于海波

（徐州市食品藥品監(jiān)督檢驗中心，江蘇 徐州 221006）

用UPLC 法測定銀黃含片中8種活性成分含量的效果研究

于海波

（徐州市食品藥品監(jiān)督檢驗中心，江蘇 徐州 221006）

目的：研究用UPLC法測定銀黃含片中8種活性成分含量的效果，以期為該藥的質(zhì)量控制研究提供參考依據(jù)。方法：采用UPLC法對銀黃含片中綠原酸、咖啡酸、木犀草苷、黃芩苷、木犀草素、漢黃芩苷、黃芩素、漢黃芩素的含量進(jìn)行測定。結(jié)果：銀黃含片中8種活性成分的線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)均＞0.9997，加樣回收率均在97.3%～102.0%之間，RSD均小于1.2%。結(jié)論：用UPLC法測定銀黃含片中8種活性成分含量的效果好?？刹捎迷摲椒▽︺y黃含片進(jìn)行全面、有效的質(zhì)量控制。

超高效液相；銀黃含片；活性成分；含量測定

銀黃含片收載于《國家藥品標(biāo)準(zhǔn)》新藥轉(zhuǎn)正第16～第26冊。該藥是由金銀花和黃芩的提取物制備而成的。臨床上主要用該藥治療由外感風(fēng)熱、肺胃熱盛所致的咽干、喉痛、急慢性扁桃體炎、急慢性咽炎及上呼吸道感染等病癥[1]。有研究結(jié)果顯示，金銀花中含有的酚酸類及黃酮類化合物（如綠原酸、咖啡酸、木犀草素、木犀草苷等）是銀黃含片中的主要活性成分[2]。黃芩中含有的黃酮類化合物（如黃芩苷、黃芩素、漢黃芩苷、漢黃芩素等）是銀黃含片產(chǎn)生藥效的主要成分[3]。現(xiàn)行的銀黃含片質(zhì)量控制方法（采用HPLC法對銀黃含片中一類或幾類成分的含量進(jìn)行測定）僅可對其中的綠原酸和黃芩苷進(jìn)行含量測定及質(zhì)量控制，所得的結(jié)果比較單一，故難以全面地評估該藥的整體質(zhì)量[4-8]。在本次研究中，筆者采用UPLC法對銀黃含片中8種活性成分（包括綠原酸、咖啡酸、木犀草苷、黃芩苷、木犀草素、漢黃芩苷、黃芩素、漢黃芩素）的含量進(jìn)行測定，以期為銀黃含片的質(zhì)量控制研究提供科學(xué)的參考依據(jù)。

1 儀器與試劑

1）儀器：Waters UPLC H-class超高效液相色譜儀（生產(chǎn)廠家：美國Waters公司）、XS205電子天平（精度：十萬分之一，生產(chǎn)廠家：瑞士梅特勒-托利多公司）。2）試劑：綠原酸、咖啡酸、木犀草苷、黃芩苷、木犀草素、漢黃芩苷、黃芩素、漢黃芩素的對照品均購自中國藥品生物制品檢定所，其純度均≥98.0%。銀黃含片（含5個批次）均購自藥店，其生產(chǎn)廠家分別為成都地奧制藥集團(tuán)有限公司（A、B批次）、上海信宜天平藥業(yè)有限公司（C、D批次）、魯南厚普制藥有限公司（E批次）。其中，使用A批次的銀黃含片進(jìn)行方法學(xué)研究。色譜純?yōu)橐译妗⒓状?。分析純?yōu)榧姿?、乙酸。實驗用水為純化水。其他試劑均為分析純?/p>

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色 譜 柱：ACQUITY UPLC BEH C18柱（50 mm×2.1 mm，1.7 μm）。流動相：乙腈（A）-0.1%甲酸水溶液（B）。梯度洗脫：A：0～ 1.5 min，15%；1.5～ 2.7 min，15% ～ 22%；2.7～ 4.0 min，22% ～ 30%；4.0～ 5.2 min，30%～40%；5.2～8.0 min，40%～55%；8.0～10.0 min，45% ～ 55%。 流速 ：0.4 ml·min-1。 柱溫 ：30℃。檢測波長：320 nm。進(jìn)樣量：5 μL。

2.2 供試品溶液的制備方法

取銀黃含片，將其研成細(xì)粉。精密稱取0.5 g的銀黃含片細(xì)粉，將其置于50 ml的量瓶中，然后向量瓶中加入40 ml濃度為50%的甲醇。用超聲對該混合溶液進(jìn)行30 min的提取后，將提取液放冷，用濃度為50%的甲醇將其稀釋至刻度后搖勻、濾過，將續(xù)濾液在進(jìn)樣前用0.22 μm的微孔濾膜進(jìn)行過濾，得到供試品溶液。

2.3 對照品儲備液的制備方法

精密稱取適量的綠原酸、咖啡酸、木犀草苷、黃芩苷、木犀草素、漢黃芩苷、黃芩素、漢黃芩素對照品。用甲醇將上述的對照品配制成濃度為 1 mg·mL-1的對照品儲備液，然后將該儲備液放入4 ℃的冰箱中保存。

2.4 進(jìn)行系統(tǒng)適用性試驗

分別準(zhǔn)確稱取2.3中的8種對照品儲備液，用甲醇對其進(jìn)行稀釋，得到含綠原酸、咖啡酸、木犀草苷、黃芩苷、木犀草素、漢黃芩苷、黃芩素、漢黃芩素的混合對照品溶液。這8種混合對照品溶液的濃度分別為10.00μg/ml、10.00μg/ml、20.00μg/ml、100.00μg/ml、10.00μg/ml、20.00μg/ml、20.00μg/ml、10.00 μg/ml。分別取混合對照品溶液、供試品溶液，按照2.1中的色譜條件對其進(jìn)行分析，得到銀黃含片中8種活性成分混合對照品、供試品的色譜圖（見圖1）。銀黃含片樣品中8種被檢測成分的峰與相鄰峰的分離度R＞1.5，理論板數(shù)均＞5000。

圖1 銀黃含片中8種活性成分的UPLC色譜圖

2.5 進(jìn)行線性關(guān)系考察

精密吸取2.3中的對照品儲備液，將其逐級稀釋成不同濃度的對照品溶液，對這些溶液進(jìn)行進(jìn)樣測定。以濃度x（μg/ml）對峰面積y進(jìn)行線性回歸分析，按2.1的條件進(jìn)行測定。結(jié)果表明，銀黃含片中的8種活性成分具有良好的線性關(guān)系。詳見表1。

表1 銀黃含片中8種活性成分的線性回歸方程、相關(guān)系數(shù)和線性范圍 （n=3）

2.6 進(jìn)行精密度試驗

精密吸取同一批次銀黃含片的供試品溶液5 μl，連續(xù)進(jìn)樣6次，計算其峰面積的RSD（n=6）。計算結(jié)果顯示，綠原酸、咖啡酸、木犀草苷、黃芩苷、木犀草素、漢黃芩苷、黃芩素、漢黃芩素峰面積的RSD分別為0.55%、0.21%、0.37%、0.29%、0.41%、0.82%、0.33%、0.70%。這一計算結(jié)果表明，本次試驗所用儀器的精密度良好。

2.7 進(jìn)行重復(fù)性試驗

按2.2中的方法制備6份供試品溶液，按2.1中的色譜條件對這6份供試品溶液進(jìn)行測定。結(jié)果顯示，這6分供試品溶液中綠原酸、咖啡酸、木犀草苷、黃芩苷、木犀草素、漢黃芩苷、黃芩素、漢黃芩素的平均含量分別為2.135、0.116、0.527、21.365、3.657、0.521、0.436、0.098 mg/g， 其 RSD分別為0.87%、1.10%、0.63%、0.58%、1.20%、0.81%、1.13%、1.42%。這一測定結(jié)果表明，本次試驗所用方法的重復(fù)性良好。

2.8 進(jìn)行穩(wěn)定性試驗

精密稱取0.5 g的銀黃含片細(xì)粉，按2.2中的方法制備供試品溶液，再按2.1中的色譜條件分別在0 h、4 h、8 h、12 h、24 h對該供試品溶液進(jìn)行進(jìn)樣5 μl測定。 結(jié)果顯示，該供試品溶液中綠原酸、咖啡酸、木犀草苷、黃芩苷、木犀草素、漢黃芩苷、黃芩素、漢黃芩素峰面積的RSD分別為1.11%、1.06%、0.96%、0.32%、1.27%、0.47%、1.05%、1.11%。這一測定結(jié)果表明，該供試品溶液在室溫條件下放置24 h的穩(wěn)定性良好。

2.9 進(jìn)行加樣回收率試驗

取9份已知含量的銀黃含片細(xì)粉，每份的重量均為0.25 g。在這9份銀黃含片細(xì)粉中分別加入適量的對照品溶液，按2.2中的方法將其制備成供試品溶液，然后按2.1中的色譜條件對新制備的供試品溶液進(jìn)行進(jìn)樣分析，并計算其加樣回收率。詳見表2。

2.10 進(jìn)行樣品含量測定

分別精密稱取由不同廠家生產(chǎn)的5個批次的銀黃含片細(xì)粉0.5 g，按2.2中的方法制備供試品溶液，并對該供試品溶液進(jìn)行測定。具體的測定結(jié)果見表3。從該測定結(jié)果可以看出，不同廠家生產(chǎn)的銀黃含片中8種活性成分含量的差異較大。同一廠家生產(chǎn)的不同批次銀黃含片中8種活性成分的含量也存在差異。對銀黃含片中的單一成分進(jìn)行質(zhì)量控制無法全面地反映該藥品整體的質(zhì)量。這一測定結(jié)果提示對中藥制劑進(jìn)行多組分質(zhì)量控制的必要性。

表2 對銀黃含片中8種活性成分進(jìn)行加樣回收率試驗的結(jié)果

表3 對5個批次銀黃含片中8種活性成分含量進(jìn)行測定的結(jié)果 （mg/g，mean±S，n=3）

3 討論

在進(jìn)行本次試驗前，筆者參考了相關(guān)的文獻(xiàn)，并對乙腈、甲醇兩種洗脫劑進(jìn)行對比后認(rèn)為，乙腈的峰形更好、分離效率更高。在乙腈中加入少量的甲酸可有效改善色譜的峰形。因此，將本次試驗的流動相組成確定為乙腈（A）和0.1%甲酸水（B）溶液。同時，通過對梯度洗脫程序進(jìn)行優(yōu)化，將最終的洗脫程序確定為A：0～1.5 min，15%；1.5～2.7 min，15%～22%；2.7～4.0 min，22%～30%；4.0～5.2 min，30%～40%；5.2～8.0 min，40%～55%；8.0～10.0 min，45%～55%。

在進(jìn)行本次試驗的過程中，筆者利用二極管陣列檢測器在190～400 nm的波長范圍內(nèi)對銀黃含片中的8種活性成分進(jìn)行紫外光譜掃描。結(jié)果表明，綠原酸、咖啡酸在320 nm波長時的吸收最大，木犀草苷和木犀草素在350 nm波長時的吸收最大，黃芩苷和漢黃芩苷在275 nm、320 nm波長處均有吸收峰，黃芩素和漢黃芩素在275nm波長處均有最大吸收、在320 nm波長處均有肩峰。因此，為了確保每種活性成分均有較好的響應(yīng)，本次試驗選擇320 nm波長作為檢測波長。

綜上所述，用UPLC法測定銀黃含片中8種活性成分含量的效果理想，而且具有操作簡便、快速、分離效果好等優(yōu)點?？刹捎迷摲椒▽︺y黃含片進(jìn)行全面、有效的質(zhì)量控制。

[1]國家藥典委員會.國家藥品標(biāo)準(zhǔn)(新藥轉(zhuǎn)正標(biāo)準(zhǔn)第64冊)[M].北京:人民衛(wèi)生出版社,2008:96-97.

[2]李小芩,孫曉紅,蔡爽,等.采用UPLC-ESI-MS/MS以及主成分聚類分析研究不同品種金銀花的化學(xué)成分及其差異[J].藥學(xué)學(xué)報,2009,44(8):895-904.

[3]HAN J, YE M, XU M,et al.Characterization of flavonoids in the traditional Chinese herbal medicine-Huangqin by liquid chro matography coupled with electrospray ionization mass spectr ometry [J].J Chromatogr B,2007,848:355-362.

[4]張建偉,趙倩,何希榮,等.UPLC測定銀黃顆粒中綠原酸、咖啡酸、黃芩苷、漢黃芩苷、黃芩素和漢黃芩素6種成分[J].中國實驗方劑學(xué)雜志,2014,20(18):50-53.

[5]王榮梅,徐麗華,林永強(qiáng).HPLC法同時測定銀黃含片中6個咖啡?？鼘幩犷惓煞值暮?藥物分析雜志,2012,32(1):57-60.

[6]楊靜.對銀黃含片中四種活性成分含量同時測定方法的研究[J].當(dāng)代醫(yī)藥論叢,2014,21(19):53-55.

[7]張婷,美爾哈巴·熱西提,林瀟,等.HPLC-MS/MS法測定銀黃顆粒中綠原酸和黃芩苷[J]. 中草藥,2012,43(4):711-713.

[8]劉永利,李冬梅,馮麗,等.RP-HPLC同時測定銀黃膠囊中綠原酸與黃芩苷含量[J].中成藥,2006,28(8):1142.

Determination of eight components in Yinhuang buccal tablets by UPLC

YU Hai-bo1
（Xuzhou Institute for Food and Drug Control, Xuzhou 221006, China）

Objective To study determination of eight active constituents in Yinhuang buccal tablets by UPLC. Methods To determine contents of chlorogenic,caffeic acid, galuteolin , baicalin, luteolin ,wogonoside, baicalein ,wogonin in Yinhuang buccal with UPLC . Results The 8 active constituents in Yinhuang are on good terms, correlation coefficient are all less than 0.9997, average recovery are all between 97.3%～102.0%,RSD are all lower than 1.2% . Conclusion The effect of determinate active constituents with UPLC is good, and we can control quality of Yinhuang buccal tablets with UPLC,.

UPLC ；Yinhuang buccal tablet；active constituents ；Content determination

R284.1

B

2095-7629-（2017）19-0173-03

徐州市科技計劃項目（XF11C039）

于海波，E-mail：yuhaibobo@sohu.com