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(1.漢中市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所， 陜西 漢中 723000； 2.漢中市種子管理站， 陜西 漢中 723000)

·種子檢驗(yàn)·

鑒定甘藍(lán)型油菜雜交種種子純度的SSR分子標(biāo)記引物篩選

薛艷1，李英1，張星1，王風(fēng)敏1，諶國(guó)鵬1，習(xí)廣清1，李虎1，胡寶華1，田曉舟2

(1.漢中市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所， 陜西 漢中 723000； 2.漢中市種子管理站， 陜西 漢中 723000)

為了建立一套快速可靠的甘藍(lán)型油菜雜交種純度的鑒定方法，選擇具有代表性的6份油菜品種(組合)，采用20對(duì)SSR甘藍(lán)型油菜首選核心引物對(duì)供試材料進(jìn)行引物篩選，并將篩選出的引物應(yīng)用于雜交種的種子純度鑒定。目前已為其中每個(gè)雜交種(組合)平均篩選出1～3對(duì)引物，經(jīng)大田驗(yàn)證可用于雜交種的真假鑒定和純度鑒定，應(yīng)用前景十分廣闊。

甘藍(lán)型油菜； 雜交種； 種子純度； SSR

油菜雜交種不但在產(chǎn)量性狀上具有明顯的雜種優(yōu)勢(shì)，而且其品質(zhì)及抗性方面也較常規(guī)種具有顯著的優(yōu)勢(shì)[1]。種子純度是影響油菜雜交種質(zhì)量的重要參數(shù)，直接影響雜交種在生產(chǎn)上的產(chǎn)量表現(xiàn)，因此在雜交種大面積推廣前必須對(duì)種子純度進(jìn)行鑒定[2]。

傳統(tǒng)油菜雜交種純度的鑒定采用大田異地鑒定或同工酶和貯藏蛋白電泳技術(shù)。大田鑒定由于費(fèi)時(shí)費(fèi)工成本高，雖然結(jié)果可靠但很難在生產(chǎn)上推廣，而同工酶和貯藏蛋白電泳技術(shù)鑒定譜帶少，標(biāo)記多態(tài)性相對(duì)較低，難以顯示出不同品種基因型間的差異[3]。近年來(lái)，隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，各種分子標(biāo)記技術(shù)大量應(yīng)用到雜交種純度的鑒定中，其中SSR(Simple Sequence Repeats)作為第二代基于PCR(Polymerase Chain Reaction)的一種新型DNA分子遺傳標(biāo)記，由于其數(shù)量豐富，覆蓋整個(gè)基因組，揭示的多態(tài)性高，具有多等位基因的特性，提供的信息量高，以孟德爾方式遺傳，在F1代呈共顯性，更加適合種子純度鑒定，而且實(shí)驗(yàn)操作簡(jiǎn)單，穩(wěn)定性強(qiáng)、重復(fù)率高、成本低，已被廣泛應(yīng)用于大豆、玉米、水稻等種子純度鑒定[4-6]。

表1 SSR引物序列Primer Sequence (5'3')

引物名稱引物序列Na14?G10ACGAAGTGGGTTAGTAGGCGGAAGCCTTTCTCCACCATTGNa12?E02TTGAAGTAGTTGGAGTAATTGGAGGGCAGCCACAACCTTACGBRAS067AATTTAAACCTCATTTTCTTCACCTCCATTGTGTCTGATCB10027CGGCTTGTAAACCTTGGACTCGAAAATCACTAACACCB10028CTGCACATTTGAAATTGGTCAAATCAACGCTTACCCACTCB10036ATTCATCTCCTGCTCGCTTAGAAACCCAAACCAAAGTAAGAACB10057CTAGGCTAAGGAAGATTGTCATAGTTTCTTCCTCCTGCTATCCB10172ATTGGTCTCTTAACCCGCTTCTCGAATCCCTCGAACB10299TACAGGTTCCTTGCGATGATGGACGAGACAACATGGCB10330AGGCGAGTTTACGAGGATACCTGCACCAGTCATTTGCB10364GAGACGATGCAAAGATCGTGCAGACACATTCGAACACB10369CATTCACAGGACCAGAGCCAAAGCCAAGACAACCATCB10373CGGTCAGATTCCAACAGAGCCATCTCAGAGACGACACB10427TCCCAACAAAAGAGTCCACAGCGAACCGAGTCTAAACB10587TTGTGTTTTGCCTTCTGATTTGCGCACAAACAATAACN5CGTTGGCAAAAAGCCTACTCCTCAGGGACGTCGTAAGAGCCN22TTGCTTCCAGAGATCTGGTTCGCGACTACTAAATTGTCGTGTTCN48GCGATCTCCTCAGGCATAGTCCACGCAAGCTGAAACATAACN52CCGGCTTGGTTCGATACTTATTGCGAATCTTTAAGGGACGCN57CACACCCTTACCACGTTCCTGCAACAAAGCATACTTCGCA

1 材料和方法

1.1 材 料

國(guó)審品種漢油8號(hào)和即將審定的油菜組合5份，均由漢中市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所油菜研究室提供。

1.2 方 法

1.2.1 樣品DNA提取

每份材料用千粒板數(shù)120粒油菜種子，均勻播撒在鋪有濾紙的培養(yǎng)皿中，待苗子培養(yǎng)7 d左右，取其葉片用SDS法提取DNA。

1.2.2PCR擴(kuò)增20對(duì)SSR引物序列參照國(guó)家農(nóng)業(yè)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)油菜品種鑒定DNA序列(附表1)[7]，MIX、引物均購(gòu)于西安沃爾森公司。從20對(duì)SSR引物中篩選出具有多態(tài)性的引物加以利用，進(jìn)一步設(shè)計(jì)多重PCR進(jìn)行品種純度鑒定。

PCR擴(kuò)增按如下反應(yīng)體系進(jìn)行：Mix 7.5μL，DNA 2μL，Prime 1μL，ddH2O 4.5μL，總體系15.0μL。

采用降落PCR反應(yīng)程序，按下列參數(shù)進(jìn)行：

94 ℃變性5 min，94 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 45 s 10個(gè)循環(huán)，每循環(huán)退火溫度降低0.5 ℃；94 ℃ 1 min，55 ℃ 30 s，72 ℃ 45 s 30個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。

1.2.3 PAGE膠電泳及染色

制膠：凝膠成分包括5×TBE、30%丙烯酰胺、ddH2O、10%過(guò)硫酸銨、TEMED凝固催化劑，電泳緩沖液為0.5×TBE。

PAGE電泳檢測(cè)：在電泳槽上進(jìn)行8%的變性聚丙烯酰胺凝膠(PAGE)電泳，電壓150 V，電泳1.5 h。

顯帶：電泳完成后，用硝酸銀染色顯帶，具體包括7個(gè)步驟：固定—水洗—染色—快速漂洗—顯影—停顯—漂洗—風(fēng)干保存。

1.2.4引物的篩選

構(gòu)建親本DNA樣品混合基因池：取母本的12個(gè)單株葉片，分別提取DNA后，等量混合構(gòu)建一個(gè)基因池，同樣的方法取父本12個(gè)單株葉片，等量混合構(gòu)建另一個(gè)基因池。用親本的這2個(gè)混合樣品池進(jìn)行SSR引物篩選，得到具有多態(tài)性的擴(kuò)增引物[8]。

用上述步驟中親本篩選到的多態(tài)性引物，擴(kuò)增雜交種的混合基因池樣品，進(jìn)一步篩選得到可用于鑒定種子純度的多態(tài)性SSR引物。

1.2.5數(shù)據(jù)處理與結(jié)果分析

SSR純度(%)=(檢測(cè)株數(shù)-母本帶型數(shù)-父本帶型數(shù))×100/檢測(cè)株數(shù)。

田間鑒定：將試驗(yàn)中所用同批次雜交種進(jìn)行大田種植，在供試材料發(fā)育至盛花期時(shí)，根據(jù)育性表現(xiàn)進(jìn)行調(diào)查，田間鑒定純度(%)=(檢測(cè)株數(shù)-不育株數(shù)-異型株數(shù))×100/檢測(cè)株數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 引物的篩選結(jié)果

本試驗(yàn)用20對(duì)油菜首選核心引物為6對(duì)雜交種(組合)篩選引物，目前已為每個(gè)雜交組合平均篩選出1～3對(duì)雙親互補(bǔ)型引物(父母本的特征條帶在雜種中同時(shí)出現(xiàn))，經(jīng)驗(yàn)證可用于雜交種的真假鑒定和純度鑒定(見表2)。

2.2 雜交種純度的SSR鑒定

為了驗(yàn)證SSR標(biāo)記對(duì)參試雜交種(組合)純度鑒定結(jié)果的可靠性，用篩好的引物Na 12-E 02將漢11 C 20的純度進(jìn)行了SSR鑒定(圖1)，鑒定結(jié)果顯示其純度為92%，與田間鑒定結(jié)果94%非常接近，SSR鑒定結(jié)果與田間鑒定結(jié)果基本一致。從總體結(jié)果來(lái)看，田間鑒定和室內(nèi)鑒定2種方法的結(jié)果相關(guān)系數(shù)均在0.95以上，表明這2種鑒定方法有很高的相關(guān)性。

表2 種子純度鑒定SSR引物篩選結(jié)果

漢11C20Z11×D?5漢11C29漢油7號(hào)漢1418漢油8號(hào)Na12?E02CB10330CB10369CB10369CB10330CB10026CN48Na12?E02CN52CN57CB10373CB10028CB10373CB10028

表3 田間種植鑒定和SSR標(biāo)記鑒定的純度結(jié)果

品種(組合)田間鑒定株數(shù)不育株數(shù)異型株數(shù)田間鑒定純度(%)母本帶型株數(shù)父本帶型株數(shù)SSR鑒定純度(%)2種方法相關(guān)系數(shù)漢11C2019810094．98091．80．97Z11×D?51987196．06095．00．99漢11C2919811094．47292．50．98漢油7號(hào)19812292．910190．80．98漢14181989095．58093．30．98漢油8號(hào)19814291．915087．50．95

3 結(jié)論與討論

通過(guò)對(duì)本試驗(yàn)中油菜雜交種的室內(nèi)分子鑒定和田間種植鑒定2種結(jié)果進(jìn)行比較分析，認(rèn)為在對(duì)種子進(jìn)行純度鑒定時(shí)，這2種方法得出的結(jié)果基本一致，可以用SSR標(biāo)記鑒定來(lái)代替田間純度鑒定，從而克服田間鑒定周期長(zhǎng)、易受外界環(huán)境條件影響等缺點(diǎn)。而室內(nèi)鑒定的純度基本都低于大田鑒定純度，這是因?yàn)榉N植鑒定主要根據(jù)品種表現(xiàn)和生物學(xué)性狀進(jìn)行判定，檢測(cè)結(jié)果受檢測(cè)人員經(jīng)驗(yàn)水平和樣品親本的遺傳差異度影響。而應(yīng)用SSR分子標(biāo)記進(jìn)行種子純度鑒定時(shí)，揭示的是種子基因組DNA序列的多態(tài)性，因此，結(jié)果的準(zhǔn)確性更高。而對(duì)油菜雜交種純度進(jìn)行鑒定時(shí)所選用的SSR引物越多，提供的信息量越大，其結(jié)果的可靠性也越高，但其開發(fā)成本也相對(duì)較高。在實(shí)際生產(chǎn)中，油菜雜交種的假雜種主要來(lái)源于制種過(guò)程中的母本自交系，因此只要選用一對(duì)或者2對(duì)合適的共顯性SSR引物鑒別親本類種子，就可以達(dá)到雜交種純度鑒定的目的。

注：1～20為漢11 C 20雜交種； M為DNA marker；P 1為母本；P 2～P 3為父本。圖1 SSR引物Na 12-E 02在漢11 C 20群體中的驗(yàn)證

在應(yīng)用SSR技術(shù)鑒定種子純度時(shí)，多態(tài)性引物的篩選是整個(gè)實(shí)驗(yàn)的核心，一般會(huì)遇到4種引物類型：雜交F1代和父母本無(wú)任何多態(tài)性、偏父型、偏母型、雙親互補(bǔ)型。偏父型引物可以檢測(cè)出摻雜父本自交系的種子，偏母型引物可以檢測(cè)出摻雜人工去雄不徹底的種子，雙親互補(bǔ)型引物則可以把三者都區(qū)分出來(lái)，而決定某一引物是否適合用來(lái)進(jìn)行鑒定的關(guān)鍵在于父母本的特征條帶能否在雜種中同時(shí)出現(xiàn)[9]。隨著作物選育品種數(shù)目的增多及育種材料遺傳基礎(chǔ)的日益狹窄，品種間的遺傳差異越來(lái)越小，傳統(tǒng)的生物學(xué)性狀鑒定方法已經(jīng)難以滿足品種真實(shí)性和純度鑒定的要求。分子生物學(xué)的發(fā)展和分子標(biāo)記的應(yīng)用，能夠克服大田鑒定費(fèi)時(shí)費(fèi)工及鑒定結(jié)果滯后等缺點(diǎn)，在雜交種純度鑒定中的應(yīng)用前景將十分廣闊[10]。

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Screening of SSR Primers for Identification the Seed Purity ofHybridBrassicanapus

XUEYan1，LIYing1，ZHANGXing1，WANGFengmin1，CHENGuopeng1，XIGuangqing1，LIHu1，HUBaohua1，TIANXiaozhou2

2016-12-20

科技部農(nóng)業(yè)科技成果轉(zhuǎn)化資金項(xiàng)目“國(guó)審油菜新品種漢油8號(hào)繁育與示范”(2013 GB 2 G 000466)。

薛 艷(1982—)，女，陜西漢中人；農(nóng)藝師，碩士，主要從事油菜分子育種研究；E-mail：791477005@qq.com。

10.16590/j.cnki.1001-4705.2017.06.125

S 565.4

A

1001-4705(2017)06-0125-03