王壬豐，周峻崗，胡小健，徐天宇，呂 紅

(1. 復(fù)旦大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院 遺傳工程國家重點實驗室，上海 200438； 2. 上海工業(yè)菌株工程技術(shù)研究中心，上海 200438；3. 上海天復(fù)生物科技有限公司，上海 200438)

玉米赤霉烯酮降解酶在馬克斯克魯維酵母中的表達及高產(chǎn)菌株的誘變篩選

王壬豐1,2，周峻崗2,3，胡小健1,2，徐天宇1,2，呂 紅1,2

(1. 復(fù)旦大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院 遺傳工程國家重點實驗室，上海 200438； 2. 上海工業(yè)菌株工程技術(shù)研究中心，上海 200438；3. 上海天復(fù)生物科技有限公司，上海 200438)

玉米赤霉烯酮(Zearalenone，ZEN)是鐮刀菌屬霉菌產(chǎn)生的一種霉菌毒素，常見于霉變的玉米、小麥等谷物中．研究發(fā)現(xiàn)，來源于粉紅黏帚霉(Gliocladiumroseum)的α/β水解酶ZHD101能夠斷裂ZEN的內(nèi)酯鍵，破壞ZEN的毒性．本文利用食品安全級的馬克斯克魯維酵母(Kluyveromycesmarxianus)重組分泌表達了ZHD101，發(fā)酵液上清中的表達產(chǎn)物具有水解ZEN的活性．利用UV和60Co-γ聯(lián)合誘變方法，提高了ZHD101在馬克斯克魯維酵母中的表達水平．高效液相色譜(HPLC)分析表明，重組菌株分泌表達的ZHD101酶蛋白既能水解標準品ZEN，又能在較溫和的條件下水解發(fā)霉玉米樣本中的ZEN，結(jié)果表明該重組菌株表達的玉米赤霉烯酮降解酶ZHD101，可應(yīng)用于發(fā)霉玉米的脫毒處理．

玉米赤霉烯酮； 玉米赤霉烯酮降解酶； 馬克斯克魯維酵母

玉米赤霉烯酮(Zearalenone，ZEN)是一種具有2,4-二羥基苯甲酸內(nèi)酯結(jié)構(gòu)的非甾類霉菌毒素，化學(xué)名為6-(10-羥基-6-氧基-11-碳烯基)-β-雷鎖酸內(nèi)酯，最初由Stob等從發(fā)霉的玉米中分離而得名[1]．目前已發(fā)現(xiàn)的ZEN及其衍生物有11種之多，主要由鐮刀菌屬霉菌(如Fusariumculmorum,Fusariumgraminearum等)產(chǎn)生，是玉米、小麥、大麥等小顆粒谷物作物的常見污染毒素[2-3]．其結(jié)構(gòu)與哺乳動物的β-雌二醇激素相似，可競爭性結(jié)合雌激素受體ERs且活性不受甲胎蛋白抑制，進而擾亂E2-依賴的信號通路并導(dǎo)致E2-靶器官結(jié)構(gòu)或功能的異常而影響家畜的發(fā)育與繁殖，對畜牧業(yè)造成巨大的經(jīng)濟損失[4]．進一步研究表明，ZEN的毒性，會引起靶細胞DNA損傷和染色體畸變，還可以誘導(dǎo)細胞膜脂質(zhì)過氧化損傷、細胞凋亡和免疫抑制[5-7]．而ZEN及其衍生物通過食物鏈進入人體，將增大罹患肝癌、乳腺癌等惡性腫瘤的風(fēng)險，危害人類健康[8]．

目前針對ZEN的脫毒方法大致可分為物理法、化學(xué)法和生物酶解法，但由于天然ZEN及其衍生物的結(jié)構(gòu)相對穩(wěn)定，常規(guī)化學(xué)試劑或高溫高壓處理的策略存在一定的局限性，且潛伏著耗能大、環(huán)境二次污染嚴重等問題[9-10]；盡管物理吸附法能夠很大程度地去除污染谷物中的霉菌毒素，但并不能從本質(zhì)上解決毒素降解的問題，且成本較高[11]．相比之下，生物酶解法具有高效、特異性強、綠色環(huán)保等優(yōu)勢，是霉菌毒素降解的研究熱點．目前已報道有多種微生物具有降解ZEN的能力，其中粉紅黏帚霉(Gliocladiumroseum)來源的α/β水解酶ZHD101可斷裂ZEN大環(huán)上的內(nèi)酯鍵，形成1-(3,5-二羥苯基)-10’-羥基-1’反式十一碳烯-6’-酮產(chǎn)物，該產(chǎn)物尚未發(fā)現(xiàn)類雌激素效應(yīng)[12-13]．

本研究中，我們構(gòu)建了馬克斯克魯維酵母(Kluyveromycesmarxianus)分泌表達ZHD101的重組菌株，并通過UV和60Co-γ聯(lián)合誘變、HPLC篩選，獲得了質(zhì)粒穩(wěn)定、ZHD101分泌表達量提高的重組突變株．該突變株分泌表達的ZHD101酶液具有較高的水解ZEN的能力，能夠在較溫和的反應(yīng)條件下水解霉變玉米樣本中的ZEN，研究結(jié)果可為發(fā)霉谷物的脫毒處理提供參考．

1 材料與方法

1.1 材 料

馬克斯克魯維酵母尿嘧啶缺陷菌株K.marxianusFIM-1(uraΔ)、大腸桿菌EscherichiacoliTOP-10、馬克斯克魯維酵母表達質(zhì)粒pUKD-N112、赤霉烯酮水解酶ZHD101重組大腸桿菌表達載體PET-28b-zhd101均由本室前期構(gòu)建和保存．赤霉烯酮標準品(Z2121-25MG)購自Sigma公司．His標簽單抗Mouse anti-His-Tag單克隆抗體購自Abmart公司(Cat M30111M)，二抗HRP-Goat anti-Mouse IgG(H+L)HSA購自KPL公司(Cat 074-1806)．其他試劑為國產(chǎn)分析純或色譜純．

1.2 方 法

1.2.1 ZHD101重組表達質(zhì)粒的構(gòu)建

根據(jù)粉紅黏帚霉(Gliocladiumroseum)中赤霉烯酮水解酶zhd101基因序列(GenBank KR363960.1)，設(shè)計合成特異性擴增引物： YB-zhd101-F(5’-TTACAAGAGAGACGGTGACCCCGGGATGCGCACTCGTAGC-ACAATCT-3’)和YB-zhd101-R(5’-CAAAGCTTGCGGCCTTAAGCGGCCGCTCAGTGGTGGTGGTGGTG-GTG-3’)，在反向引物中增加了6×His編碼序列，便于重組蛋白的純化與檢測．以pET-28b-zhd101模板，通過PCR擴增zhd101 DNA片段，擴增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳回收，然后與SmaⅠ和NotⅠ雙酶切的pUKD-N112片段，采用Gibson Assembly的同源重組方法(NEB公司，E2611S/L)，將目的片段連接到K.marxianus表達載體pUKD-N112上，并轉(zhuǎn)化E.coliTOP-10感受態(tài)細胞，挑取陽性克隆，測序鑒定，獲得含zhd101的重組表達質(zhì)粒pUKD-N112-zhd101．

1.2.2 ZHD101在馬克斯克魯維酵母中的表達

利用醋酸鋰轉(zhuǎn)化的方法[14]，將重組表達質(zhì)粒pUKD-N112-zhd101轉(zhuǎn)化馬克斯克魯維酵母FIM-1(uraΔ)菌，轉(zhuǎn)化產(chǎn)物涂布SD-Ura平板(Yeast nitrogen base w/o amino acids 6.7g/L, Glucose 20g/L, 10×Amino acids supplement without uracil 0.69g/L, Agar 20g/L)，30℃培養(yǎng)2d．以YB-zhd101-F和YB-zhd101-R為引物，利用PCR方法對SD-Ura平板上的克隆進行鑒定，獲得陽性克隆，命名為FIM/N112-zhd101-M0(菌株M0)．隨機挑取3個陽性克隆，接種50mL YD培養(yǎng)基(Yeast extract 20g/L, Glucose 20g/L)中，30℃培養(yǎng)72h，離心，取發(fā)酵液上清，用Western blot方法檢測發(fā)酵液上清中ZHD101的蛋白表達．Western blot的抗體用Mouse anti-His-Tag(1∶3000)．

1.2.3 薄層層析法(TLC)分析

用甲醇配制5mg/mL的ZEN儲液，然后用50mmol/L pH 9.0 Gly-NaOH緩沖液配制成50ng/μL的ZEN底物工作液．取10μL重組菌株M0發(fā)酵上清液與90μL底物工作液混合，37℃反應(yīng)后加入100μL乙腈終止反應(yīng)，加入200μL乙酸乙酯充分震蕩15min，12000r/min離心5min，吸上層乙酸乙酯相于新的EP管中，揮發(fā)干燥后用20μL乙醇溶解．取5μL乙醇重溶后的反應(yīng)產(chǎn)物用TLC檢測，展開劑為石油醚/丙酮/乙酸乙酯(體積比5∶4∶1)，層析結(jié)束后吹干，并在紫外燈下觀察薄層硅膠板．

1.2.4 重組菌株的誘變與篩選

取對數(shù)生長期的FIM/N112-zhd101-M0細胞，在紫外誘變爐(CL-1000 ΜLtraviolet Crosslinker)中照射30min，隨后在30℃，220r/min搖床避光培養(yǎng)30min，4℃避光靜置6～8h，再次UV誘變、避光恢復(fù)培養(yǎng)30min．取100μL經(jīng)歷兩次連續(xù)UV誘變的菌液，轉(zhuǎn)接至新鮮的YD培養(yǎng)基中，搖床培養(yǎng)至對數(shù)生長期，重復(fù)上述步驟，即每天2次UV誘變，連續(xù)5d．隨后，再進行60Co-γ輻射處理1h，輻射劑量14.49kGy．取60Co-γ輻射處理前后的菌液，梯度稀釋并涂布YEPD平板，30℃倒置培養(yǎng)3d后統(tǒng)計菌落數(shù)并根據(jù)公式計算60Co-γ輻射致死率．

γ輻射致死率=(1-誘變后活菌數(shù)/誘變前活菌數(shù))×100%

(1)

誘變后的菌懸液涂布SD-ura平板，挑取克隆接種于0.7mL YD培養(yǎng)基/孔的24孔板中，30℃培養(yǎng)72h，用HPLC方法檢測培養(yǎng)上清液中ZHD101的活性，篩選ZHD101高表達的突變株M1．

1.2.5 質(zhì)粒穩(wěn)定性分析

重組菌株FIM/N112-zhd101-M0和突變株M1的單菌落，分別接種于2mL YD培養(yǎng)基中，30℃，220r/min搖床培養(yǎng)過夜．按1∶5000轉(zhuǎn)接至新鮮培養(yǎng)基中，于30℃，220r/min搖床連續(xù)培養(yǎng)20h(約為10代)，按1∶5000轉(zhuǎn)接至新鮮培養(yǎng)基中，繼續(xù)培養(yǎng)，連續(xù)轉(zhuǎn)接4次(約為40代)．每10代的酵母細胞，適當稀釋后分別涂布YEPD及YEPD+5FOA平板，30℃倒置培養(yǎng)2d．在含有5FOA的平板上能夠生長的克隆，表示質(zhì)粒丟失．用YEPD平板上生長的克隆減去5FOA平板上生長的克隆，再除以YEPD平板上生長的克隆，獲得每10代重組酵母的質(zhì)粒穩(wěn)定性，如公式2所示．

質(zhì)粒相對穩(wěn)定性(%)=(1-5FOA平板上的菌落數(shù)YEPD平板上的菌落數(shù))×100%.

(2)

1.2.6 高效液相色譜法(HPLC)分析

取10μL重組菌株M0發(fā)酵上清液，與90μL 50ng/μL ZEN底物工作液混合，37℃反應(yīng)一定時間后加入100μL乙腈終止反應(yīng)，4℃，14000r/min離心15min，取上清液進行HPLC檢測．HPLC檢測選用Agilent XDB-C18色譜柱(250mm×4.6mm，5μm)，檢測波長為240nm，色譜流動相條件： 0～8min(甲醇20%～80%)；8～12min(甲醇80%)；12～16min(甲醇80%～20%)；流速為1mL/min．

1.2.7 發(fā)霉玉米中的ZEN降解效果分析

稱取2g發(fā)霉玉米，經(jīng)研磨粉碎后加入20mL重組菌株M0發(fā)酵上清液，充分混勻，放置室溫過夜，加20mL乙腈溶液(V乙腈/V水=85∶15)，充分震蕩混勻過夜，離心，取上清液1mL，凍干后加入300μL乙腈重溶后過濾，濾液用HPLC檢測ZEN含量．HPLC檢測采用Agilent XDB-C18色譜柱(250mm×4.6mm，5μm)，紫外檢測波長為240nm，流動相條件為70%甲醇，流速為0.8mL/min．

2 結(jié)果與分析

2.1 ZHD101在馬克斯克魯維酵母中的表達及活性檢測

重組表達載體pUKD-N112-zhd101轉(zhuǎn)化K.marxianusFIM-1(uraΔ)后，轉(zhuǎn)化子用引物YB-zhd101-F和YB-zhd101-R PCR篩選，結(jié)果如圖1(a)所示，轉(zhuǎn)化子中含有質(zhì)粒pUKD-N112-zhd101，能夠擴增出大小約850bp的條帶．

圖1 ZHD101重組表達馬克斯克魯維酵母菌株的構(gòu)建及分泌表達分析Fig.1 Recombination and identification of the K.marxianus strain expressing ZHD101(a) FIM/N112-zhd101重組菌M0的PCR驗證；(b) Western blot檢測重組表達菌株發(fā)酵液上清中的ZHD101表達；(c) TLC分析發(fā)酵上清液中ZEN水解ZEN的活性．NC： 陰性對照組，WT為含空載質(zhì)粒FIM-1(uraΔ)的發(fā)酵液上清．

重組菌M0經(jīng)搖瓶培養(yǎng)72h后，離心收集發(fā)酵液上清，利用zhd101蛋白C端融合的6×His標簽，Western blot檢測上清中ZHD101蛋白表達，結(jié)果發(fā)現(xiàn)重組菌M0的上清中有大小約31kDa的雜交條帶，大小與ZHD101預(yù)測分子量一致(圖1(b))，表明重組菌株M0能夠分泌表達ZHD101．

同時，用TLC分析發(fā)酵液上清中的ZHD101水解ZEN的活性(圖1(c))．用M0發(fā)酵液上清與ZEN混合反應(yīng)，隨反應(yīng)時間延長，ZEN的量逐漸減少，反應(yīng)120min后降解完全，而在對照組WT中，ZEN的量沒有明顯變化，說明重組菌株M0能夠分泌發(fā)酵表達赤霉烯酮降解酶ZHD101．

2.2 ZHD101高效分泌表達的K.marxianus菌株誘變篩選

為了進一步提高ZHD101的表達量，用UV和60Co-γ聯(lián)合誘變的方法，對重組菌株FIM/N112-zhd101-M0進行誘變，60Co-γ誘變的致死率為99.97%．隨后，利用24孔板微量培養(yǎng)與HPLC相結(jié)合的方法，篩選了4×103個突變菌株(圖2(a))，獲得了1株ZEN水解活性顯著提高的突變菌株FIM/N112-zhd101-M1(M1菌株)．M1發(fā)酵液上清的ZEN水解率明顯高于M0，反應(yīng)2h ZEN水解率為42%，而相同條件下反應(yīng)M0水解率僅為13%，ZEN水解活力提高了2倍以上，從保留時間6min處的產(chǎn)物峰也可以發(fā)現(xiàn)M1菌株的ZEN水解率也明顯高于M0(圖2(b),(c))．通過PCR擴增出M1菌株中的zhd101基因并測序，發(fā)現(xiàn)該突變株中zhd101基因并未發(fā)生突變，說明突變株M1發(fā)酵上清液水解ZEN活力的提高，是由于該菌株ZHD101的分泌表達量提高引起的．

進一步分析比較了突變菌株與出發(fā)菌株的質(zhì)粒穩(wěn)定性，結(jié)果如圖2(d)所示，菌株M0在培養(yǎng)過程中質(zhì)粒丟失率較高，培養(yǎng)第10代后，質(zhì)粒丟失率達20%左右，到30代時質(zhì)粒丟失率已經(jīng)高達80%以上．而突變菌株M1在培養(yǎng)的40代內(nèi)，都沒有檢測到質(zhì)粒的丟失．這一結(jié)果提示了誘變篩選后ZHD101表達分泌量的提高，可能與其質(zhì)粒穩(wěn)定性有關(guān)．而質(zhì)粒穩(wěn)定性提高的分子機制，還需要進一步研究．

圖2 ZHD101高效表達突變株的篩選與鑒定Fig.2 High-throughput screening and verification for the mutant characterized by effectively expression of ZHD101(a) ZHD101高效分泌表達的K.marxianus突變株的篩選，熱譜圖展示了誘變后各克隆發(fā)酵液上清的ZEN水解能力；(b) HPLC比較了M0與M1發(fā)酵液上清的ZEN水解能力(WT為陰性對照組)，ZEN為標準品圖譜，0h、1h、2h、6h分別為反應(yīng)對應(yīng)時間后的樣品檢測圖譜；(c) 利用ZEN峰面積定量得到M0和M1分泌表達的ZHD101的降解ZEN的效率；(d) 重組菌株M0及高產(chǎn)突變菌株M1中表達質(zhì)粒的穩(wěn)定性分析．

2.3 馬克斯克魯維酵母重組表達的ZHD101降解發(fā)霉玉米ZEN的效果分析

赤霉烯酮是玉米、小麥、大麥等小顆粒谷物作物的污染毒素，其中霉變玉米的檢出率高達45%．為了檢測重組表達的ZHD101對霉變玉米中ZEN的脫毒效果，我們用M1菌株的發(fā)酵上清液(粗酶液)直接作用發(fā)霉玉米．每克霉變玉米中加入10mL的ZHD101粗酶液，充分反應(yīng)12h后，用液相色譜HPLC檢測ZEN的殘留．結(jié)果顯示，保留時間12min的ZEN吸收峰在反應(yīng)12h后基本消失(圖3)，而對照組K.marxianusFIM-1(uraΔ)(WT)發(fā)酵上清液處理霉變玉米后，其ZEN的含量并未發(fā)生變化，說明馬克斯克魯維酵母重組制備的ZHD101可用于去除發(fā)霉玉米中的ZEN．

圖3 HPLC檢測重組蛋白ZHD101對發(fā)霉玉米樣本中的ZEN的水解活性Fig.3 HPLC analysis to assess the ZHD101 derived detoxification of ZEN in the moldy cornHPLC分析突變株FIM/N112-zhd101-M1(M1)發(fā)酵液上清對發(fā)霉玉米樣本中的ZEN的水解效果(WT為轉(zhuǎn)入空載質(zhì)粒的陰性對照組)，ZEN為標準品圖譜，0h、12h分別為反應(yīng)對應(yīng)時間后的樣品檢測圖譜．

3 討 論

據(jù)統(tǒng)計，全球約72%的飼料或飼料原料被霉菌毒素單獨或聯(lián)合污染，其中，由禾谷鐮刀菌次級代謝產(chǎn)生的玉米赤霉烯酮(ZEN)是主要污染物[2,15]．ZEN的化學(xué)結(jié)構(gòu)類似于哺乳動物β-雌二醇，可在體內(nèi)被還原為類雌激素活性更強的α-玉米赤霉烯醇(α-Zearalanol, α-ZEL)和低活性的β-玉米赤霉烯醇(β-Zearalanol, β-ZEL)兩種非對稱立體異構(gòu)體．盡管機體內(nèi)的ZEN及代謝物可在尿苷二磷酸葡糖醛酸轉(zhuǎn)移酶的催化下與葡糖醛酸結(jié)合為共軛化合物，并隨尿或膽汁排出體外，但其類雌激素活性依舊會擾亂機體內(nèi)穩(wěn)態(tài)，影響靶器官或組織的結(jié)構(gòu)與生理機能．臨床研究表明，ZEN可導(dǎo)致細胞DNA損傷和染色體畸變、生物膜脂質(zhì)過氧化和免疫抑制等毒性，甚至隨食物鏈進入人體誘發(fā)多種惡性腫瘤，嚴重威脅著人類的健康與社會的發(fā)展[16]．為此，人們嘗試利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)，將脫毒基因?qū)氲焦任镒魑镏校@得了具有ZEN抗性的水稻和玉米植株，降低赤霉烯酮污染風(fēng)險[17-19]．

粉紅黏帚霉G.roseum內(nèi)酯水解酶ZHD101可在較為溫和的條件下催化ZEN水解為無雌激素效應(yīng)的羥基酮，這無疑為實現(xiàn)霉菌毒素的生物脫毒提供了一種可能[12,17]．該赤霉烯酮降解酶已經(jīng)在大腸桿菌、釀酒酵母等表達系統(tǒng)實現(xiàn)了重組表達[18-20]．本研究采用食品安全級GRAS(Generally Recognized as Safe)馬克斯克魯維酵母作為表達宿主菌，構(gòu)建了分泌表達ZHD101的重組菌，實現(xiàn)了ZHD101分泌表達，且表達出的ZHD101能夠水解ZEN．在此基礎(chǔ)上，為了提高ZHD101酶蛋白的表達水平，對其進行了UV和60Co-γ聯(lián)合誘變處理和篩選，獲得了一株發(fā)酵液上清ZEN水解活力提高3倍以上的突變株，且從突變株擴增的zhd101基因序列未發(fā)生突變，提示水解能力的提高主要是ZHD101蛋白表達分泌量的提高所引起的．此外，我們發(fā)現(xiàn)該突變株中的質(zhì)粒經(jīng)40代后仍然保持穩(wěn)定，推測ZHD101蛋白產(chǎn)量的提升可能與其質(zhì)粒穩(wěn)定性有關(guān)，但具體分子機制還需通過更深入的基因組重測序和比較基因組學(xué)分析進行揭示．

利用突變株M1制備的ZHD101粗酶液對發(fā)霉玉米樣本中的ZEN表現(xiàn)出較理想的水解效果，未來可考慮應(yīng)用于對污染谷物的規(guī)?；拿摱咎幚?，具有安全、環(huán)保的特征．盡管ZHD101通過將ZEN大環(huán)上的內(nèi)酯鍵斷裂，產(chǎn)生無雌激素活性的水解產(chǎn)物，但是如何將該水解產(chǎn)物完全降解成小分子物質(zhì)，還需要尋找新的降解酶，與ZHD101協(xié)同作用，實現(xiàn)ZEN的完全降解．

致謝： 感謝華東理工大學(xué)牟伯中教授在60Co-γ輻射誘變實驗上的幫助與指導(dǎo)．

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ExpressionofZHD101inKluyveromycesmarxianusandtheMutationBreedingofHigh-FieldStrain

WANGRenfeng1,2,ZHOUJungang2,3,HUXiaojian1,2,XUTianyu1,2,LüHong1,2

(1.StateKeyLaboratoryofGeneticEngineering,SchoolofLifeSciences,FudanUniversity,Shanghai, 200438,China;2.ShanghaiEngineeringResearchCenterofIndustrialMicroorganisms,Shanghai, 200438,China;3.ShanghaiTianfuBiologicalTechnologyCo.,LTD,Shanghai, 200438,China)

Zearalenone(ZEN), a nonsteroid estrogenic mycotoxin, produced by numerous Fusarium species in several moldy cereals, causes hyperestrogenic syndrome and homeostasis disorder of livestock and poses genotoxicity and carcinogenicity in mammals and humans. ZHD101 is a lactone hydrolase fromG.roseumthat could convert ZEN to a far less estrogenic product by hydrolyzing the lactone bond. In this study, we cloned and expressed the zhd101 gene in the GRAS(Generally Recognized as Safe)yeastK.marxianusfor producing the ZHD101 hydrolase in vitro. To elevate the expression of heterologous zhd101 in the recombinant, the UV-60Co-γ irradiation mutagenesis was introduced and a mutant possessed tripled hydrolytic activity and high plasmid stability was isolated using a high-throughput screening system. The detoxification capability of the recombinant ZHD101 was further investigated using the moldy corn. HPLC analysis showed that ZHD101 lactonase from the FIM/N112-zhd101-M1 mutant could hydrolyze ZEN in the moldy corn samples completely after 12h incubation at room temperature, suggesting that the recombinantK.marxianusstrain could be applied to the detoxification of moldy cereals.

Zearalenone; ZHD101;Kluyveromycesmarianus

0427-7104(2017)04-0431-07

2016-08-02

國家高技術(shù)研究發(fā)展計劃項目(2013AA102803B，2014AA021301)；上海市科委基地項目(13DZ2252000)

王壬豐(1991—)，男，碩士研究生；呂 紅，女，教授，通信聯(lián)系人，E-mail： honglv@fudan.edu.cn.

Q814.9

A