湯 昆，張 漓

5周間歇性亞極限強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)中大鼠睪丸組織StAR及其調(diào)控因子的時(shí)序性變化

湯 昆1，2，張 漓1

目的：探討5周間歇性亞極限強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)引起大鼠睪酮水平下降的可能機(jī)制。方法：8周齡SD大鼠分為運(yùn)動(dòng)干預(yù)組和安靜對(duì)照組，運(yùn)動(dòng)組大鼠以尾部負(fù)重的方式（6%體重）進(jìn)行4 min×5次游泳訓(xùn)練，間隔90 s，上、下午各進(jìn)行1次訓(xùn)練，每周6天，分別持續(xù)1、2、3、4、5周。各組大鼠末次訓(xùn)練結(jié)束48 h后取材，測(cè)定StAR、PKA、pCREB、SF-1等相關(guān)蛋白及基因mRNA變化情況。結(jié)果：1）運(yùn)動(dòng)干預(yù)組血睪酮水平后2周下降幅度較大，第5周血睪酮水平與安靜對(duì)照組相比下降了70%（P＜0.01）。2）運(yùn)動(dòng)干預(yù)組大鼠StAR mRNA在第5周出現(xiàn)了顯著性下降（P＜0.05）。3）大鼠睪丸組織PKA、pCREB、SF-1蛋白表達(dá)以及SF-1 mRNA表達(dá)在后2周出現(xiàn)了顯著下降（P＜0.05）。結(jié)論：5周間歇性亞極限強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)引起大鼠睪丸間質(zhì)細(xì)胞內(nèi)StAR及其相關(guān)調(diào)控因子PKA、pCREB、SF-1等表達(dá)下降，進(jìn)而引起膽固醇轉(zhuǎn)運(yùn)受限，這可能是導(dǎo)致睪酮合成和血液睪酮水平下降的原因之一。

運(yùn)動(dòng)性低睪酮；亞極限強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)；StAR；時(shí)序性變化；大鼠

血清睪酮是常用的機(jī)能評(píng)定指標(biāo)，越來(lái)越多被用于評(píng)定運(yùn)動(dòng)員的訓(xùn)練負(fù)荷，運(yùn)動(dòng)負(fù)荷強(qiáng)度和負(fù)荷量都會(huì)對(duì)血睪酮產(chǎn)生影響［12］，測(cè)定運(yùn)動(dòng)員機(jī)體血睪酮水平不僅有助于教練員合理地安排運(yùn)動(dòng)員運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度、運(yùn)動(dòng)量，而且在消除疲勞過(guò)程中都起到重要作用。有研究表明，睪酮合成的主要限速步驟是膽固醇由線粒體外膜向線粒體內(nèi)膜轉(zhuǎn)運(yùn)的過(guò)程，在這過(guò)程中StAR蛋白起到了關(guān)鍵性的作用。有研究證實(shí)，長(zhǎng)時(shí)間大強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)會(huì)導(dǎo)致StAR mRNA下降，這也被認(rèn)為是睪酮水平顯著降低的重要誘因，然而，StAR mRNA下降的原因卻鮮見(jiàn)報(bào)道。本研究擬利用低睪酮?jiǎng)游锬Ｐ?，以StAR調(diào)控通路為研究?jī)?nèi)容，重點(diǎn)探討長(zhǎng)期間歇性無(wú)氧訓(xùn)練導(dǎo)致StAR mRNA下降的過(guò)程及原因。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與飼養(yǎng)條件

成年SPF/VAF級(jí)雄性SD大鼠95只，體重300±16.16 g，購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，許可證號(hào)SCXK（京）2012-0001。大鼠分籠飼養(yǎng)，每籠5只，以標(biāo)準(zhǔn)嚙齒類(lèi)動(dòng)物飼料飼養(yǎng)，大鼠自由飲食飲水，定期更換飼料墊料。室溫22±2 ℃，空氣濕度為45%～55%，每天光照12 h。

1.2 動(dòng)物分組與運(yùn)動(dòng)方案

適應(yīng)性飼養(yǎng)3天后，所有大鼠進(jìn)行適應(yīng)性游泳訓(xùn)練（每天無(wú)負(fù)重游泳30 min，共6天）。適應(yīng)性游泳之后，隨機(jī)分為7組：安靜飼養(yǎng)0周和5周對(duì)照組（C0、C5組），各10只；訓(xùn)練1周、2周、3周、4周、5周組（T1、T2、T3、T4、T5組），各15只。運(yùn)動(dòng)組大鼠以尾部負(fù)重的方式進(jìn)行4 min×5次游泳訓(xùn)練，根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果將負(fù)重定為6%體重。每次間隔90 s，上、下午各進(jìn)行1次訓(xùn)練，每周6天，持續(xù)5周。每桶5只，水深35 cm，水溫30±2 ℃。訓(xùn)練在每天上午8：00～12：00和下午2：00～6：00完成。每周一上午訓(xùn)練之前記錄大鼠體重。對(duì)照組安靜飼養(yǎng)。

1.3 動(dòng)物處死與取材

在訓(xùn)練過(guò)程中，有個(gè)別大鼠溺亡。各組末次訓(xùn)練結(jié)束時(shí)剩余：T1組15只，T2組14只，T3組15只，T4組14只，T5組13只。各組末次訓(xùn)練結(jié)束后第3分，剪尾取10 μL尾血，檢測(cè)血乳酸情況。各組大鼠末次訓(xùn)練結(jié)束安靜飼養(yǎng)48 h后處死。處死前禁食12 h。稱(chēng)量體重后，按照1 mL/100g體重的劑量腹腔注射10%水合氯醛麻醉大鼠，迅速剖開(kāi)腹腔，分離出腹主動(dòng)脈，用一次性采血針和采血管取血，迅速3 000 r/min離心10 min，分離血清，－20 ℃冰箱保存。摘取右側(cè)睪丸，稱(chēng)重，－80 ℃保存。

1.4 實(shí)驗(yàn)儀器和試劑

主要儀器有免疫測(cè)定儀（Beckham Counter，Access2），乳酸鹽分析儀（ECK，C-line sport），全自動(dòng)生化分析儀（Hitachi，7020），低溫離心機(jī)（ThermoFisher，Biofuge 28RS），電泳儀（Bio-RAD，Power PacTMBasic），化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)（Bio-RAD，ChemiDoc Touch），酶標(biāo)儀（Labsystems Dragon，Wellscan MK3）。主要試劑包括：CK測(cè)定試劑盒購(gòu)自上?？迫A生物工程股份有限公司，BU測(cè)定試劑盒購(gòu)自上海榮盛生物藥業(yè)有限公司，睪酮測(cè)定試劑盒購(gòu)自貝克曼庫(kù)爾特商貿(mào)（中國(guó)）有限公司，LH 酶聯(lián)免疫測(cè)定試劑盒自北京賽馳生物科技有限公司，SOD、MDA測(cè)定試劑盒購(gòu)自南京建成生物工程研究所，StAR、 pCREB、SF-1、GAPDH一抗、HRP標(biāo)記的二抗均購(gòu)自美國(guó)Abcam公司，RT-PCR反轉(zhuǎn)錄及反應(yīng)試劑盒購(gòu)自TaKaRa公司。

1.5 測(cè)試指標(biāo)與主要方法

1.5.1 血液指標(biāo)測(cè)定

血乳酸采用ECK C-line乳酸鹽分析儀進(jìn)行檢測(cè)，睪酮采用BeckhamCounter Access2免疫測(cè)定系統(tǒng)進(jìn)行測(cè)試，SOD采用羥胺法，MDA采用TBA法，LH采用酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法（Elisa）進(jìn)行測(cè)試。上述測(cè)試均嚴(yán)格按照儀器及試劑說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

1.5.2 Western Blot法檢測(cè)睪丸組織蛋白表達(dá)

取大鼠睪丸組織50 mg剪碎于EP管中，加入1 mL預(yù)冷組織裂解液（由RIPA蛋白裂解液、蛋白酶抑制劑、磷酸酶抑制劑按100：1：1的比例配制而成），10 000 g離心15 min后取上清，采用BCA法測(cè)定并調(diào)整蛋白濃度，加入上樣緩沖液后沸水浴10 min。隨后即可進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳實(shí)驗(yàn)，本實(shí)驗(yàn)電泳主要參數(shù)為：上層膠80 V，30 min；下層膠110 V，60 min，電泳完成后采用半干轉(zhuǎn)方式轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。5%脫脂奶粉封閉2 h，加入一抗4 ℃過(guò)夜，次日TBST洗滌3次后加二抗（1：5 000），室溫?fù)u床孵育1 h。然后TBST洗膜3次，滴加ECL發(fā)光液，放入化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)曝光顯影，條帶用Image J軟件進(jìn)行圖像分析，計(jì)算目的蛋白與內(nèi)參蛋白條帶積分光密度（IOD）的相對(duì)值。

1.5.3 RT-PCR法檢測(cè)StAR和SF-1轉(zhuǎn)錄變化

采用Trizol法提取總RNA，隨后應(yīng)用反轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA（反應(yīng)條件為：37 ℃，15 min；85 ℃ 5 s；4 ℃保持）。以合成的cDNA為模板，以GAPDH為內(nèi)參，RTPCR擴(kuò)增（反應(yīng)條件為：預(yù)變性95 ℃，30 s；PCR反應(yīng)95 ℃，5 s；60 ℃，31 s；40個(gè)循環(huán)）。根據(jù)收集的數(shù)據(jù)通過(guò)熒光定量PCR所得數(shù)據(jù)用2-△△Ct法進(jìn)行相對(duì)定量。所有基因引物均參照GeneBank數(shù)據(jù)庫(kù)，由上海生工生物有限公司設(shè)計(jì)并合成。

表1 本研究RT-PCR反應(yīng)引物序列一覽表Table 1 Primer Sequence of RT-PCR Reaction

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與處理

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 大鼠一般情況

在整個(gè)實(shí)驗(yàn)期間，對(duì)照組大鼠神態(tài)安靜，活潑好動(dòng)，反應(yīng)靈敏，皮毛緊密光滑。運(yùn)動(dòng)干預(yù)組大鼠隨著運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練的進(jìn)行，逐漸出現(xiàn)了萎靡倦怠，瞇眼少動(dòng)，反應(yīng)遲鈍，毛散而無(wú)光澤，偶有大便稀軟不成形等現(xiàn)象。

2.2 大鼠血清睪酮、LH變化情況

表2顯示，運(yùn)動(dòng)干預(yù)組睪酮水平隨著訓(xùn)練時(shí)間的延長(zhǎng)逐步下降，前3周下降較緩慢，與C0組相比下降了27%（P＜0.01），但第4周之后睪酮下降幅度有所加大，與C0組相比下降了60%（P＜0.01），最后一周仍有小幅下降，與C0組相比下降了70%（P＜0.01）。另外，運(yùn)動(dòng)干預(yù)組大鼠血清LH水平在5周訓(xùn)練中，出現(xiàn)曲折下降，第3、4周LH水平與C0組相比下降了26%，第5周LH水平下降更顯著，與C0相比下降了41%，差異均有顯著性（P＜0.01），與C5組相比差異亦有顯著性（P＜0.01）。C5與C0組間差異沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表2 各組大鼠血清睪酮和LH測(cè)試結(jié)果Table 2 The Results of Serum Testosterone and LH

2.3 大鼠血液乳酸及睪丸組織SOD、MDA變化情況

如表3所示，5周間歇性負(fù)重游泳訓(xùn)練之后，運(yùn)動(dòng)干預(yù)組訓(xùn)練后3 min乳酸水平顯著上升。其變化趨勢(shì)為：前3周上升幅度較大，后2周則維持在較高水平且略有上升（P＞0.05），C5與C0組間差異沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。表3還顯示，游泳訓(xùn)練使運(yùn)動(dòng)干預(yù)組SOD活性顯著不斷下降。前4周下降水平相對(duì)平緩，第5周則下降至C0組SOD活性的77%。無(wú)論與C0組或者前1周相比差異非常顯著（P＜0.01）。與C0組相比，運(yùn)動(dòng)干預(yù)組MDA含量前3周略有波動(dòng)，第4周出現(xiàn)顯著上升（P＜0.05），隨后第5周MDA水平仍略有上升，較C0組相比，MDA變化差異非常顯著（P＜0.01）。C5與C0組間差異沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表3 各組大鼠乳酸、SOD和MDA測(cè)試結(jié)果Table 3 The Results of Blood Lactate，Serum SOD and MDA

2.4 大鼠睪丸組織PKA、p-CREB、SF-1蛋白表達(dá)變化情況

圖1（A）顯示，大鼠睪丸組織PKA蛋白表達(dá)水平在前3周保持穩(wěn)定，與運(yùn)動(dòng)前相比未見(jiàn)顯著差異，后2周持續(xù)下降。與C0組相比，T4組PKA表達(dá)水平下降了50%（P＜0.01），與C5組相比亦有顯著差異（P＜0.01）。隨后T5組略有上升（P＞0.05）。C5與C0組間差異沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。如圖1（B）所示，經(jīng)過(guò)5周游泳訓(xùn)練之后，運(yùn)動(dòng)干預(yù)組大鼠第2周pCREB表達(dá)相較于第1周略有下降，隨后回升至訓(xùn)練前水平。第4周則出現(xiàn)顯著下降，與C0組相比，P＜0.05。第5周持續(xù)下降，與C0組相比，P＜0.05。C5組與C0組相比，略有升高，但組間差異沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。如圖1（C）所示，大鼠睪丸組織SF-1蛋白表達(dá)水平在前3周略有波動(dòng)（P＞0.05），在第4周SF-1表達(dá)水平下降了36%（P＜0.05），至第5周下降了43%（與C0相比，P＜0.01），與C5組相比亦有顯著差異（P＜0.01）。C5與C0組間差異沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.5 大鼠睪丸組織StAR和SF-1 mRNA變化情況

如圖2（A）所示，運(yùn)動(dòng)干預(yù)組StAR mRNA表達(dá)在第3周之后呈現(xiàn)出下降的態(tài)勢(shì)，但是與安靜組、前1周相比沒(méi)有顯著性。第5周mRNA表達(dá)與安靜組C0相比差異出現(xiàn)了顯著性（P＜0.05）。圖2（B）顯示，1周運(yùn)動(dòng)干預(yù)組SF-1 mRNA較C0組略有上升，差異沒(méi)有顯著性。隨后SF-1 mRNA表達(dá)逐漸下降，至第5周SF-1 mRNA表達(dá)出現(xiàn)極顯著下降（P＜0.01）。

3 分析與討論

3.1 5周間歇性亞極限強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)對(duì)血清睪酮的影響及其可能機(jī)制

大鼠游泳模型是最常見(jiàn)的構(gòu)建疲勞模型的方式之一，為保證運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度，通常采用負(fù)重的方式來(lái)增加大鼠運(yùn)動(dòng)量［1］。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，大鼠血清睪酮在5周間歇性亞極限強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)中出現(xiàn)如下時(shí)序性變化：在整個(gè)運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練過(guò)程中持續(xù)下降，并且在第4周降幅增加，到第5周降至對(duì)照組的30%左右。

圖1 各組大鼠PKA、pCREB和SF-1蛋白的相對(duì)表達(dá)Figure 1. Protein Expression Changes of PKA pCREB and SF-1 in Various Group

圖2 各組大鼠StAR和SF-1 mRNA相對(duì)表達(dá)Figure 2. Relative Expression Changes of StAR and SF-1 mRNA in Various Group

3.1.1 運(yùn)動(dòng)對(duì)StAR的影響

膽固醇是睪酮合成的重要前體物質(zhì)，合成睪酮必須要有充足的膽固醇做物質(zhì)基礎(chǔ)以滿(mǎn)足合成需要。膽固醇通過(guò)線粒體內(nèi)、外膜之間的水性環(huán)境轉(zhuǎn)運(yùn)至線粒體，最終是通過(guò)睪丸間質(zhì)細(xì)胞內(nèi)以StAR為代表的一系列轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白實(shí)現(xiàn)的。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果與以往結(jié)果［7］相似，長(zhǎng)期大強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)可以導(dǎo)致StAR mRNA表達(dá)下降。說(shuō)明隨著運(yùn)動(dòng)疲勞的逐步積累，StAR蛋白在轉(zhuǎn)錄層面受到抑制，進(jìn)而導(dǎo)致睪酮水平下降。

然而，結(jié)合睪酮變化特點(diǎn)可以發(fā)現(xiàn)，在睪酮下降初期，StAR mRNA表達(dá)并未發(fā)生顯著變化。這說(shuō)明StAR mRNA這一指標(biāo)反映機(jī)體膽固醇轉(zhuǎn)運(yùn)情況有明顯滯后性。有研究者［15］指出，睪酮水平與StAR mRNA在某些情況下并非完全正相關(guān)關(guān)系。除此之外，研究發(fā)現(xiàn)，StAR蛋白在轉(zhuǎn)錄后存在磷酸化修飾。2012年的一項(xiàng)研究指出，14-3-3γ蛋白會(huì)結(jié)合在StAR的脂質(zhì)結(jié)合域上，除了導(dǎo)致StAR無(wú)法正常變構(gòu)以結(jié)合膽固醇外，也會(huì)抑制StAR蛋白194號(hào)位上絲氨酸殘基磷酸化程度，導(dǎo)致StAR蛋白無(wú)法發(fā)揮其最大活力［17］。Duarte等研究者［20］通過(guò)細(xì)胞培養(yǎng)的方式證實(shí)，StAR攜帶膽固醇的能力與其磷酸化程度有關(guān)，在線粒體外膜磷酸化StAR可以使StAR在很短時(shí)間內(nèi)攜帶大量膽固醇。

盡管單一利用StAR mRNA來(lái)判斷機(jī)體膽固醇轉(zhuǎn)運(yùn)有一定的滯后性，但StAR mRNA仍是一項(xiàng)判斷膽固醇轉(zhuǎn)運(yùn)狀態(tài)的重要指標(biāo)，在本實(shí)驗(yàn)中， StAR mRNA下降說(shuō)明持續(xù)性高強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)導(dǎo)致了膽固醇轉(zhuǎn)運(yùn)發(fā)生了較為深刻的抑制。

3.1.2 運(yùn)動(dòng)對(duì)HPG軸的影響

睪丸間質(zhì)細(xì)胞合成分泌睪酮主要受LH的調(diào)節(jié)，LH通過(guò)活化腺苷酸環(huán)化酶，使胞內(nèi)cAMP水平升高，激活PKA，觸發(fā)胞內(nèi)級(jí)聯(lián)反應(yīng)，從而調(diào)節(jié)睪酮合成和分泌。由于運(yùn)動(dòng)干預(yù)方案不同，不同運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度、運(yùn)動(dòng)量對(duì)HPG軸不同環(huán)節(jié)神經(jīng)遞質(zhì)、信號(hào)通路和細(xì)胞因子的影響不同，導(dǎo)致了研究結(jié)果不一致。盡管具體研究結(jié)果各不相同，但是，綜合文獻(xiàn)可以得到以下結(jié)論，中等強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)可以維持GnRH、LH、FSH等調(diào)節(jié)激素的合成和釋放，而大強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)則會(huì)導(dǎo)致HPG軸負(fù)反饋調(diào)節(jié)機(jī)制失衡［14，23］。這也與本研究結(jié)果一致，實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，前4周LH水平出現(xiàn)了曲折下降的變化趨勢(shì)，直至第5周出現(xiàn)顯著下降，降幅高達(dá)41%。這或由于兩方面原因造成的：1）大強(qiáng)度訓(xùn)練可以引起GnRH受體自身調(diào)節(jié)發(fā)生紊亂［10］，造成LH反饋機(jī)制對(duì)GnRH應(yīng)答受抑制，這就導(dǎo)致了睪酮下降時(shí)，LH無(wú)法出現(xiàn)反饋性增加［28］。2）長(zhǎng)期大強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)會(huì)導(dǎo)致大鼠下丘腦內(nèi)質(zhì)網(wǎng)狹窄，不擴(kuò)張，神經(jīng)分泌顆粒數(shù)明顯減少［8］。另外，運(yùn)動(dòng)會(huì)導(dǎo)致下丘腦多巴胺、5羥色胺等單胺類(lèi)物質(zhì)更新率及釋放改變，從而抑制GnRH合成分泌。

3.1.3 運(yùn)動(dòng)對(duì)氧化應(yīng)激的影響

SOD是細(xì)胞內(nèi)一個(gè)重要抗氧化酶，具有清除細(xì)胞內(nèi)氧自由基，保護(hù)細(xì)胞的目的［3］。MDA是自由基攻擊生物膜形成脂質(zhì)過(guò)氧化物的產(chǎn)物，其含量可反映脂質(zhì)過(guò)氧化及細(xì)胞損傷程度。研究發(fā)現(xiàn)，長(zhǎng)期大強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)會(huì)引起機(jī)體各部位SOD和MDA水平產(chǎn)生顯著變化［6，11］。本研究發(fā)現(xiàn)，與安靜對(duì)照組相比，各運(yùn)動(dòng)干預(yù)組SOD值降低，MDA值升高，這種變化趨勢(shì)與其他研究者的研究結(jié)果相似［2］。機(jī)體內(nèi)大部分睪酮由睪丸間質(zhì)細(xì)胞合成和分泌，間質(zhì)細(xì)胞結(jié)構(gòu)的完整性對(duì)睪酮合成過(guò)程有著重要的影響，SOD和MDA這一組指標(biāo)綜合反映了睪丸間質(zhì)細(xì)胞氧化損傷程度。近來(lái)Korytowski等研究者［22］通過(guò)設(shè)計(jì)精妙的實(shí)驗(yàn)，證實(shí)在氧化應(yīng)激情況下，StAR蛋白會(huì)介導(dǎo)有害的脂質(zhì)過(guò)氧化物進(jìn)入線粒體內(nèi)部，對(duì)正常膽固醇轉(zhuǎn)運(yùn)造成了競(jìng)爭(zhēng)性抑制。因此，結(jié)合本研究中的SOD和MDA變化情況可以判定：經(jīng)過(guò)長(zhǎng)期大強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)，大鼠睪丸間質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生氧化應(yīng)激，引起間質(zhì)細(xì)胞活力下降，細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)完整性受破壞，膽固醇轉(zhuǎn)運(yùn)受限，這也是抑制睪酮合成和分泌的原因之一。

3.2 5周間歇性負(fù)重游泳訓(xùn)練導(dǎo)致StAR mRNA下降的可能機(jī)制

3.2.1 運(yùn)動(dòng)對(duì)PKA、p-CREB的影響

cAMP是細(xì)胞內(nèi)重要的第二信使之一，cAMP主要通過(guò)激活PKA來(lái)實(shí)現(xiàn)其生理功能。在睪酮合成調(diào)節(jié)方面，PKA被激活后變構(gòu)，釋放催化亞基，催化CREB磷酸化為p-CREB，在其他轉(zhuǎn)錄因子的協(xié)助下與StAR基因啟動(dòng)子相結(jié)合，對(duì)睪酮合成進(jìn)行調(diào)控。以往的研究主要集中在PKA、CREB轉(zhuǎn)導(dǎo)因子對(duì)突觸的可塑性及學(xué)習(xí)記憶功能的作用，近些年，也有研究者［4］開(kāi)始研究PKA、CREB等調(diào)控因子在心肌等其他組織中所起的作用。本研究則發(fā)現(xiàn)，大鼠睪丸組織中的PKA、pCREB蛋白表達(dá)水平在前3周較為穩(wěn)定，變化差異不大，然而，隨著大強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)時(shí)間的持續(xù)，后2周出現(xiàn)了顯著下降。Mayr等研究者［25］就指出，cAMP長(zhǎng)期激活會(huì)降低細(xì)胞對(duì)cAMP的敏感性，提高激活PKA的閾值，抑制PKA催化亞基的釋放能力，從而進(jìn)一步降低了CREB的磷酸化水平。除此之外，p-CREB除了受到PKA等蛋白的正向調(diào)節(jié)作用，還受到PP1和PP2A等蛋白磷酸酶的負(fù)向調(diào)控，這2種酶可以或直接或間接調(diào)節(jié)CREB的去磷酸化程度，抑制CREB的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)活性［18］。許紹哲等研究者［13］就發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過(guò)8周遞增負(fù)荷跑臺(tái)訓(xùn)練后，大鼠骨骼肌內(nèi)PP1水平顯著上升。由此，可以推測(cè)StAR mRNA表達(dá)下降與其上游調(diào)控因子磷酸化水平有關(guān)。

3.2.2 運(yùn)動(dòng)對(duì)SF-1的影響

SF-1是一個(gè)調(diào)控生長(zhǎng)生殖過(guò)程的關(guān)鍵調(diào)控因子，尤其是在調(diào)控StAR等蛋白方面有著其獨(dú)特的作用。早在1997年，就有研究人員通過(guò)實(shí)驗(yàn)證實(shí)，只有在SF-1參與下才能使StAR啟動(dòng)子達(dá)到最大活力［27］。隨后，Clavia等研究者［24］發(fā)現(xiàn)，SF-1對(duì)于維持StAR基因基本功能而言也非常重要，并且SF-1與StAR結(jié)合后會(huì)影響其他蛋白與StAR啟動(dòng)子CAN區(qū)的結(jié)合。同樣的，Mizutani等研究者［26］也發(fā)現(xiàn)，SF-1是StAR上游的一個(gè)關(guān)鍵調(diào)控因子，SF-1與StAR結(jié)合之后，驅(qū)逐組蛋白，引起染色質(zhì)變構(gòu)，并且以SF-1依賴(lài)的方式誘導(dǎo)StAR開(kāi)始轉(zhuǎn)錄。本實(shí)驗(yàn)研究了SF-1在5周間歇性負(fù)重游泳中的變化特點(diǎn)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與PKA、pCREB等調(diào)控因子變化特點(diǎn)一致，通過(guò)Western Blot檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，SF-1前3周表達(dá)并無(wú)顯著變化，而后2周則出現(xiàn)了顯著降低。通過(guò)RT-PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，SF-1 mRNA直到第5周才出現(xiàn)顯著下降。以往就運(yùn)動(dòng)對(duì)SF-1的影響這方面的研究較少，然而，不乏研究者對(duì)SF-1在睪酮合成過(guò)程中的作用進(jìn)行了有益探索。任毅等研究者［9］發(fā)現(xiàn)，電針治療可以提高中老年雄激素缺乏癥大鼠睪酮水平，改善間質(zhì)細(xì)胞病理表現(xiàn)，推測(cè)SF-1表達(dá)提高，是促進(jìn)睪酮分泌的機(jī)制之一。Hu等研究者［21］發(fā)現(xiàn)，在鄰苯二甲酸二丁酯所導(dǎo)致的類(lèi)固醇合成受抑制的環(huán)境中，SF-1可以調(diào)控StAR以促進(jìn)睪酮合成。探索SF-1在運(yùn)動(dòng)干預(yù)后期所出現(xiàn)下降的原因，一方面固然與其信號(hào)通路上游因子下降有關(guān)，另一方面，SF-1自身也會(huì)受到其他蛋白的影響。李德鋒等研究者［5］構(gòu)建了大鼠4周跑臺(tái)模型（20 m/min，10°），結(jié)果發(fā)現(xiàn)，4周跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)引起了大鼠睪丸組織TGF-β1表達(dá)顯著增加。Derebecka-Holysz等學(xué)者［19］則提出，TGF-β1可以降低SF-1表達(dá)水平，從而降低其轉(zhuǎn)錄活性。由此我們的推論是，在5周間歇性負(fù)重游泳后期，由于運(yùn)動(dòng)量的積累和機(jī)體代謝產(chǎn)物增加等多種因素，導(dǎo)致睪丸組織間質(zhì)細(xì)胞TGF-β1表達(dá)增加，進(jìn)而引起SF-1表達(dá)下降。除此之外，Aesoy等研究人員［16］發(fā)現(xiàn)，PKA可以通過(guò)增強(qiáng)SF-1蛋白穩(wěn)定性以提高SF-1表達(dá)水平。這也從另一方面解釋SF-1在蛋白和基因水平出現(xiàn)差異的原因，即由于長(zhǎng)時(shí)間運(yùn)動(dòng)導(dǎo)致PKA表達(dá)下降，進(jìn)而增加了SF-1蛋白的降解速率。因此，通過(guò)WB技術(shù)檢測(cè)出SF-1蛋白在第4周就出現(xiàn)下降，但mRNA表達(dá)則在最后1周才出現(xiàn)顯著下降。

4 結(jié)論

5周亞極限強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)引起大鼠睪丸間質(zhì)細(xì)胞內(nèi)StAR及其相關(guān)調(diào)控因子PKA、pCREB、SF-1等表達(dá)下降，進(jìn)而引起膽固醇轉(zhuǎn)運(yùn)受限，這可能是導(dǎo)致睪酮合成和血液睪酮水平下降的原因之一。

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Sequential Changes of StAR Protein and Its Regulatory Factors in Testicular Tissue of Rats during 5-week sub-ultimate Intensity Exercise

TANG Kun1，2，ZHANG Li1

Objective：To explore the possible mechanism of 5-week intermittent sub-ultimate intensity exercise induced low serum testosterone in rats. Methods：The rats in the exercise group

weight bearing training sessions. Each session consisted of fi ve 4-minute weight bearing （6% body weight） swimming separated by 90-second intervals. Training sessions were given twice a day and six days a week. The length of experiment was set to be 1，2，3，4 and 5 weeks. 48 hours after the last training session，rats from each groups were sampled in order to analyze protein and gene mRNA changes of StAR，PKA，pCREB，SF-1. Results：1） The serum testosterone level in intervention group decreased at a signi fi cant rate in the last two weeks，the serum testosterone level in the fi fth group decreased by 70% compared to control group（P＜0.01）. 2） The expression of StAR mRNA in the fi fth week was signi fi cantly di ff erent than the control group （P＜0.05）.3） The expression of PKA，pCREB，SF-1 protein and SF-1 mRNA in testis decreased signi fi cantly in the last two weeks.（P＜0.05）. Conclusion：StAR and its associated regulators PKA，pCREB，SF-1 in testicular leydig cells declined after 5-week intermittent sub-ultimate intensity exercise，thus mitochondrial cholesterol transfer limitation might be one of the mechanisms of decline in testosterone synthesis and serum testosterone.

exercise-induced low serum testosterone；sub-ultimate intensity exercise；StAR；time sequence；rat

G804.7

A

1002-9826（2017）06-0095-06

10. 16470/j. csst. 201706012

2017-02-20；

2017-09-05

國(guó)家體育總局體育科學(xué)研究所基本科研業(yè)務(wù)經(jīng)費(fèi)資助項(xiàng)目（基本16-28）。

湯昆，男，碩士，主要研究方向?yàn)檫\(yùn)動(dòng)生理生化，Tel：（0519）81281290， E-mail：tangkun0103@126.com。

張漓，男，研究員，博士，碩士研究生導(dǎo)師，主要研究方向?yàn)樯砩?xùn)練監(jiān)控、減肥機(jī)制與運(yùn)動(dòng)及營(yíng)養(yǎng)處方，Tel:（010）87182532 ，E-mail: zhangli@ciss.cn。

1. 國(guó)家體育總局體育科學(xué)研究所，北京 100061；2. 常州市體育醫(yī)療科研所，江蘇 常州 213001 1. China Institute of Sport Science，Beijing 100061， China；2. Changzhou Research Institute of Science and Medical Treatment，Changzhou 213001，China.