羅 磊，董金龍，朱文學(xué)*，薛依涵，關(guān)寧寧，張 寬，姬青華

金銀花過氧化物酶的三相分離純化及酶學(xué)性質(zhì)

羅 磊，董金龍，朱文學(xué)*，薛依涵，關(guān)寧寧，張 寬，姬青華

（河南科技大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，河南 洛陽 471023）

采用三相分離法提取純化金銀花中過氧化物酶，結(jié)果表明最優(yōu)純化條件為pH 5.60、硫酸銨質(zhì)量濃度39.49 g/100 mL、提取液與叔丁醇體積比1∶1.38，在該條件下純化倍數(shù)為5.849，回收率為87.64%。金銀花過氧化物酶比活力為1 021.6 U/mg，色素清除率為92%；酶學(xué)性質(zhì)研究表明：金銀花過氧化物酶最適溫度為30 ℃，熱穩(wěn)定范圍為10～40 ℃；最適pH值為5，pH值穩(wěn)定范圍為4～7。在金銀花過氧化物酶催化的雙底物酶促反應(yīng)中，當(dāng)H2O2濃度一定時，酶對愈創(chuàng)木酚的Km值為8.12 mmol/L，vmax值為1.71 mmol/（min·L）。當(dāng)愈創(chuàng)木酚濃度一定時，H2O2的Km值為0.822 mmol/L，vmax值為1.38 mmol/（min·L）。金銀花過氧化物酶與底物的親和力由強到弱依次是鄰苯三酚、鄰苯二酚、聯(lián)甲氧基苯胺、愈創(chuàng)木酚。Ca2＋、Cu2＋、Zn2＋對金銀花過氧化物酶有激活作用，Mg2＋、Mn2＋、檸檬酸、抗壞血酸、L-半胱氨酸、亞硫酸鈉、偏重亞硫酸鈉、十二烷基磺酸鈉對金銀花過氧化物酶有不同程度的抑制作用。

金銀花；過氧化物酶；三相分離法；酶學(xué)性質(zhì)

金銀花（Lonicera japonica Thunb.）為忍冬科植物忍冬的花蕾或初開的花，具有抑菌、抗病毒[1-3]、抗氧化[4-5]等作用，作為一種“藥食同源”原料廣泛用于食品生產(chǎn)[6-7]。新鮮金銀花在儲藏和干燥加工過程中，常發(fā)生不同程度的褐變，造成功效成分降解，導(dǎo)致藥用價值的降低[8]。研究表明這種品質(zhì)劣變是在多酚氧化酶和過氧化物酶（peroxidase，POD）等相關(guān)酶的作用下，酚類物質(zhì)氧化為醌，醌類物質(zhì)聚合形成褐色素而引起的[9-10]。目前金銀花酶促褐變引起功效成分損失的具體途徑尚未研究清楚，提取純化相關(guān)酶對于金銀花酶促褐變機理研究具有一定意義。

三相分離法是通過向粗提取液中加入一定比例的鹽和有機溶劑使混合液產(chǎn)生明顯的三相，使部分蛋白聚集在有機相和水相間的沉淀層，低分子質(zhì)量色素、膜脂等溶解在有機層，糖類、部分蛋白質(zhì)溶解在水層，從而達到提取純化目標物質(zhì)的方法[11-12]。研究表明三相分離法適用于部分植物組織中酶的初步純化[12-16]，此外三相分離法也可用于分離純化油性樹脂[17]、熊果酸、齊墩果酸[18]等天然物質(zhì)。將三相分離法應(yīng)用于植物組織中天然物質(zhì)的純化是一種較新的分離純化技術(shù)[19]，具有一定的應(yīng)用前景。

本研究用三相分離法分離純化金銀花中的POD，一方面有助于純化參與酶促褐變的相關(guān)酶，為進一步深入研究金銀花中酶促褐變途徑提供依據(jù)；另一方面對擴展三相分離體系在植物組織中酶的純化方面的應(yīng)用具有積極意義。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新鮮金銀花采摘于洛陽市孟津縣益豐金銀花種植基地。

磷酸氫二鈉、磷酸二氫鉀、無水乙醇、甘油、甲叉雙丙稀酰胺、過氧化氫、丙烯酰胺 天津市德恩化學(xué)試劑有限公司；硫酸銨、甘氨酸 江蘇強盛功能化學(xué)股份有限公司；愈創(chuàng)木酚 上海源葉生物科技有限公司；磷酸、鹽酸、三羥甲基氨基甲烷 洛陽昊華化學(xué)試劑有限公司；叔丁醇、堿性品紅、偏重亞硫酸鈉、活性炭天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；考馬斯亮藍G-250、考馬斯亮藍R-250 上海強順化學(xué)試劑有限公司；牛血清白蛋白 上海藍季科技發(fā)展有限公司；溴酚藍 天津市致遠化學(xué)試劑有限公司；四甲基乙二胺 北京吉美生物技術(shù)有限公司；過硫酸銨 天津市大茂化學(xué)試劑廠；高碘酸鈉、三氯乙酸 南京化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

HR2850攪拌機 飛利浦電子公司；PHS-3C型精密pH計 上海越平科學(xué)儀器有限公司；2400紫外-可見分光光度計 上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司；H1850R湘儀臺式高速冷凍離心機 湖南長沙湘儀離心機儀器有限公司；DYCZ-24DN垂直板電泳槽、電泳儀 北京六一儀器廠。

1.3 方法

1.3.1 金銀花POD的提取

稱取一定量新鮮無損金銀花，按照料液比1∶7（g/mL）加入4 ℃的pH值為6的磷酸鹽緩沖液打漿2 min，4 ℃、9 000 r/min離心15min，收集上清液即為粗酶液，將粗酶液分裝凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 三相分離法純化POD

取20 mL酶的粗提取液，在100 r/min攪拌條件下緩慢加入一定量的硫酸銨，待硫酸銨固體充分溶解之后用1 mol/L的HCl或NaOH溶液調(diào)節(jié)混合液的pH值，然后按照一定體積比加入叔丁醇，繼續(xù)攪拌10 min，將混合液轉(zhuǎn)移至離心管中，4 ℃靜置1 h，4 000 r/min離心10 min。離心之后可以觀察到混合液分為明顯的三相，即上層的有機相、中間的沉淀層和下層的水相，用吸管吸除上層的有機相和下層水相。中間沉淀層用1 mL的pH值為6的磷酸鹽緩沖液溶解，透析除去鹽和有機溶劑，分別測定總蛋白含量和酶活力[11-12,16]。

1.3.3 單因素試驗

首先固定硫酸銨質(zhì)量濃度30 g/100 mL、提取液與叔丁醇體積比1∶1，考察pH值（3、4、5、6、7、8）對金銀花POD回收率和純化倍數(shù)的影響。在最優(yōu)pH值條件下，固定提取液與叔丁醇體積比1∶1，考察硫酸銨質(zhì)量濃度（20、30、40、50、60 g/100 mL）對金銀花POD回收率和純化倍數(shù)的影響。然后在最優(yōu)pH值及硫酸銨質(zhì)量濃度條件下，考察提取液與叔丁醇體積比（1∶0.5、1∶1、1∶1.5、1∶2、1∶2.5）對金銀花POD回收率和純化倍數(shù)的影響。

1.3.4 金銀花POD提取純化的響應(yīng)面試驗

根據(jù)單因素試驗結(jié)果，使用Box-Behnken試驗設(shè)計，分析pH值、硫酸銨質(zhì)量濃度、粗提取液與叔丁醇體積比在三相分離中對金銀花POD分離純化的影響。試驗設(shè)計的因素與水平見表1。

表1 Box-Behnken試驗設(shè)計因素及水平Table 1 Factors and levels used for Box-Behnken design

1.3.5 酶活力測定

在比色杯中，先加入2 mL pH值為5的磷酸鹽緩沖液，然后加入1 mL體積分數(shù)0.5%愈創(chuàng)木酚和0.1 mL體積分數(shù)0.1% H2O2溶液，最后加0.1 mL粗酶液，蓋上蓋子在比色皿中迅速混合均勻，30 ℃條件下在470 nm波長處測定吸光度，每隔20 s計1 次數(shù)，以吸光度每分鐘變化0.01為1 個酶活力單位[20]。

1.3.6 蛋白質(zhì)含量的測定

采用Bradford的考馬斯亮藍G-250比色法[21]測定蛋白質(zhì)含量，用牛血清蛋白制作標準曲線，以595 nm波長處的吸光度為縱坐標，以標準蛋白質(zhì)質(zhì)量（mg）為橫坐標繪制標準曲線[22]，根據(jù)標準曲線方程計算出樣品中蛋白質(zhì)質(zhì)量。以標準蛋白質(zhì)質(zhì)量對吸光度進行線性回歸得回歸方程為：y=8.333x＋0.034 3，R2=0.998 1。

1.3.7 脫色效果測定

[23]，通過全波長掃描，將418 nm作為金銀花褐變色素測定波長，實驗發(fā)現(xiàn)在418 nm波長處無掃描峰，選擇在360、380、400、420、460 nm測定粗提取液吸光度，將粗提取液稀釋不同的倍數(shù)，以使吸光度在0.2～0.8范圍內(nèi)，選擇線性最優(yōu)的波長作為測定色素含量的最佳波長。脫色效果以色素清除率表示，計算公式如下[24]：

式中：a、b分別為粗提取液和透析液的稀釋倍數(shù)；V1為粗提取液體積；V2為透析液體積。1.3.8 聚丙烯酰胺凝膠電泳實驗

對粗提取液及經(jīng)三相分離法提取純化的金銀花POD進行聚丙烯酰胺凝膠電泳分析，凝膠分別用考馬斯亮藍染色、愈創(chuàng)木酚和H2O2溶液組成的底物溶液進行活性染色[25]，以及高碘酸-Schiff試劑反應(yīng)（periodic acid schiff reaction，PAS）染色[26]。

1.3.9 金銀花POD酶學(xué)性質(zhì)測定

1.3.9.1 金銀花POD最適溫度及熱穩(wěn)定性

分別在10～70 ℃溫度下測定酶活力，以酶活力最高為100%。酶液在10～70 ℃條件下保溫1 h后，迅速冷卻至室溫，測定殘余酶的活力，以未保溫處理4 ℃條件下放置1 h的酶活力為100%[27]。

1.3.9.2 金銀花POD最適pH值及pH值穩(wěn)定性

在不同pH值的緩沖溶液中測定酶活力，以酶活力最高者為100%。用不同pH值的緩沖溶液稀釋酶液，4 ℃放置1 h，測定殘余酶的活力，以酶活力最高者為100%[27]。

1.3.9.3 底物濃度對金銀花POD反應(yīng)速率的影響

在最適條件下使酶促反應(yīng)體系的愈創(chuàng)木酚濃度分別為3.33、1.67、1.11、0.83、0.67、0.56、0.48 mmol/L，測得不同愈創(chuàng)木酚濃度下酶促反應(yīng)的速率，以愈創(chuàng)木酚濃度的倒數(shù)為橫坐標，以反應(yīng)速率的倒數(shù)為縱坐標，求出金銀花POD在該條件下的米氏常數(shù)Km值和最大速率vmax值[27-28]。

在最適條件下使酶促反應(yīng)體系的H2O2溶液濃度分別為0.333、0.167、0.111、0.083、0.067、0.056、0.048 mmol/L，測得H2O2溶液不同濃度下酶促反應(yīng)的速率，以H2O2溶液濃度的倒數(shù)為橫坐標，以反應(yīng)速率的倒數(shù)為縱坐標，求出金銀花POD在該條件下的米氏常數(shù)Km值和vmax值。

H2O2溶液濃度測定用經(jīng)草酸鈉標定的高錳酸鉀溶液進行滴定。產(chǎn)物濃度[27]以愈創(chuàng)木酚氧化產(chǎn)物四聯(lián)甲氧基連酚的消光系數(shù)ε470nm為26.6 mmol·cm·mL計算。

1.3.9.4 金銀花POD的底物特異性

在酶反應(yīng)體系中分別以愈創(chuàng)木酚、鄰苯二酚、鄰苯三酚、聯(lián)甲氧基苯胺為酶反應(yīng)底物，測定不同底物濃度下酶促反應(yīng)速率，用Lineweaver-Burk雙倒數(shù)作圖法，計算不同底物條件下酶促反應(yīng)米氏方程，根據(jù)Km值判斷金銀花POD的底物專一性。

1.3.9.5 抑制劑和金屬離子對金銀花POD活性的影響

在酶反應(yīng)體系中加入0.1 mL不同濃度的抑制劑（檸檬酸、抗壞血酸、L-半胱氨酸、亞硫酸鈉、偏重亞硫酸鈉、十二烷基磺酸鈉）及金屬離子（NaCl、CaCl2、MgSO4、ZnSO4、CuSO4、MnSO4），在不同化合物濃度（0.1、1、10 mmol/L）條件下測定對酶活力的影響，以不添加化合物組為對照組，計算相對酶活力，測定不同化合物對金銀花POD的激活及抑制作用。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗結(jié)果

2.1.1 pH值對金銀花POD回收率和純化倍數(shù)的影響

圖1 pH值對金銀花POD回收率和純化倍數(shù)的影響Fig. 1 Effect of pH on purification fold and activity recovery of POD

在三相分離體系的參數(shù)優(yōu)化中，pH值常作為首要考慮的因素[11]。由圖1可知，回收率和純化倍數(shù)都呈現(xiàn)先上升再下降的趨勢，在pH 3～4和6～7之間變化程度較大，在pH值為6時達到最佳的提取純化效果。原因可能是體系的分配效果常在目標蛋白等電點附近發(fā)生明顯的變化[11-12]。當(dāng)體系的pH值大于目標蛋白的等電點時，蛋白質(zhì)因為攜帶負電荷而趨向于向水相層移動，當(dāng)體系的pH值小于目標蛋白的等電點時，蛋白質(zhì)因為攜帶正電荷而聚集在有機相層與水相層間的沉淀層。此外，當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)攜帶正電荷時易與SO42-發(fā)生結(jié)合，而使蛋白結(jié)構(gòu)緊縮而沉淀析出，這與pH值對常規(guī)鹽析的影響作用類似。因此，在pH值為5～6時，有較好的提取純化效果，當(dāng)pH值大于6時，提取純化效果下降。在pH值為3時效果較差可能是金銀花POD在偏酸性環(huán)境下失活引起的。

2.1.2 硫酸銨對金銀花POD回收率和純化倍數(shù)的影響

圖2 硫酸銨質(zhì)量濃度對金銀花POD回收率和純化倍數(shù)的影響Fig. 2 Effect of ammonium sulfate concentration on purification fold and activity recovery of POD

由圖2可知，在硫酸銨質(zhì)量濃度為40 g/100 mL時，回收率和純化倍數(shù)達到最大值，分別達到75.4%和5.36。三相分離體系對于蛋白質(zhì)的分離純化作用主要是鹽析、有機溶劑沉淀、等電點沉淀、滲透和離子的親液作用等[12]。SO42-通過結(jié)合溶液中的自由水，使蛋白質(zhì)的疏水基團暴露，隨著鹽濃度增大蛋白質(zhì)由于疏水作用而聚集沉淀。因此，當(dāng)硫酸銨質(zhì)量濃度大于40 g/100 mL時，純化倍數(shù)下降較快，回收率緩慢下降。

2.1.3 提取液與叔丁醇體積比對金銀花POD回收率和純化倍數(shù)的影響

圖3 提取液與叔丁醇體積比對金銀花POD回收率和純化倍數(shù)的影響Fig. 3 Effect of ratio of crude extract to t-butanol on purification fold and activity recovery of POD

從圖3可以看出，提取液與叔丁醇體積比從1∶0.5改變到1∶1時，回收率和純化倍數(shù)上升較快，提取液與叔丁醇體積比為1∶1.5時，回收率和純化倍數(shù)達到最大值，分別為77.4%和5.67。叔丁醇因分子體積較大不能進入蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)內(nèi)部，因而不易引起酶失活。此外可以與水互溶的叔丁醇在硫酸銨溶液中可以產(chǎn)生明顯的分層，所以通常選擇叔丁醇作為在三相分離體系中的有機溶劑[11]。叔丁醇可以從水相層吸收一定量的水而使硫酸銨濃度增大而引起沉淀層蛋白增多，同時，水相與有機相的濃度梯度增大可能會引起回收率和純化倍數(shù)的減小[12,14]。因此回收率和純化倍數(shù)隨體積比的變化呈現(xiàn)先上升再下降的趨勢。

2.2 金銀花POD提取純化的響應(yīng)面結(jié)果

2.2.1 模型建立與顯著性檢驗結(jié)果

表2 Box-Behnken試驗設(shè)計與結(jié)果Table 2 Box-Behnken design with experimental results

采用Design-Expert V8.05數(shù)據(jù)處理軟件對表2試驗結(jié)果進行多元回歸擬合，經(jīng)回歸擬合后，得到純化倍數(shù)R1和回收率R2對提取液pH值（X1），硫酸銨質(zhì)量濃度（X2）、提取液與叔丁醇體積比（X3）的二次多項式回歸方程為：

對回歸模型進行方差分析，結(jié)果見表3和表4。由表3可知，純化倍數(shù)二次回歸模型的F值為381.432，P值小于0.000 1，表明模型達到了極顯著水平；失擬項檢驗F值為2.873，P值大于0.05，說明失擬項差異不顯著，擬合不足是不顯著的；試驗?zāi)Ｐ偷臎Q定系數(shù)R2值為0.997，說明試驗結(jié)果與模型預(yù)測結(jié)果有著良好的一致性。因此可用此模型來分析和預(yù)測金銀花POD純化倍數(shù)。由表4可知，回收率二次回歸模型的F值為226.161，P值小于0.000 1，表明模型達到了極顯著水平；失擬項檢驗F值為4.183，P值大于0.05，說明失擬項差異不顯著，擬合不足是不顯著的；試驗?zāi)Ｐ偷臎Q定系數(shù)R2值為0.996，說明試驗結(jié)果與模型預(yù)測結(jié)果有著良好的一致性。因此可用此模型來分析和預(yù)測金銀花POD回收率。

由回歸方程系數(shù)顯著性檢驗可知所考察的3 個因素對回收率和純化倍數(shù)均有一定影響。X1、X2、X3、X12、、、X1X3對純化倍數(shù)有極顯著的影響；X1、X1X3、、、對回收率有極顯著的影響，X2對回收率有顯著的影響。根據(jù)F值可判斷3 個因素對純化倍數(shù)和回收率影響的主次順序依次是pH值、硫酸銨質(zhì)量濃度、提取液與叔丁醇體積比。

表3 純化倍數(shù)回歸模型的方差分析顯著性檢驗Table 3 Analysis of variance and significance test for the established regression model for purification fold

表4 回收率回歸模型的方差分析顯著性檢驗Table 4 Analysis of variance and significance test for the established regression model for activity recovery

2.2.2 模型雙因素交互作用效應(yīng)分析

應(yīng)用Design-Expert V8.05繪制各指標與影響顯著的兩個自變量間的響應(yīng)面和等高線圖，考察擬合響應(yīng)面的形狀，分析交互項對回收率和純化倍數(shù)的影響。由圖4可知，pH值（X1）和提取液與叔丁醇體積比（X3）之間的交互作用對回收率和純化倍數(shù)的影響達到極顯著水平，原因可能是pH值影響分離體系中目標蛋白所帶電荷，提取液與叔丁醇體積比影響硫酸銨濃度及兩相間濃度梯度[12,14]，兩者相互作用，影響提取純化效果。

利用Design-Expert V8.05進行工藝參數(shù)的優(yōu)化組合，由回歸方程優(yōu)化得出因素水平的最優(yōu)組合為pH5.60、硫酸銨質(zhì)量濃度39.49 g/100 mL、提取液與叔丁醇體積比1∶1.38。在該條件下純化倍數(shù)為5.849，回收率為87.64%。新鮮金銀花中POD比活力為2 086.5 U/g，經(jīng)三相法分離純化，POD比活力為1 021.6 U/mg。

圖4 交互作用對回收率和純化倍數(shù)影響的響應(yīng)面和等高線圖Fig. 4 Response surface and contour plots showing the intereactive effects of factors on activity recovery and purification fold

2.3 金銀花POD的非變性凝膠電泳結(jié)果

圖5 金銀花POD聚丙烯酰胺凝膠電泳Fig. 5 PAGE pattern of POD from Lonicera japonica Thunb.

從圖5可以看出，經(jīng)過三相分離法的初步純化，部分雜蛋白被去除。由于POD可將愈創(chuàng)木酚氧化為紅褐色物質(zhì)，從活性染色結(jié)果可以看到2 條較明顯紅褐色條帶，說明該品種金銀花具有2 種POD同工酶。由于POD是一類含有血紅素輔基的糖蛋白[29]，因此通過PAS染色，可呈現(xiàn)紫色[30]。

2.4 脫色效果測定結(jié)果

圖6 不同波長下色素濃度與吸光度關(guān)系Fig. 6 Relationship between pigment concentration and absorbance values at different wavelengths

金銀花勻漿后極易發(fā)生褐變，產(chǎn)生大量色素，這些褐色素易與纖維素離子交換樹脂結(jié)合，且較難洗脫，對進一步純化產(chǎn)生影響。三相分離法對色素物質(zhì)有一定分離效果，可用于褐色素的清除。由圖6可知，在380、400、420、440、460 nm波長范圍內(nèi)對色素濃度與吸光度進行線性擬合，R2分別為0.974 2、0.976 0、0.988 2、0.971 2、0.961 6，在420 nm波長處色素濃度與吸光度的線性關(guān)系最優(yōu)，因此選擇420 nm作為色素濃度測定波長。在回歸方程優(yōu)化得出因素水平的最優(yōu)組合條件下色素清除率可達92%。

2.5 金銀花POD最適溫度及熱穩(wěn)定性分析

圖7 溫度對金銀花POD相對酶活力的影響及熱穩(wěn)定性Fig. 7 Effect of temperature on activity and stability of the POD enzyme

從圖7可以看出，金銀花POD相對酶活力在10～70 ℃范圍內(nèi)呈現(xiàn)先上升再下降的趨勢，相對酶活力在30 ℃時達到最大值，在溫度超過50 ℃后相對酶活力下降迅速，70 ℃時相對酶活力只有33%。從金銀花POD熱穩(wěn)定性曲線可以看出在10～40 ℃范圍內(nèi)相對酶活力較為穩(wěn)定，40 ℃時相對酶活力為77.1%，同時溫度大于40 ℃后，酶穩(wěn)定性迅速下降，70 ℃保溫1 h，相對酶活力為7.7%。

2.6 金銀花POD最適pH值及pH值穩(wěn)定性分析

圖8 pH值對金銀花POD相對酶活力的影響及pH值穩(wěn)定性Fig. 8 Effect of pH on activity and stability of the POD enzyme

從圖8可以看出，金銀花POD在pH 4～7范圍內(nèi)有較高活性，該酶的最適pH值為5，在pH值為4時相對酶活力為87%，pH值為6時相對酶活力為84%；從pH值穩(wěn)定性曲線中可以看出在pH值在2～5范圍內(nèi)酶穩(wěn)定性變化明顯，相對酶活力從20%上升到100%，pH值在5～9范圍內(nèi)酶穩(wěn)定性變化較緩慢，相對酶活力從100%變化到71%?？赡苁莗H值小于4的酸性環(huán)境對金銀花POD分子結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性影響較大，在pH 4～7的堿性環(huán)境中酶的分子構(gòu)象較穩(wěn)定。

2.7 底物濃度對金銀花POD反應(yīng)速率的影響

圖9 愈創(chuàng)木酚（a）和H2O2（b）對金銀花POD反應(yīng)速率影響的雙倒數(shù)曲線Fig. 9 Lineweaver-Burk plots for the POD enzyme with guaiacol (a)and H2O2 (b) as substrates

POD催化的酶促反應(yīng)屬于雙底物酶促反應(yīng)，固定一種底物的濃度，測定不同濃度的另一種底物對反應(yīng)速率的影響，用Lineweaver-Burk雙倒數(shù)作圖法，可以得到兩條雙倒數(shù)曲線，雙倒數(shù)曲線中橫軸截距為-1/Km，縱軸截距為1/vmax。由圖9金銀花POD的雙倒數(shù)曲線可以求出當(dāng)H2O2溶液濃度一定時，POD對愈創(chuàng)木酚的Km值為8.12 mmol/L，vmax值為1.71 mmol/（min·L）。當(dāng)愈創(chuàng)木酚溶液濃度一定時，H2O2的Km值為0.822 mmol/L，vmax值為1.38 mmol/（min·L）。Km值是酶促反應(yīng)速率達到最大反應(yīng)速率一半時的底物濃度，可以代表酶與底物的親和能力[27]。因此可以看出H2O2溶液對于金銀花POD的親和能力大于愈創(chuàng)木酚溶液。

2.8 金銀花POD的底物專一性

表5 金銀花POD的底物特異性Table 5 Substrate specificity of the POD enzyme

分別以愈創(chuàng)木酚、鄰苯二酚、鄰苯三酚、聯(lián)甲氧基苯胺作為反應(yīng)底物，用Lineweaver-Burk雙倒數(shù)作圖法可以得到不同底物條件下酶促反應(yīng)的米氏方程，米氏常數(shù)Km可以代表酶與底物的親和能力，Km值愈小，表明酶與底物的親和力越強，從表5可以看出，金銀花POD與底物的親和力由強到弱依次為鄰苯三酚、鄰苯二酚、聯(lián)甲氧基苯胺、愈創(chuàng)木酚。

2.9 抑制劑和金屬離子對金銀花POD活力的影響

表6 不同化合物對金銀花POD相對酶活力的影響Table 6 Effects of various compounds on the activity of the POD enzyme

從表6可以看出，Ca2＋、Cu2＋、Zn2＋對金銀花POD有一定激活作用，其中Ca2＋在較低濃度條件下可以起到激活作用，Zn2＋在較高濃度條件下可以起到激活作用，Cu2＋的激活作用隨濃度增大逐漸增強。Mg2＋、Mn2＋對金銀花POD有抑制作用，其中Mn2＋抑制作用較強。Na＋對酶的作用不明顯。抑制劑檸檬酸、抗壞血酸、L-半胱氨酸、亞硫酸鈉、偏重亞硫酸鈉對金銀花POD均有一定抑制作用，抑制作用隨濃度增大逐漸增強，在10 mmol/L濃度下，抗壞血酸和L-半胱氨酸可以完全抑制酶活性。表面活性劑十二烷基磺酸鈉對金銀花POD有一定抑制作用，且在高濃度條件下抑制作用較強。

3 結(jié) 論

在單因素試驗的基礎(chǔ)上經(jīng)響應(yīng)面優(yōu)化得出各因素水平的最優(yōu)組合為pH 5.60、硫酸銨質(zhì)量濃度39.49 g/100 mL、提取液與叔丁醇體積比為1∶1.38。在該條件下純化倍數(shù)為5.849，回收率為87.64%。該條件下POD比活力為1 021.6 U/mg。

420 nm可作為金銀花褐變產(chǎn)生色素的測定波長。三相分離法對褐變色素具有較好的清除效果，在最優(yōu)純化效果條件下色素清除率為92%。

對金銀花POD最適溫度和熱穩(wěn)定性研究表明酶的最適溫度30℃，該酶在10～40 ℃范圍內(nèi)穩(wěn)定性較好，相對酶活力在75%以上，當(dāng)溫度高于40 ℃酶活力下降迅速。對最適pH值和pH值穩(wěn)定性研究表明酶的最適pH值為5，酶在pH值小于4的酸性環(huán)境中酶活力下降迅速，pH值在4～7范圍內(nèi)有較好的穩(wěn)定性。當(dāng)H2O2溶液濃度一定時，酶對愈創(chuàng)木酚的Km值為8.12 mmol/L，vmax值為1.71 mmol/（min·L）。當(dāng)愈創(chuàng)木酚溶液濃度一定時，H2O2溶液的Km值為0.822 mmol/L，vmax值為1.38 mmol/（min·L）。H2O2溶液對于金銀花POD的親和能力大于愈創(chuàng)木酚。金銀花POD與底物的親和力由強到弱依次是鄰苯三酚、鄰苯二酚、聯(lián)甲氧基苯胺、愈創(chuàng)木酚。Ca2＋、Cu2＋、Zn2＋對金銀花POD有一定激活作用，Mg2＋、Mn2＋、檸檬酸、抗壞血酸、L-半胱氨酸、亞硫酸鈉、偏重亞硫酸鈉、十二烷基磺酸鈉對金銀花POD均有一定抑制作用。

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Purification of Peroxidase from Lonicera japonica Thunb. by Three Phase Partitioning and Enzymatic Properties

LUO Lei, DONG Jinlong, ZHU Wenxue*, XUE Yihan, GUAN Ningning, ZHANG Kuan, JI Qinghua
(College of Food and Bioengineering, Hennan University of Science and Technology, Luoyang 471023, China)

Three phase partitioning was used to extract and purify peroxidase (POD) from Lonicera japonica Thunb. The optimal conditions were obtained as follows: pH 5.60, ammonium sulfate concentration 39.49 g/100 mL, and ratio of crude extract to t-butanol (V/V), 1:1.38. Under these conditions, the activity recovery was 87.64% with a purification factor of 5.849, and the specific activity of purified peroxidase was 1 021.6 U/mg. By using three phase partitioning, 92% pigment was removed. Enzymatic properties revealed that the optimum temperature for this enzyme was 30 ℃ and the optimum pH was 5. The enzyme was stable in the temperature range of 10-40 ℃ and in the pH range of 4-7. In the presence of both guaiacol and H2O2, Michaelis constants (Km) and maximum reaction rates (vmax) of the enzyme were 8.12 mmol/L and 1.71 mmol/(min·L) for guaiacol, and 0.822 mmol/L and and 1.38 mmol/(min·L) for H2O2at a fixed concentration of the other substrate, respectively. The affinity of the enzyme to various substrates was in the decreasing order: pyrogallol ＞catechol ＞ bimethoxy aniline ＞ guaiacol. The peroxidase activity was activated by Ca2+, Cu2+and Zn2+but inhibited by Mg2+,Mn2+, citric acid, ascorbic acid, L-cysteine, sodium sulphite and sodium metabisulphite.

Lonicera japonica Thunb.; peroxidase; three phase partitioning; enzymatic properties

10.7506/spkx1002-6630-201724004

TS201.2

A

1002-6630（2017）24-0020-08

羅磊, 董金龍, 朱文學(xué), 等. 金銀花過氧化物酶的三相分離純化及酶學(xué)性質(zhì)[J]. 食品科學(xué), 2017, 38(24): 20-27.

10.7506/spkx1002-6630-201724004. http://www.spkx.net.cn

LUO Lei, DONG Jinlong, ZHU Wenxue, et al. Purification of peroxidase from Lonicera japonica Thunb. by three phase partitioning and enzymatic properties[J]. Food Science, 2017, 38(24)∶ 20-27. (in Chinese with English abstract) DOI∶10.7506/spkx1002-6630-201724004. http∶//www.spkx.net.cn

2016-11-15

國家自然科學(xué)基金聯(lián)合基金項目（U1304330）

羅磊（1976—），男，教授，博士，研究方向為食品營養(yǎng)成分與活性物質(zhì)。E-mail：13623896431@139.com

*通信作者：朱文學(xué)（1967—），男，教授，博士，研究方向為食品加工與功能食品。E-mail：zwx@haust.edu.cn