*

1.遼寧中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，遼寧 大連 116600；2.大連醫(yī)科大學(xué)藥理教研室，遼寧 大連 116044

HPLC法測定咳喘寧口服液中鹽酸麻黃堿和鹽酸偽麻黃堿的含量

曹燕妮1李傳勛2呂佳1*周藝璇1

1.遼寧中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，遼寧 大連 116600；2.大連醫(yī)科大學(xué)藥理教研室，遼寧 大連 116044

目的采用高效液相色譜法測定出咳喘寧口服液中鹽酸麻黃堿和鹽酸偽麻黃堿的含量。方法選取Welch ultimate XB-C18(4.6mm×200mm, 5μm)色譜柱；乙腈-水(含0.1%磷酸，每100mL中需加入0.3 g十二烷基硫酸鈉)(38∶62)為流動相；流速1mL/min；檢測波長206 nm。結(jié)果鹽酸麻黃堿和鹽酸偽麻黃堿分別在一定的濃度范圍內(nèi)與各自的峰面積線性關(guān)系良好，平均回收率分別為101.291%、99.760%，RSD分別為0.306%、2.19%(n=6)。結(jié)論此方法專屬性強(qiáng)，操作簡單，能在同一色譜條件下同時測定鹽酸麻黃堿和鹽酸偽麻黃堿的含量，測量結(jié)果準(zhǔn)確。

咳喘寧口服液；鹽酸麻黃堿；鹽酸偽麻黃堿；高效液相色譜法；含量測定

咳喘是肺病的主要癥狀，發(fā)病原因有外感內(nèi)傷之別，病機(jī)有寒熱虛實之分，咳喘與痰密切相關(guān)，咳喘每多夾痰，痰也會導(dǎo)致咳喘。由此可見治療咳喘的同時應(yīng)結(jié)合祛痰。近年來，經(jīng)濟(jì)快速發(fā)展，人民生活水平不斷提高，生活節(jié)奏加快，同時伴隨著環(huán)境污染問題的嚴(yán)重，飲食因素、情志因素和環(huán)境因素等均可誘發(fā)咳喘。咳喘還會引發(fā)支氣管炎、胸膜炎、肺結(jié)核、喉水腫等各種并發(fā)癥，故對于咳喘不容小覷。因此研發(fā)一類療效明顯的既止咳又能祛痰、平喘的中藥處方顯得愈發(fā)有價值[1-2]。

咳喘寧口服液為復(fù)方制劑，該處方是在咳喘類藥方的基礎(chǔ)上研究形成的一個制劑。處方由麻黃、黃芩、前胡等六味藥組成，具有清熱化痰、止咳平喘的功效，主要用于肺熱咳喘疾病，臨床效果良好。原為湯劑，經(jīng)改進(jìn)制成口服液，方中麻黃可宣通肺氣，止咳平喘，臨床應(yīng)用廣泛，療效明顯[3-4]，其主要有效成分鹽酸麻黃堿和鹽酸偽麻黃堿的藥理作用十分廣泛，其中鹽酸麻黃堿有顯著的平喘效果[5-6]。鹽酸偽麻黃堿能有效緩解感冒時的鼻塞、流鼻涕、打噴嚏等癥狀。為控制制劑質(zhì)量，研究采用高效液相色譜(HPLC)法，選擇在同一色譜條件下，同時測定咳喘寧口服液中鹽酸麻黃堿和鹽酸偽麻黃堿的含量，為該產(chǎn)品的質(zhì)量控制分析打下良好的基礎(chǔ)。

1 儀器與材料

1.1 儀器 島津LC-2010HT高效液相色譜儀(包含四元泵，VWD檢測器，自動進(jìn)樣器，ChemStation化學(xué)工作站，日本島津有限公司)；AE240型十萬分之一電子分析天平(瑞士梅特勒-托利多公司)。

1.2 試藥 咳喘寧口服液(批號：20170301、20170302、20170303)；鹽酸麻黃堿(批號：171241-201508)、鹽酸偽麻黃堿對照品(批號：171237-201510)均購自中國食品藥品檢定研究院；甲醇、乙腈為色譜純，其余試劑采用分析純，水為重蒸餾水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 色譜柱：月旭Welch ultimate XB-C18(4.6mm×200mm，5μm)；流動相：乙腈-水(含0.1%磷酸，每100 mL中需加入0.3g十二烷基硫酸鈉)(38∶62)；流速：1.0 mL/min；檢測波長：206 nm；進(jìn)樣量：10 μL；柱溫：30℃。理論塔板數(shù)均不得低于5000。

2.2 混合對照品溶液的制備 精密稱取鹽酸麻黃堿對照品10.56 mg和鹽酸偽麻黃堿對照品11.12 mg，分別置于100 mL容量瓶中，加甲醇溶解稀釋至刻度，搖勻，作為鹽酸麻黃堿對照品溶液(濃度為0.1056 mg/mL)和鹽酸偽麻黃堿對照品溶液(濃度為0.1112 mg/mL)。分別精密吸取上述配置好的溶液各5 mL置同一10 mL容量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得混合對照品溶液(混合對照品中鹽酸麻黃堿濃度為0.0528 mg/mL，鹽酸偽麻黃堿濃度為0.0556 mg/mL)。

2.3 供試品溶液的制備 精密吸取咳喘寧口服液1mL于10mL量瓶中，加甲醇溶解稀釋至刻度，搖勻，用0.45μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，作為供試品溶液。

2.4 陰性對照溶液的制備 精密量取處方中缺麻黃的陰性樣品1mL，按“2.3”項下供試品溶液的制備方法制備陰性對照溶液。

2.5 專屬性試驗 分別取混合對照品溶液、供試品溶液和陰性對照溶液，依次按“2.1”項下色譜條件進(jìn)樣測定，并記錄色譜圖，結(jié)果顯示陰性對照無干擾，見圖1。

2.6 線性關(guān)系考察 吸取“2.2”項下制備好的混合對照品溶液2、5、10、15、20、25μL，按“2.1”項下色譜條件分別進(jìn)樣，記錄各自峰面積。以混合對照品的進(jìn)樣量(μg)為橫坐標(biāo)，與之相對應(yīng)的峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，求得鹽酸麻黃堿、鹽酸偽麻黃堿回歸方程分別為：

Y1= 2338194X-38237.9，r1=0.9999和Y2=2402344X-29017.9，r2= 0.9999。線性范圍分別為0.1056～1.32 μg和0.1112～1.39 μg。結(jié)果顯示，鹽酸麻黃堿和鹽酸偽麻黃堿進(jìn)樣量分別在一定的濃度范圍內(nèi)與各自的峰面積線性關(guān)系良好。

2.7 精密度試驗 取“2.2”項下制備好的混合對照品溶液，按“2.1”項下色譜條件，依次連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄峰面積。計算得鹽酸麻黃堿和鹽酸偽麻黃堿峰面積的RSD分別為0.072%和0.151%，此結(jié)果表明儀器的精密度良好。

2.8 穩(wěn)定性試驗 取批號20170301的供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件，選擇在0、2、4、8、12、24h進(jìn)樣測定，記錄峰面積。計算得鹽酸麻黃堿和鹽酸偽麻黃堿峰面積的RSD(n=6)分別為1.03%和1.04%，說明供試品溶液24h內(nèi)是穩(wěn)定不變的。

2.9 重復(fù)性試驗 取批號20170301的同一樣品6份，按“2.1”項下色譜條件依次進(jìn)樣，記錄各自峰面積，計算其含量。得鹽酸麻黃堿和鹽酸偽麻黃堿平均含量分別為0.8656mg/mL和0.4133mg/mL，RSD分別為0.15%和0.45%，說明該方法的重復(fù)性良好。

2.10 加樣回收率試驗 精密量取6份已知含量的批號20170301的樣品，每份0.5mL，依次加入鹽酸麻黃堿對照品溶液(0.0965 mg/mL)4mL和鹽酸偽麻黃堿對照品溶液(0.1112mg/mL)2mL，按“2.3”項下方法制備供試品溶液，且按“2.1”項下色譜條件進(jìn)樣，記錄峰面積，計算鹽酸麻黃堿和鹽酸偽麻黃堿的含量，從而計算加樣回收率，結(jié)果得鹽酸麻黃堿和鹽酸偽麻黃堿的平均回收率分別為101.291%和99.760%，RSD分別為0.306%和2.19%。見表1和表2。

表1 鹽酸麻黃堿回收率考察結(jié)果 (n=6)

表2 鹽酸偽麻黃堿回收率考察結(jié)果 (n=6)

2.11 樣品測定 取批號20170301，20170302，20170303的咳喘寧口服液樣品各3份，按“2.3”項下的方法制備供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積。結(jié)果得咳喘寧供試品中鹽酸麻黃堿的含量分別為0.8623、0.8536、0.8447mg/mL，RSD分別為0.121%、0.828%、0.149%。鹽酸偽麻黃堿的含量分別為0.4184、0.4154、0.4082mg/mL，RSD分別為0.452%、0.230%、0.957%。

3 討論

3.1 方法考察 實驗起初嘗試了乙腈-水體系，并在其中添加磷酸鹽緩沖液或添加三乙胺，結(jié)果發(fā)現(xiàn)色譜圖中麻黃堿拖尾嚴(yán)重，鹽酸麻黃堿和鹽酸偽麻黃堿無法分離，系統(tǒng)適應(yīng)性差，無法得到滿意的色譜峰型。后嘗試在體系中添加離子對試劑十二烷基硫酸鈉后，可以有效改善麻黃堿色譜峰的拖尾現(xiàn)象，鹽酸麻黃堿和鹽酸偽麻黃堿分離效果好，二者的含量可以準(zhǔn)確測定，符合系統(tǒng)適應(yīng)性的要求。

3.2 耐用性考察 在選擇流動相乙腈-水體系比例時，分別嘗試了乙腈-水為37∶63、38∶62、39∶61、40∶60、41∶59等各個不同的比例，結(jié)果發(fā)現(xiàn)當(dāng)乙腈-水的比例為39∶61時鹽酸麻黃堿與鹽酸偽麻黃堿這兩個峰剛好可以分離，且與供試品中其它峰分離效果好，大于此比例時鹽酸麻黃堿與鹽酸偽麻黃堿分離效果不佳，且與供試品中其它峰分離效果不理想，小于此比例時鹽酸麻黃堿和鹽酸偽麻黃堿分離效果較好，但保留時間過長，綜合考慮，最后選定乙腈-水的比例為38∶62，此條件下分離效果最佳，見表3。

表3 流動相比例變動考察結(jié)果

3.3 色譜柱柱溫考察 分別考察了25℃，30℃，35℃等間隔5℃的不同溫度對鹽酸麻黃堿和鹽酸偽麻黃堿色譜行為的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)不同的溫度對二者的系統(tǒng)適應(yīng)性參數(shù)及保留時間沒有明顯影響，故最終柱溫選擇30℃。見表4。

3.4 流速變動考察 分別選擇了流速為0.8mL/min、1.0mL/min、1.2mL/min等多個流速對鹽酸麻黃堿和鹽酸偽麻黃堿色譜行為的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)不同的流速對二者的系統(tǒng)適應(yīng)性參數(shù)及保留時間沒有明顯影響，故最終流速選擇1.0mL/min。見表5。

表4 柱溫變動考察結(jié)果

表5 流速變動考察結(jié)果

3.5 波長變動考察 分別考察了201nm、206nm、211nm等多個波長對鹽酸麻黃堿和鹽酸偽麻黃堿色譜行為的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)不同的波長對二者的影響較大，且波長在206nm時二者的峰面積最大，故波長設(shè)定為206nm。

3.6 色譜柱變動考察 分別考察了色譜柱1月旭Welch μltimate XB-C18(4.6 mm×200 mm, 5μm; Part Number: Wel518420; Serial Nmber: W11211672; Lot Nmber: W1801.19)，色譜柱2 InertSustain C18(4.6 mm×150 mm, 5μm; C/N 5020-07345 S/N 3JR97103; GL 5ciences Inc. Made in Japan.)，色譜柱3 Agilent TC-C18(Agilent; 4.6 mm×250 mm, 5μm; PN 518925-902 SN USEGK04898 LN MP10570002. Made in Japan.)對鹽酸麻黃堿和鹽酸偽麻黃堿色譜行為的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在色譜柱2條件下，兩者峰之間有重疊，無法達(dá)到準(zhǔn)確分離的效果。色譜柱3的保留時間增加，分離效果也不及色譜柱1，故色譜柱1為最佳選擇。

綜上，實驗在藥典中麻黃堿含量測定方法的基礎(chǔ)上進(jìn)行了改進(jìn)，選擇在同一色譜條件下同時測定鹽酸麻黃堿和鹽酸偽麻黃堿的含量，方法簡便，易于操作，且有效縮短了實驗時間，提高了咳喘寧口服液中鹽酸麻黃堿和鹽酸偽麻黃堿含量測定結(jié)果的準(zhǔn)確性，具有一定的實用價值。

[1]邵長榮.談?wù)効却牟∫騕N].上海中醫(yī)藥報,2004.

[2]李今庸.咳喘的病因病機(jī)及其辨證施治[J].武漢醫(yī)學(xué)雜志,1980,4(1):47-49.

[3]中國人民解放軍總后勤部衛(wèi)生部.中國人民解放軍醫(yī)療機(jī)構(gòu)制劑規(guī)范[M].北京：人民軍醫(yī)出版社，2003.

[4]李翔,劉皈陽,馬建麗，等.HPLC法測定麻杏口服液中鹽酸麻黃堿和鹽酸偽麻黃堿的含量[J].藥物分析雜志,2014,34(1):190-192.

[5]楊昕宇，肖長若，張凱熠，等.麻黃臨床應(yīng)用與藥理作用研究進(jìn)展[J].中華中醫(yī)藥學(xué)刊，2015,33(12)：2874-2877.

[6]陸燕萍，劉佳麗，鞏曉宇，等.麻黃藥理作用及含量測定的研究進(jìn)展[J].中國醫(yī)藥導(dǎo)報，2013,10(24)：38-40.

[7]國家藥典委員會.中華人民共和國藥典(一部)[M].北京:中國醫(yī)藥科技出版社,2010:附錄 XD.

[8]段立軍,孫博航.黃芪甲苷研究進(jìn)展[J].沈陽藥科大學(xué)學(xué)報,2011，28(5):410-414.

[9]江清林,李延軍,辛華,等.黃芪甲苷對胰島素C肽分泌作用研究[J].黑龍江醫(yī)藥科學(xué),1999,22(3):4.

[10]江清林,姜吉文,呂學(xué)詵,等.黃芪甲苷對類胰升血糖素肽-1作用的研究[J].中國老年學(xué)雜志,2003,23(1):52.

[11]南克祎,邢淵.胰升血糖素樣肽1對胰島β細(xì)胞的調(diào)控作用[J].甘肅醫(yī)藥,2011(7):405-407.

[12]劉浩文,劉嘉儀,楊妙榮,等.黃芪藥材中黃芪甲苷含量測定的兩種方法的比較研究[J].中華新藥與臨床藥理,2011,22(6):659-662.

[13]付靜,朱月月,聶詩明.定喘止咳糖漿中麻黃堿及偽麻黃堿的含量測定[J].中國藥業(yè),2015,24(20):79-80.

DeterminationofEphedrineHydrochlorideandPseudoephedrineHydrochlorideinKeChuanNingOralLiquidbyHPLC

CAO Yanni1LI Chuanxun2LV Jia1*ZHOU Yixuan1

1.College of Pharmacy, Liaoning University of Traditional Chinese Medicine, Dalian 116600, China；2. College of Pharmacy, Dalian Medical University, Dalian 116600, China

ObjectiveHPLC method was used for determination of ephedrine hydrochloride and pseudoephedrine hydrochloride in Ke chuan ning oral solution.MethodsTo select the Welch ultimate XB-C18(4.6mm×200mm, 5μm); the mobile phase consisted of acetonitrile-water(including 0.1% phosphoric aid, 0.3g dodecyl sodium sulfate was added into 100mL solution)(38∶62); the flow rate is 1mL/min; the detection wavelength was 206nm.ResultsEphedrine hydrochloride and pseudoephedrine hydrochloride respectively showed the good linear relationship between their respective peak area, and the average recoveries were 101.291% and 99.760%,RSDwere 0.306% and 2.19%(n=6),respectively.ConclusionThe method is highly proprietary and easy to operate, and can be used to determine the content of ephedrine hydrochloride and pseudoephedrine hydrochloride simultaneously, and the results show that the measurement results are accurate.

Ke Chuan Ning Oral Liquid; Ephedrine Hydrochloride; Pseudoephedrine Hydrochloride; HPLC; Content Determination

曹燕妮(1987-)，女，漢族，碩士研究生，研究方向為中藥藥劑學(xué)。E-mail:963834657@qq.com

呂佳(1970-)，女，漢族，碩士研究生，副教授，研究方向為中藥藥劑學(xué)。E-mail:lvjiaemail@163.com

R284.1

A

1007-8517(2017)21-0022-04

2017-09-22 編輯：鄧佳麗)