伍 瑛 陳永東 李 凡 張會(huì)萍 白 敏 金利芳 李云華 杜聯(lián)芳

載自殺基因的靶向微泡聯(lián)合超聲輻照抑制視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤的實(shí)驗(yàn)研究

伍 瑛 陳永東 李 凡 張會(huì)萍 白 敏 金利芳 李云華 杜聯(lián)芳

目的 探討載自殺基因的靶向微泡聯(lián)合超聲輻照對(duì)視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤（RB）的抑制作用。方法 制備攜帶單純皰疹病毒Ⅰ型胸苷激酶（HSV1-tk）質(zhì)粒和血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子受體2抗體的靶向微泡，分為空白對(duì)照組、細(xì)胞+質(zhì)粒組、細(xì)胞+質(zhì)粒+SonoVue組、細(xì)胞+靶向微泡組、細(xì)胞+質(zhì)粒+超聲輻照組、細(xì)胞+質(zhì)粒+SonoVue+超聲輻照組及細(xì)胞+靶向微泡+超聲輻照組進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。熒光顯微鏡觀察各組基因轉(zhuǎn)染情況，流式細(xì)胞儀檢測(cè)轉(zhuǎn)染率，加入丙氧鳥苷（GCV）后檢測(cè)細(xì)胞的抑制率。結(jié)果 細(xì)胞+靶向微泡+超聲輻照組的轉(zhuǎn)染率為（24.78±1.04）%，高于細(xì)胞+質(zhì)粒+SonoVue+超聲輻照組（14.31±0.69）%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Plt;0.05）。隨著GCV濃度的增加和培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，各組抑制率逐漸升高。當(dāng)GCV濃度為100 mg/L，培養(yǎng)96 h后，細(xì)胞+靶向微泡+超聲輻照組對(duì)RB細(xì)胞的抑制率達(dá)（92.91±1.71）%。結(jié)論 加入GCV后，攜帶HSV1-tk基因的靶向微泡聯(lián)合超聲能有效地抑制RB細(xì)胞。

靶向，微泡，超聲破壞；視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤；基因轉(zhuǎn)染

目前單純皰疹病毒胸苷激酶/丙氧鳥苷（HSV-tk/GCV）自殺基因系統(tǒng)在基因治療中極有價(jià)值，為視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤（retinoblastoma，RB）的治療帶來(lái)了新的希望［1-2］。本課題組前期體外實(shí)驗(yàn)研究［3］針對(duì) RB 篩選出了合適的超聲和微泡配比條件，并制備了攜帶單純皰疹病毒Ⅰ型胸苷激酶（HSV1-tk）基因的靶向微泡，在體實(shí)驗(yàn)研究［4］發(fā)現(xiàn)該微泡對(duì)RB的增強(qiáng)程度和顯影效果與SonoVue相當(dāng)，且持續(xù)時(shí)間更長(zhǎng)，更加穩(wěn)定。本實(shí)驗(yàn)采用這種攜HSV1-tk基因的靶向微泡聯(lián)合超聲靶向微泡破壞（ultrasound-targeted microbubble destruction，UTMD），旨在評(píng)估其對(duì)RB細(xì)胞的轉(zhuǎn)染率和抑制作用。

材料與方法

一、主要材料及儀器

RB細(xì)胞（HXO-RB44，美國(guó)ATCC公司）；HSV1-tk（上海生工生物工程有限公司）；p-IRES2-EGFP質(zhì)粒（上海舜百生物科技有限公司）；生物素化的血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子受體2（VEGFR 2）抗體（美國(guó)Biolegend公司）；雙標(biāo)記微泡TargesphereSA（美國(guó)Targeson公司）；SonoVue（意大利Bracco公司）；丙氧鳥苷（GCV，湖北潛龍藥業(yè)有限公司）。PHYSIOMED-Expert超聲波治療儀（德國(guó)Physiomed公司）；CKX41倒置熒光顯微鏡（日本奧林巴斯公司）；EPICSALTRA流式細(xì)胞儀（美國(guó)Beckman Coulter公司）；I-MARK Bio-med酶標(biāo)儀（日本Bio-med公司）。

二、實(shí)驗(yàn)方法

1.真核表達(dá)載體的構(gòu)建和酶切鑒定：HSV1-tk由生工合成，5’端和3’端分別加有BglⅡ和EcoRⅠ酶切位點(diǎn)。合成的HSV1-tk與p-IRES2-EGFP質(zhì)粒經(jīng)BglⅡ和EcoRⅠ雙酶切后連接。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a，挑選單克隆抽提質(zhì)粒，經(jīng)BglⅡ和EcoRⅠ按以下反應(yīng)體系進(jìn)行雙酶切鑒定：p-IRES2-EGFPHSV1-tk質(zhì)粒1μg，BglⅡ1μl（10 U/μl），EcoRⅠ1μl（10 U/μl），10X BamHIBuffer內(nèi)切酶 5 μl，雙蒸水補(bǔ)足至50μl，以上體系放入37℃恒溫儀器中反應(yīng)4 h，酶切結(jié)束后電泳觀察目的片段和載體片段。鑒定后質(zhì)粒抽提用于實(shí)驗(yàn)。

2.雙標(biāo)記微泡Targesphere SA與質(zhì)粒和抗體連接：雙標(biāo)記微泡Targesphere SA輕微振搖混勻后加入p-IRES2-EGFP-HSV1-tk質(zhì)粒（500μg/ml），輕微振蕩混勻后室溫孵育20 min。隨后加入50μg生物素化的VEGFR 2抗體，再次輕微振蕩混勻，室溫孵育20 min，離心5 min（1500 r/min），PBS溶液洗滌3次以去除未結(jié)合的質(zhì)粒和抗體。

3.實(shí)驗(yàn)分組：共分為7組，分別為空白對(duì)照組（A組）；細(xì)胞+質(zhì)粒組（B組）；細(xì)胞+質(zhì)粒+SonoVue組（C組）；細(xì)胞+靶向微泡組（D組）；細(xì)胞+質(zhì)粒+超聲輻照組（E組）；細(xì)胞+質(zhì)粒+SonoVue+超聲輻照組（F組）；細(xì)胞+靶向微泡+超聲輻照組（G組）。HXO-RB44細(xì)胞懸液用細(xì)胞計(jì)數(shù)器計(jì)數(shù)細(xì)胞后移入24孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔細(xì)胞約2×105個(gè)，每組10孔。B、C、E及F組質(zhì)粒用量每孔1μg，C組和F組SonoVue用量每孔30μl，D組和G組靶向微泡用量每孔30μl。按實(shí)驗(yàn)分組依次加入質(zhì)粒和微泡，最后各組加入培養(yǎng)液使每孔體積為150μl。加入質(zhì)粒后置于37℃、5%CO2恒溫孵育箱中孵育5 min。

4.超聲輻照：采用前期實(shí)驗(yàn)［3］優(yōu)化的超聲和造影劑配比條件，即探頭頻率1 MHz，脈沖重復(fù)頻率100 Hz，占空比 20%，聲強(qiáng) 1.5 W/cm2，輻照時(shí)間 60 s；SonoVue濃度20%。超聲輻照結(jié)束后置于37℃、5%CO2恒溫孵育箱中培養(yǎng)4 h，然后每孔加入培養(yǎng)液配平至總體積為500μl后繼續(xù)培養(yǎng)。

5.轉(zhuǎn)染率檢測(cè)：處理后12、24、48 h使用倒置熒光顯微鏡觀察各組綠色熒光蛋白表達(dá)情況；處理后72 h每組取5孔收集細(xì)胞，應(yīng)用流式細(xì)胞儀測(cè)量基因轉(zhuǎn)染率。

6.GCV加入后對(duì)細(xì)胞殺傷作用的評(píng)價(jià)：每組取5孔細(xì)胞，培養(yǎng)48 h后按每孔1×104個(gè)接種于96孔培養(yǎng)板，分別加入濃度為 0、1、10、50、100、500、1000 mg/L 的GCV（每組5孔）。培養(yǎng)至 24、48、72、96 h時(shí)，每孔再加入噻唑藍(lán)20μl（5 mg/ml），4 h后棄上清加入二甲基亞砜200μl，振蕩10min，于酶標(biāo)儀570nm波長(zhǎng)處測(cè)定各孔的吸光度值，并計(jì)算各組抑制率：抑制率=（1-存活率）×100%。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

應(yīng)用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料以x±s表示，各組比較采用方差分析，兩兩比較行LSD-t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、各組倒置熒光顯微鏡下觀察

在各時(shí)間點(diǎn)，A、B、C、D組RB細(xì)胞鏡下均未見(jiàn)綠色熒光。12 h后，E、F、G組有小部分細(xì)胞顯示綠色熒光；24 h后，三組顯示綠色熒光的細(xì)胞數(shù)明顯增加，高倍鏡下熒光多出現(xiàn)于細(xì)胞的邊緣；48 h后熒光亮度達(dá)高峰，可充滿整個(gè)細(xì)胞；72 h后細(xì)胞生長(zhǎng)非常密集，已不宜再培養(yǎng)和觀察。其中G組出現(xiàn)熒光的細(xì)胞數(shù)最多，熒光亮度最強(qiáng)。見(jiàn)圖1。

二、各組基因轉(zhuǎn)染率比較

A、B、C、D 組轉(zhuǎn)染率均為 0，E 組轉(zhuǎn)染率為（1.08±0.19）%，E組與A、B、C、D組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均 P＜0.05）；F組轉(zhuǎn)染率為（14.31±0.69）%，較 E 組升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；G 組轉(zhuǎn)染率為（24.78±1.04）%，較 F 組更高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

圖1 48 h后各組熒光顯微鏡和光鏡對(duì)照?qǐng)D（×200）

三、各組加入GCV后對(duì)RB細(xì)胞的抑制率

隨著GCV濃度的增加和培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，各組抑制率逐漸升高，組間比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05），見(jiàn)表1，2。當(dāng)GCV 濃度≥1 mg/L時(shí)，E、F、G 組的抑制率在不同GCV濃度下均明顯高于A、B、C、D組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均 P＜0.05），A、B、C、D 組的抑制率兩兩比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，E、F、G組抑制率兩兩比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）。當(dāng)GCV濃度為100 mg/L時(shí)，培養(yǎng)不同的時(shí)間后，E、F、G組的抑制率均明顯高于A、B、C、D組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05），E、F、G組之間的抑制率兩兩比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）。96 h后，G組對(duì)RB細(xì)胞的抑制率達(dá)到（92.91±1.71）%，高于 F組（65.17±1.68）%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。E組對(duì)RB細(xì)胞的抑制率為（45.26±0.40）%，高于 A、B、C、D 組，低于 F組和 G 組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）。

討 論

HSV-tk/GCV自殺基因系統(tǒng)在抑制RB基因治療中研究較多，效果較好。Chévez-Barrios等［1］以腺病毒為載體裝載tk基因，通過(guò)向玻璃體腔內(nèi)注射來(lái)治療播散到玻璃體腔的RB腫瘤，效果滿意，但部分病例出現(xiàn)炎癥反應(yīng)、角膜水腫及眼壓升高等副作用。季迅達(dá)等［2］研究條件復(fù)制型腺病毒聯(lián)合HSV-tk/GCV自殺基因系統(tǒng)對(duì)人RB細(xì)胞的殺傷作用，發(fā)現(xiàn)在病毒高劑量時(shí)，條件復(fù)制型腺病毒聯(lián)合HSV-tk/GCV自殺基因可導(dǎo)致80%的RB細(xì)胞死亡。雖然條件復(fù)制型腺病毒可以在細(xì)胞內(nèi)大量復(fù)制，具有溶瘤作用，但其單獨(dú)應(yīng)用時(shí)殺傷力較低，而GCV既是自殺基因發(fā)揮作用的藥物前體，又是抗病毒制劑，可以降低病毒的作用，因此病毒聯(lián)合HSV-tk/GCV自殺基因的抗腫瘤作用取決于GCV的毒性作用與GCV的抗病毒作用之間的平衡。

本研究采用UTMD進(jìn)行HSV1-tk基因轉(zhuǎn)染的方法，避免了上述病毒轉(zhuǎn)染的不足，且UTMD具有無(wú)免疫原性、無(wú)細(xì)胞毒性、轉(zhuǎn)染效率較高、操作簡(jiǎn)單及可重復(fù)等優(yōu)勢(shì)。超聲和微泡單獨(dú)或聯(lián)合使用，可以增加細(xì)胞膜的通透性，促進(jìn)基因或藥物傳遞［5］，且超聲微泡也可作為一種治療性基因的載體，但單純的超聲微泡造影劑無(wú)組織特異性，在體循環(huán)維持的時(shí)間較短，不能自動(dòng)尋靶，基因轉(zhuǎn)染率低，若在微泡造影劑外殼連接上靶向配體，主動(dòng)識(shí)別并結(jié)合到靶組織中，將較大地提高UTMD介導(dǎo)基因的轉(zhuǎn)染效率。

靶向配體的選擇在靶向微泡的制備中至關(guān)重要，多項(xiàng)研究［6-8］發(fā)現(xiàn)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子與RB的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，在RB的腫瘤組織中表達(dá)明顯升高，在腫瘤組織中VEGFR 2受體的水平亦相應(yīng)顯著上調(diào)。據(jù)此本實(shí)驗(yàn)選取了VEGFR 2作為靶點(diǎn)，有利于超聲微泡識(shí)別并聚集到RB的腫瘤組織內(nèi)。本實(shí)驗(yàn)采用雙標(biāo)記微泡Targesphere SA，將攜帶HSV1-tk基因的質(zhì)粒和VEGFR 2抗體結(jié)合到微泡上。此超聲微泡可通過(guò)生物素和親和素結(jié)合的方式連接靶向抗體，并通過(guò)正負(fù)電荷結(jié)合的方式結(jié)合治療性質(zhì)粒［9］，在小鼠腎癌和RB的移植瘤動(dòng)物模型中均能明顯增強(qiáng)顯影強(qiáng)度，延長(zhǎng)顯影時(shí)間［4，10］。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，攜帶 HSV1-tk 基因和VEGFR 2抗體的靶向微泡聯(lián)合超聲輻照組質(zhì)粒熒光蛋白表達(dá)情況最好，對(duì)RB細(xì)胞的轉(zhuǎn)染率較非靶向的超聲微泡造影劑SonoVue更高。分析其原因可能是腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)過(guò)程中缺氧，VEGFR 2受體的表達(dá)上調(diào)，攜帶VEGFR 2抗體的靶向微泡通過(guò)與受體結(jié)合，更多的微泡集聚到腫瘤細(xì)胞周圍，經(jīng)超聲輻照后微泡破裂，使攜帶HSV1-tk基因的質(zhì)粒進(jìn)而較多地進(jìn)入到細(xì)胞內(nèi)。

表1 實(shí)驗(yàn)各組在不同GCV濃度下培養(yǎng)96 h的抑制率比較（x±s） %

表2 實(shí)驗(yàn)各組在GCV濃度為100 mg/L培養(yǎng)不同時(shí)間的抑制率比較（x±s）%

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示載HSV1-tk基因的靶向微泡組的轉(zhuǎn)染率為（24.78±1.04）%，雖不及病毒介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染率高，但是在前體藥物GCV加入后，隨著濃度的增加和培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，攜帶HSV1-tk基因的靶向微泡較非靶向造影劑SonoVue能更有效地抑制RB細(xì)胞的生長(zhǎng)，在GCV濃度≥100 mg/L時(shí)，RB細(xì)胞的抑制率達(dá)到90%以上。由此可見(jiàn)，在自殺基因治療系統(tǒng)中，前體藥物GCV的加入非常重要，在合適的時(shí)間點(diǎn)加入一定劑量的GCV可以極大地發(fā)揮旁觀者效應(yīng)，最大程度殺死腫瘤細(xì)胞。本實(shí)驗(yàn)采取此策略彌補(bǔ)了轉(zhuǎn)染率不高的缺陷，證實(shí)了攜帶HSV1-tk基因和VEGFR 2抗體的超聲微泡造影劑聯(lián)合超聲能高效殺死RB細(xì)胞，為RB的基因治療研究提供了一種更加安全和有效的方法。

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Study on ultrasound targeted carry HSV1-tk targeted microbubble destruction inhibition retinoblastoma

WUYing，CHENYongdong，LIFan，ZHANGHuiping，BAIMin，JINLifang，LIYunhua，DULianfang
Department of Ultrasound，Renji Hospital，Shanghai Jiaotong University School of Medicine，Shanghai200127，China

Objective To evaluate inhibitory effect of retinoblastoma（RB） by ultrasound targeted carry HSV1-tk targeted microbubble destruction.Methods Targeted microbubble carrying HSV1-tk and VEGFR 2 antibody was prepared.All the RBcells were divided into 7 groups：control group，cells+plasmid，cells+plasmid+SonoVue，cells+targeted microbubble，cells+plasmid+ultrasound，cells+plasmid+SonoVue+ultrasound，cells+targeted microbubble+ultrasound.Gene transfection results was observed under the inverted fluorescent microscope.Gene transfection rates was measured by flow cytometry.Inhibitory rate of RB cells was measured after GCV was added.Results The transfection rate of cells+targeted microbubble+ultrasound group was（24.78±1.04）%，which was higher than that of cells+plasmid+SonoVue+ultrasound group（14.31±0.69）%，there was significant difference（Plt;0.05）.With the increase of GCV concentration and the prolongation of culture time，the inhibitory rate of each group increased gradually.When the GCV concentration was 100 mg/L，afer 96 h culture time，inhibitory rate of cells+targeted microbubble+ultrasound group was （92.91±1.71）%.Conclusion Combination ultrasound and targeted microbubble carrying HSV1-tk destruction can effectively inhibit RBcells with introduction of GCV.

Targeted，microbubble，ultrasonic destruction；Retinoblastoma；Gene transfection

R-331；R445.1

A

國(guó)家自然科學(xué)基金青年科學(xué)基金項(xiàng)目（81000617）；上海市自然科學(xué)基金（15ZR1433700）

200127 上海市，上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬仁濟(jì)醫(yī)院超聲醫(yī)學(xué)科（伍瑛）；上海交通大學(xué)附屬第六人民醫(yī)院眼科（陳永東）；上海交通大學(xué)附屬第一人民醫(yī)院超聲醫(yī)學(xué)科（李凡、張會(huì)萍、白敏、金利芳、李云華、杜聯(lián)芳）

杜聯(lián)芳，E mail：du_lf@163.com

2017-06-01）