向采芹，李希,，馮建安，黃嫣

·品種品質(zhì)·

HPLC雙波長(zhǎng)切換同時(shí)測(cè)定玄參藥材中哈巴苷和哈巴俄苷的含量

向采芹1，李希1,2，馮建安2，黃嫣2

目的：建立以雙波長(zhǎng)切換方式同時(shí)測(cè)定玄參藥材中哈巴苷和哈巴俄苷的含量的方法。方法：采用ShimpackVP-ODS C18柱（250 mm×4.6，5 μm）色譜柱，以乙腈(A)-磷酸（0.03%）(B)為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫：0-10 min，3%-10%(A)；10-20 min，10%-33%(A)；20-25 min，33%-50%(A)；25-30 min，50%-80%(A)；30-35 min，80%(A)；35-37 min，80%-3%(A)；檢測(cè)波長(zhǎng)：前10 min為278 nm，10-15 min為210 nm,15 min后為278 nm，柱溫為30 ℃，進(jìn)樣量為10 μL，流速為1 mL?min-1。結(jié)果：哈巴苷在0.011824-0.11824 mg?mL-1范圍內(nèi)與哈巴俄苷在0.00416-0.0416 mg?mL-1范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。結(jié)論：該檢測(cè)方法穩(wěn)定可行 ，可用于同時(shí)測(cè)定玄參藥材中哈巴苷和哈巴俄苷的含量。

HPLC雙波長(zhǎng)切換；玄參藥材；哈巴苷；哈巴俄苷；含量測(cè)定

玄參是玄參科(Scrophulariace)玄參屬(Scrophularia)玄參（Scrophularia,ningpoensisHemsl）的干燥根。主要功效是清熱涼血，滋陰降火，補(bǔ)腎益氣[1]?！侗静菥V目》中提到“腎水受傷，真陰失守，孤陽(yáng)無(wú)根，發(fā)為火病，法宜壯水以制火，故玄參與地黃同功。其消瘰疬亦是散火，劉守真言結(jié)核是火病”[2]。玄參含環(huán)烯醚萜、苯丙素、微量揮發(fā)油、植物甾醇、油酸、亞麻酸、糖類、左旋天冬酰胺及生物堿等多種化學(xué)成分。具有保護(hù)心血管系統(tǒng)，增強(qiáng)免疫力等藥理活性[3]。同時(shí)還具有解熱，鎮(zhèn)痛，抗炎，抗腫瘤的藥理作用[4]。本文對(duì)玄參的主要成分哈巴苷和哈巴俄苷進(jìn)行波長(zhǎng)轉(zhuǎn)換法同時(shí)測(cè)定，對(duì)15版藥典將兩個(gè)成分分開測(cè)定進(jìn)行改進(jìn)，使得測(cè)定方法更加高效簡(jiǎn)便。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Agilent-1260 高效液相色譜儀 ( 美國(guó)安捷倫科技有限公司)；KQ-300DE 型數(shù)控超聲波清洗器 ( 昆山市超聲儀器有限公司)；BT-125D 型電子天平 ( 賽多利斯科學(xué)儀器北京有限公司)；LK-1000A500搖擺式高速中藥粉碎機(jī) ( 浙江溫嶺市創(chuàng)力藥材器械廠制造)。

1.2 藥品

玄參藥材（四川省中藥飲片有限責(zé)任公司），哈巴苷對(duì)照品（成都瑞芬思生物科技有限公司，批號(hào)H-021-150729），哈巴俄苷對(duì)照品（中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)111730-201508）。

1.3 試劑

乙腈、磷酸為色譜純(美國(guó) Fisher 公司)；甲醇為分析純，水為超純水 ( 實(shí)驗(yàn)室自制) 。

2 試驗(yàn)方法與結(jié)果

2.1 對(duì)照品的制備

取哈巴苷對(duì)照品，哈巴俄苷對(duì)照品適量，精密稱定，加入30%的甲醇制成每1 mL含哈巴苷60 μg，哈巴俄苷20 μg的混合對(duì)照品溶液。

2.2 玄參藥材溶液的制備

取玄參藥材粉末0.5 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入50%甲醇溶液50 mL，密塞，稱定重量，浸泡一小時(shí)，超聲處理（功率500 w，頻率40 KHZ）45 min，放冷，再稱定重量，用50%甲醇補(bǔ)足失重，搖勻，0.45 μm微孔濾膜過濾，取續(xù)濾液，即得。

2.3 色譜條件的確定

本文經(jīng)過文獻(xiàn)查閱[5-7]，經(jīng)過實(shí)驗(yàn)對(duì)比，最終確定的色譜條件為：AgiLent 1260型高效液相色譜儀，DAD二極管陣列檢測(cè)器，采用Shim-packVP-ODS C18柱（250 mm×4.6，5 μm）色譜柱，以乙腈(A)-磷酸（0.03%）(B)為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫：0-10 min，3%-10%(A)；10-20 min，10%-33%(A)；20-25 min，33%-50%(A)；25-30 min，50%-80%(A)；30-35min，80%(A)；35-37 min，80%-3%(A)[1]；檢測(cè)波長(zhǎng)：前10 min為278 nm，10-15 min為210 nm，15 min后為278 nm，柱溫為30 ℃，進(jìn)樣量為10 μL，流速為1 mL?min-1。

2.4 系統(tǒng)適應(yīng)性試驗(yàn)

在上述色譜條件下，按藥典規(guī)定，理論塔板數(shù)按哈巴苷與哈巴俄苷峰計(jì)算不低于5 000，分離度均大于1.5，對(duì)稱因子分別為0.9和0.7，其對(duì)照品及供試品色譜圖見圖1。

圖1 哈巴苷和哈巴俄苷混合對(duì)照(A)和玄參對(duì)照藥材(B)HPLC圖

2.5 線性關(guān)系的考察

分別精密吸取哈巴苷（0.05912 mg?mL-1）對(duì)照品溶液2、4、6、8、10、20 μL及哈巴俄苷（0.0208 mg?mL-1）2、4、6、8、10、20 μL注入高效液相色譜儀，記錄兩個(gè)對(duì)照品的含量與峰面積，以哈巴苷和哈巴俄苷的含量為橫坐標(biāo)（X）（μg），以相應(yīng)的峰面積為縱坐標(biāo)(Y)，得回歸方程：哈巴苷：Y = 7002.1X + 1.0837，R2= 0.9999，哈巴俄苷Y = 19827X + 0.9007，R2= 0.9999，表明哈巴苷在0.011824-0.11824 mg?mL-1范圍內(nèi)與哈巴俄苷在0.00416-0.0416 mg?mL-1范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.6 精密度實(shí)驗(yàn)

精密量取所配制的哈巴苷與哈巴俄苷混合對(duì)照品，按照“2.3”項(xiàng)下的色譜條件進(jìn)行連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄峰面積，結(jié)果顯示哈巴苷和哈巴俄苷峰面積的RSD值分別為0.85%、1.01%，結(jié)果表明儀器精密度良好。

2.7 重復(fù)性實(shí)驗(yàn)

取同一批玄參藥材，按照“2.2”項(xiàng)下的玄參藥材供試品溶液制備方法制得6份供試品溶液，按照“2.3”項(xiàng)下的色譜條件進(jìn)行6次實(shí)驗(yàn)，記錄峰面積，結(jié)果顯示哈巴苷和哈巴俄苷峰面積的RSD值分別為1.23%、1.58%，結(jié)果表明該方法重復(fù)性良好。

2.8 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取同一批玄參藥材，按照“2.2”項(xiàng)下的玄參藥材供試品溶液制備方法制得1份供試品溶液，分別在2、4、8、10、12、24 h按照“2.3”項(xiàng)下的色譜條件進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，記錄峰面積，結(jié)果顯示哈巴苷和哈巴俄苷峰面積的RSD值分別為0.96%、1.23%，結(jié)果表明供試品在24h內(nèi)穩(wěn)定。

2.9 樣品測(cè)定

取同一批玄參藥材，按照“2.2”項(xiàng)下的玄參藥材供試品溶液制備方法制得玄參藥材供試品溶液，按照“2.3”項(xiàng)下的色譜條件進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，測(cè)得的玄參藥材中哈巴苷和哈巴俄苷的含量分別為0.1888 μg、0.5046 μg，哈巴苷與哈巴俄苷的總量經(jīng)計(jì)算為0.68%＞0.45%，符合藥典規(guī)定。

2.10 耐用性實(shí)驗(yàn)

取同一批樣品，按藥材供試品溶液的制備方法制成供試品溶液，使用不同品牌色譜柱（分別為Shim-pack VP-ODS柱（250×4.6 mm，5 μm）;AgiLent ZORBAX SB C18（4.6×150 mm，5 μm），進(jìn)行耐用性試驗(yàn)，結(jié)果哈巴苷的含量分別為0.1865、0.1874 μg，哈巴俄苷的含量分別為0.4899、0.5012 μg。結(jié)果表明此方法可行。

3 討論

在制備玄參藥材供試品溶液之前考察玄參藥材粉末的粒度，最終確定藥材粉末能通過2號(hào)篩的進(jìn)行試驗(yàn)。在玄參藥材供試品溶液制備過程中考察藥材的浸泡時(shí)間、超聲提取時(shí)間以及提取方式，最終確定的為浸泡1 h，超聲45 min。選擇色譜條件時(shí)，考察前15 min均以210 nm的波長(zhǎng)進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在藥材高效液相色譜圖中出現(xiàn)較多雜峰，分離度不夠，因此在前10min選擇278 nm以排除較多的雜峰，在10-15 min內(nèi)采用210 nm較好的分離出目標(biāo)峰，同時(shí)選用不同的分離柱考察此方法的耐用性，結(jié)果表明此方法穩(wěn)定可行。本文主要通過HPLC波長(zhǎng)切換的方法更加快速簡(jiǎn)便高效的同時(shí)測(cè)定玄參藥材中哈巴苷和哈巴俄苷的含量，解決藥典中兩種成分需進(jìn)行兩次試驗(yàn)的繁瑣，同時(shí)采用波長(zhǎng)切換的方法除去供試樣品中目標(biāo)峰前后不必要的雜峰，使目標(biāo)峰達(dá)到很好的分離效果，且保持峰面積穩(wěn)定?？梢杂糜谛⑺幉牡暮繙y(cè)定方法，對(duì)其含玄參的復(fù)方制劑提供了更加穩(wěn)定可行且簡(jiǎn)便的方法，因此，在實(shí)際操作中具有重大意義。

[1] 國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典（一部）[S].北京∶ 中國(guó)醫(yī)藥科技出版社,2015.

[2] 李時(shí)珍.《本草綱目》∶中國(guó)言實(shí)出版社,2012年版.

[3] 許福泉,許旭東,陳士林. 玄參化學(xué)成分及藥理活性研究進(jìn)展[J].中國(guó)現(xiàn)代中藥,2013,(09)∶752-759.

[4] 白宇.玄參的藥味藥理學(xué)初步研究[D].黑龍江中醫(yī)藥大學(xué),2014.

[5] 梁晨,徐思思,聶詩(shī)明. HPLC法測(cè)定不同產(chǎn)地微波真空干燥玄參中哈巴苷和哈巴俄苷的含量[J]. 數(shù)理醫(yī)藥學(xué)雜志,2012,(06)∶688-690.

[6] 曹崗,叢曉東,蔡皓,等. HPLC-DAD法同時(shí)測(cè)定玄參炮制前后8個(gè)有效成分的含量[J]. 中國(guó)天然藥物,2012,(03)∶213-217.

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Simultaneous detection of the contents of harpagide and harpagoside in Xuanshen by Dual-wave switching HPLC

/XIANG Cai-qin1, LI Xi1,2, FENG Jian-an2, HUANG Yan2//(1.School of Pharmacy, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine; Key Laboratory of Standardization for Chinese Herbal Medicine, Ministry of Education; National Key Laboratory Breeding Base of Systematic Research, Development and Utilization of Chinese Medicine Resources, Chengdu 611137, Sichuan;2.Sichuan Academy of Traditional Chinese Medicine sciences, Institute of TCM, Chengdu 610031, Sichuan)

Objective:To establish Dual-wave switching HPLC method to detect the contents of harpagide and harpagoside in Xuanshen.Method:The analysis was carried on a Shim-packVP-ODS C18(250×4.6 mm，5μm) column. The mobile was acetonitrile(A) and 0.3% Phosphoric Acid (B) which was in gradient elution at fl ow rate of 1mL?min-1as following∶ 0～10min, 3%～10% (A);10～20 min, 10%～33% (A); 20～25 min, 33%～50% (A); 25～30 min, 50%～80% (A); 30～35 min, 80% (A); 35～37min, 80%～83% (A).The wave length was set at 278 nm during 0～10 min；210 nm during 10 ～15 min；278 nm after 15 min. Column temperature was 30℃, and sample volume was 10 μL.Result:The response of harpagide in the range of 0.011824-0.11824 mg?mL-1and the response of harpagoside in the range of 0.00416-0.0416 mg?mL-1had a good linear relationship with concentration.Conclusion:The detection method is stable and feasible, which can be used for simultaneous determination the contents of harpagide and harpagoside in Xuanshen.

Dual-wave switching HPLC; Xuanshen; harpagide; harpagoside; content determination

R 282.6

A

1674-926X(2017)06-003-03

1. 成都中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院 中藥材標(biāo)準(zhǔn)化教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 四川省中藥資源系統(tǒng)研究與開發(fā)利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室省部共建國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育基地，四川 成都 6111372；2. 四川省中醫(yī)藥科學(xué)院中醫(yī)研究所，四川 成都 610031

向采芹(1992-)，女，碩士研究生，研究方向：中藥新劑型，新技術(shù)，新工藝的研究Email∶742426178@qq.com

李希(1969-)，女，碩士，教授，研究方向：中藥新劑型，新技術(shù)，新工藝的研究Email∶1836820767@qq.com

2017-07-21

（責(zé)任編輯：胡慧玲）