dá)有關(guān); 同時(shí)水飛薊素能夠提高肝細(xì)胞的抗氧化能力,表明水飛薊素或可作為一種具有開(kāi)發(fā)潛力的魚(yú)用降脂及抗氧化因子。另外, 研究認(rèn)為, 結(jié)合在體飼養(yǎng)試驗(yàn), 通過(guò)建立細(xì)胞離體培養(yǎng)模型進(jìn)行微量成分作用機(jī)制研究和功能性添加劑的篩選, 可作為開(kāi)展水產(chǎn)動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)學(xué)研究和飼料開(kāi)發(fā)的有效方法。

圖7 RT-PCR測(cè)定水飛薊素對(duì)草魚(yú)肝細(xì)胞脂質(zhì)代謝相關(guān)基因的影響(平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤, n=3)Fig. 7 Effects of silymarin on the relative expression of the lipid metabolism related genes in grass carp hepatocytes (mean±SE, n=3)

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INHIBITORY EFFECT OF SILYMARIN ON OLEIC ACID-INDUCED LIPID ACCUMULATION IN GRASS CARP (CTENOPHARYNGODON IDELLUS)HEPATOCYTES IN VITRO

XIAO Pei-Zhen1, JI Hong1, ZHANG Bao-Tong2, YE Yuan-Tu3, SUN Jian1, YANG Zhou1,LI Xue-Xian1and TIAN Jing-Jing1
(1. College of Animal Science and Technology, Northwest A amp; F University, Yangling 712100, China; 2. Open Lab for Aquatic Animal Nutrition, Beijing Research Institute for Nutritional Resources, Beijing 100069, China; 3. Key Laboratory of Aquatic Nutrition of Jiangsu Province, School of Biology and Basic Medical Sciences, Soochow University, Suzhou 215123, China)

The objective of this study was to explore the mechanism and effect of silymarin on hepatocytes lipid accumulation of grass carp (Ctenopharyngodon idellus) induced by oleic acid (OA). Hepatocytes were treated at 400 μmol/L OA with or without silymarin to observe the cell viability by 3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT) and the lipid accumulation by Oil Red O stain. We also tested the effects of silymarin on the antioxidant capacities and the expression of lipid metabolism related gene in hepatocytes in grass carp detected by RT-PCR.The results showed that the cell viability was not affected by the treatment of 400 μmol/L OA with 75—125 μg/mL silymarin in presence for 24h (P＞0.05). The intracellular lipid content of hepatocytes decreased significantly after the treatment of 400 μmol/L OA with 100—150 μg/mL silymarin for 24h by Oil Red O stain (P＜0.05). Compared with the OA group, SM100 group showed time-dependent trend on the decreasing lipid accumulation (P＜0.05). Reduced glutathione (GSH) contents were higher in SM100 group than those in the OA group. The expressions of fatty acid synthase(FAS) and stearoyl-CoA desaturases 1 (SCD1) mRNA were significantly downregulated in SM100 group compared with those in the OA group (P＜0.05). These results demonstrated silymarin exerted an inhibitory effect on lipid accumulation by decreasing lipogenesis, and enhanced antioxidative ability in grass carp hepatocytes. Silymarin may shed light on the prevention of fatty liver.

Silymarin; Lipid accumulation; Hepatocyte; Grass carp; Oleic acid

S963.7

A

1000-3207(2017)06-1301-10

2017-01-04;

2017-03-17

陜西省水產(chǎn)健康生態(tài)養(yǎng)殖技術(shù)集成與示范(2014-TS-36)資助 [Supported by the Technical Integration and Demonstration of Aquaculture Health Ecology in Shaanxi Province (2014-TS-36)]

蕭培珍(1980—), 女, 山西忻州人; 博士研究生在讀; 主要研究方向?yàn)樗镅芯糠椒ㄅc技術(shù)。E-mail: peizhenxiao2012@163.com

吉紅(1967—), 男, 河南靈寶人; 博士, 教授, 博士生導(dǎo)師; 主要研究方向?yàn)樗a(chǎn)動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)與飼料。E-mail: jihong@nwsuaf.edu.cn