葛立傲，禹利芳，伍建榕，劉林妹，馬煥成，王以靜

( 1.西南林業(yè)大學(xué)林學(xué)院 云南省高校森林災(zāi)害預(yù)警控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南 昆明 650224； 2.西南林業(yè)大學(xué) 國家林業(yè)局西南生物 多樣性保育重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南 昆明 650224； 3.云南省元江縣林業(yè)局，云南 元江 653300)

干熱河谷牛角瓜頂芽枯死病 病原鑒定及其生物學(xué)特性研究

葛立傲1，禹利芳1，伍建榕1，劉林妹1，馬煥成2，王以靜3

( 1.西南林業(yè)大學(xué)林學(xué)院 云南省高校森林災(zāi)害預(yù)警控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南 昆明 650224； 2.西南林業(yè)大學(xué) 國家林業(yè)局西南生物 多樣性保育重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南 昆明 650224； 3.云南省元江縣林業(yè)局，云南 元江 653300)

按分離—接種—再分離的柯赫法則對云南干熱河谷人工栽培牛角瓜CalotropisgiganteanL.上的一種新的頂芽枯死病害進(jìn)行病原菌分離、鑒定及其致病性測定,根據(jù)培養(yǎng)性狀、形態(tài)特征及分子鑒定確定該病原菌為柱孢屬Cylindrocarponpauciseptatum真菌。生物學(xué)特性研究表明：該菌生長的最佳C 源為葡萄糖,對N 源和維生素均不能很好地利用,在PDA 培養(yǎng)基上生長的適宜溫度為15～25 ℃,最佳溫度為20 ℃,最佳pH 值為6,分生孢子在相對濕度100%時(shí)萌發(fā)?？梢酝ㄟ^控制溫度和土壤pH值來降低牛角瓜頂芽枯死病的發(fā)病率，提高牛角瓜的產(chǎn)量。

牛角瓜;頂芽枯死病;Cylindrocarponpauciseptatum；病原鑒定；生物學(xué)特性；干熱河谷

牛角瓜CalotropisgiganteanL.是蘿藦科Asclepiadaceae牛角瓜屬的一種常綠小灌木，整株富含乳汁，葉對生，倒卵狀長圓形或者橢圓狀長圓形，幼嫩的葉子背面被白色絨毛，老葉無絨毛。花淡紫色，聚傘花序，全年開花結(jié)果。

牛角瓜廣泛分布在亞洲和非洲的熱帶、亞熱帶地區(qū)。在我國主要分布于四川、廣西、廣東、海南及云南干熱河谷地區(qū)的元陽、元江、建水、東川等地。因牛角瓜的多用途，即具有藥用、生物藥劑、能源植物以及紡織原材料開發(fā)的價(jià)值，在干熱河谷地區(qū)大規(guī)模集約化種植。國外由于樹種、樹齡結(jié)構(gòu)單一，發(fā)生過大規(guī)模的流行病害[1-3]，國內(nèi)目前對于牛角瓜的病害研究處于空白階段。2012年9月，在云南省元陽縣賽刀村牛角瓜種植基地近20 hm2內(nèi)調(diào)查，發(fā)病率100%，病情指數(shù)68。作者對云南干熱河谷地區(qū)元陽及元江縣牛角瓜頂芽枯死病調(diào)查，通過對病原菌形態(tài)學(xué)觀察及病原菌核糖體DNA ITS序列分析，確定引起牛角瓜頂芽枯死病的病原是柱孢屬Cylindrocarponpauciseptatum真菌，同時(shí)研究了病原菌生物學(xué)特性[4-6]。

1 材料與方法

1.1 研究材料 在云南省元陽縣賽刀村隨機(jī)采集牛角瓜50株，供試菌株 2014年4月分離自野外采集的具典型頂芽枯死癥狀的牛角瓜病組織。

PDA培養(yǎng)基：馬鈴薯(去皮)200 g,瓊脂20 g,葡萄糖20 g,水1 000 mL。用于致病性測定及生物學(xué)特性研究。

1.2 病原菌分離與純化 將采回的牛角瓜病部組織用自來水沖洗干凈，在病健交界處切取5 mm×5 mm的組織塊，放于75%的酒精中浸泡10～20 s，取出放入0.1%升汞溶液浸泡3～5 min，用蒸餾水清洗3～4次，除去殘留的消毒劑(否則影響病菌生長),接種到PDA培養(yǎng)基平皿中，在25 ℃黑暗條件下培養(yǎng)。待長出菌落后，通過挑取菌絲尖端方法對分離的病原菌進(jìn)行純化,純化后的病原菌保存在-4 ℃冰箱，備用[8-9]。

1.3 致病性測定 將2年生的健康牛角瓜嫩葉經(jīng)75%酒精表面消毒,用病葉分離所得的菌株接種。對已產(chǎn)孢的真菌配制成一定濃度的孢子懸浮液(40×10倍20個(gè)孢子,并摻有一些菌絲),對未產(chǎn)孢的真菌取菌絲塊( 直徑約為0.5 cm)接種[10]。

接種采用燙傷和針刺兩種方法，處理組30片嫩葉,對照組為15片。針刺法用接種針刺傷表面已消毒的牛角瓜頂尖嫩葉,然后用滅過菌的棉花蘸取菌塊接種上去，塑料薄膜保濕培養(yǎng)；對照直接用蘸滅菌水的無菌棉花接種。燙傷接種只是接種在輕微燙傷的頂尖嫩葉上，其他均與針刺法相同[11-12]。

1.4 病原菌鑒定

1.4.1 病原菌形態(tài)學(xué)鑒定 選用癥狀明顯的牛角瓜發(fā)病組織采用徒手切片法制作臨時(shí)玻片，鏡檢觀察病原菌形態(tài)特征、顯微攝影和測量[7]。

1.4.2 病原菌分子鑒定

基因組 DNA 提?。簩⒎蛛x和接種確定的牛角瓜芽枯病病原菌菌絲接種到新的培養(yǎng)皿上，25 ℃條件下培養(yǎng)7 d，用OMEGA 公司產(chǎn)品Forensic DNA kit試劑盒按步驟提取DNA，試劑盒由昆明碩陽生物公司提供。

rDNA ITS區(qū)序列擴(kuò)增：用真菌核糖體基因轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)的通用引物ITS1(5‘TCCGTAGGTGAACCTGCGG3′)和ITS4 (5’TCCTCCGCTTATTGATATGC3’)擴(kuò)增ITS區(qū)間和5.8S rDNA。反應(yīng)體系以50 μL計(jì)算：模板DNA 2 μL,引物ITS1,ITS4各1.5 μL,Mix25 μL,ddH2O 20 μL。反應(yīng)程序：94 ℃預(yù)變性3 min；進(jìn)入循環(huán)，94 ℃變性30 s，56 ℃退火40 s，72 ℃延伸50 s，40個(gè)循環(huán)；最后72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。取4 μL反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，完成后，將膠板取出放入凝膠成像系統(tǒng)中，用GeneSnap軟件進(jìn)行拍照觀察,用吸附柱式PCR產(chǎn)物回收試劑盒(上海博光生物科技有限公司)純化剩余的PCR產(chǎn)物，提交云南碩陽生物公司測序,序列通過Genbank進(jìn)行同源性比對。

測序及rDNA ITS序列分析：測序后的ITS1、ITS4 和5.8 S rDNA序列用Clustal X程序進(jìn)行rDNA序列的聯(lián)配(alignment)比較、編輯，然后提交GenBank。將序列與GenBank中的柱孢屬的Cylindrocarponpauciseptatum的ITS1、ITS2 和5.8 S rDNA序列進(jìn)行同源性比較。

1.5 生物學(xué)特性測定

(1)溫度。采用平板法進(jìn)行營養(yǎng)生長試驗(yàn)，采用載片法進(jìn)行孢子萌發(fā)試驗(yàn)。溫度設(shè)10，15，20，25，28，30，32，35，40 ℃共9個(gè)梯度，每個(gè)水平設(shè)5次重復(fù)，菌落測量時(shí)間為3 d，孢子萌發(fā)測定時(shí)間為12 h。

(2)濕度。采用載片法進(jìn)行孢子萌發(fā)試驗(yàn)，濕度調(diào)節(jié)采用小容器法，調(diào)節(jié)溶液為濃硫酸，設(shè)50%,65%,70%,90%,100%共5個(gè)濕度梯度，每個(gè)梯度設(shè)5次重復(fù)。

(3)pH。采用平板法進(jìn)行營養(yǎng)生長試驗(yàn)，采用載片法進(jìn)行孢子萌發(fā)試驗(yàn)，調(diào)節(jié)pH溶液為磷酸緩沖液，pH設(shè)4，5，6，7，8，9，10共7個(gè)梯度，每個(gè)梯度設(shè)5個(gè)重復(fù)。

(4)光照。采用平板法進(jìn)行促進(jìn)產(chǎn)孢試驗(yàn)，設(shè)計(jì)光照時(shí)間為0，10，12，14，24 h，共5個(gè)梯度。每個(gè)梯度設(shè)5個(gè)重復(fù)，培養(yǎng)直至產(chǎn)孢為止。

(5)營養(yǎng)。營養(yǎng)生長采用平板法，用Czapek培養(yǎng)基分別以等碳當(dāng)量的葡萄糖、乳糖、可溶性淀粉取代蔗糖，另設(shè)無碳培養(yǎng)基CK；氮源則以等氮當(dāng)量的牛肉膏、硫酸銨取代硝酸鉀，另設(shè)無氮培養(yǎng)基CK。孢子萌發(fā)采用載片法，共設(shè)置1%硝酸鉀、1%葡萄糖、無菌水3種處理，每種處理設(shè)置5個(gè)重復(fù)。

1.6 數(shù)據(jù)分析 數(shù)據(jù)分析使用SPSS 13.0中的一元線性模型中的Univariated方法完成。

2 結(jié)果與分析

2.1 癥狀 發(fā)病初期頂芽基部出現(xiàn)褪綠并呈水漬狀，逐漸發(fā)展為黃色至暗褐色病斑，不久，頂芽發(fā)黃、變褐，病芽不能展葉、開花，呈半枯死或枯死狀，產(chǎn)生許多小黑點(diǎn)，后期，病害向下延伸，出現(xiàn)枯梢癥狀，在枯死部分的下方產(chǎn)生大量黑色霉點(diǎn)。病斑后期下陷，流膠，見圖1。

圖1 牛角瓜頂芽枯死病癥狀

2.2 病原菌鑒定

形態(tài)學(xué)鑒定:枯梢上的黑色霉點(diǎn)經(jīng)徒手切片、顯微觀察，鑒定牛角瓜頂芽枯死病的病原菌為柱孢屬Cylindrocarponpauciseptatum真菌，有性世代為赤殼屬Nectriasp.。

分離培養(yǎng)病原菌形態(tài)特征：在PDA 上生長很快、無色或淡色,菌落呈柔軟的絨毛狀、氈狀,以單?；蚍稚咦幼绞疆a(chǎn)孢。瓶梗圓柱形或針形,具有開放的頂孔和短的領(lǐng)狀物,從中產(chǎn)生無色、壁光滑的粘質(zhì)狀分生孢子。大分生孢子,圓柱形,兩端鈍圓,直或彎曲,有1個(gè)或多個(gè)橫隔膜。

分子鑒定：病原菌用ITS-PCR引物進(jìn)行序列測定，獲得660 bp的擴(kuò)增片段序列。在GenBank上blast，發(fā)現(xiàn)病原菌株與序列柱孢屬的Cylindrocarponpauciseptatum(GenBank登錄號(hào)為JF735305)同源性極高，相似性達(dá)99%，進(jìn)一步證實(shí)了分離于牛角瓜的頂芽枯死病病原菌是柱孢屬Cylindrocarponpauciseptatum。

2.3 致病性測定 病原菌C.pauciseptatum經(jīng)人工接種,9 d后在嫩葉上產(chǎn)生變色反應(yīng),15 d后發(fā)病癥狀與采集的人工林牛角瓜頂芽枯死病的癥狀基本一致,切片鏡檢發(fā)現(xiàn)，病部組織內(nèi)有菌絲存在。同時(shí)將發(fā)病嫩葉進(jìn)行病原分離,僅得到1種真菌,與Cylindrocarponpauciseptatum的培養(yǎng)性狀相同,病原菌再經(jīng)分子檢測與前相同。

2.4 病原菌生物學(xué)特性

2.4.1 溫度對病原菌菌絲生長的影響 由圖2可見，牛角瓜頂芽枯死病病原菌C.pauciseptatum在5～35 ℃下均能生長,適溫為15 ～ 25 ℃,最適為20 ℃;低于10 ℃或者高于35 ℃時(shí)，可以明顯看到菌落直徑急劇減小。

圖2 不同溫度對病原菌生長的影響

2.4.2 光照對病原菌菌絲生長的影響 在持續(xù)光照條件下菌落生長非常好，黑暗或間斷性光照條件下，生長的菌落直徑只是持續(xù)光照的三分之一，可見持續(xù)光照對該菌株生長有明顯的促進(jìn)作用(圖3)。

圖3 光照對病原菌的影響

2.4.3 酸堿度對病原菌的影響 該病原菌生長的pH 值范圍在3～10,適宜的pH 值為5～7,最適pH 值為6.2 左右；因此，病原菌適合在弱酸性環(huán)境中生長，強(qiáng)酸性或者強(qiáng)堿性的環(huán)境都不適合，甚至無法生長。在弱酸性和弱堿性的環(huán)境中可以生長，并且隨著酸堿性的增加生長速度減弱，生長的菌落直徑也減小(圖4)。

圖4 不同酸堿度對病原菌的影響

2.4 不同碳源對病原菌的影響 病原菌菌株在不同碳源的幾種培養(yǎng)基上都可以生長，并且生長良好，但相比之下，乳糖制成的培養(yǎng)基對該病原菌生長有較明顯的抑制作用(圖5)。

注：圖中R，ZT，KR，M，G分別表示用乳糖、蔗糖、可溶性淀粉、麥芽

糖、甘露醇代替葡萄糖的Czapek培養(yǎng)基

圖5不同碳源對病原菌的影響

3 結(jié)論與討論

經(jīng)過致病性測定、形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)鑒定，確定牛角瓜頂芽枯死病病原菌為柱孢屬的Cylindrocarponpauciseptatum。

國外柱孢屬真菌C.pauciseptatum的生物學(xué)特性方面的報(bào)道比較少,國內(nèi)也不多。1985年劉梅娟 等[13]報(bào)道了銹腐病菌對不同碳源、氮源的利用情況，高書硯 等[14]報(bào)道了人參銹腐菌10 個(gè)方面的生物學(xué)特性的初步研究，還沒見到該菌這方面的研究[13-14]。研究表明，該病原菌在持續(xù)光照條件下生長最好；適合的酸堿度在pH6左右，最適范圍pH5～7；在 15～25℃都生長良好；不同碳源(除了乳糖)的培養(yǎng)基中生長均良好，葡萄糖的培養(yǎng)基生長最好，蔗糖次之；自然光照射下生長良好,連續(xù)黑暗或間斷性光照不利于生長。

鑒于該病原菌的生物學(xué)特性，在牛角瓜頂芽枯死病防控過程中，尤其圃地，可以通過控制光照條件、土壤pH值來預(yù)防牛角瓜頂芽枯死病的發(fā)生。

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ThepathogenidentificationanditsbiologicalcharacteristicsofapicalbudblightofCalotropisgiganteaninxerothermicvalleyareas/

Ge Li′ao.et al.

(Key Laboratory of Forest Disaster Warning and Control in Yunnan Higher Education Institutions,College of Forestry,Southwest Forestry University,Kunming 650224,China)

According to Koch′s postulates of isolation-inoculation-reisolation,isolation and pathogenicity identification on a new kind of disease cultivated inCalotropisgiganteanL.were carried out in the dry-hot valleys (DHV).According to cultivate character and morphological characteristics and molecular identification,column spore belongs toCylindrocarponpauciseptatum.The results showed that the best C source for the bacteria was glucose,the N source and vitamins couldn′t be utilized well,The proper temperature was 15 to 25 ℃ on PDA medium,optimum temperature was 20 ℃,optimal pH value was 6,conidium germinated only when the relative humidity was 100%.

CalotropisgiganteanL;bud blight;Cylindrocarponpauciseptatum;pathogen identification;biological characteristics;dry-hot valleys (DHV)

2016-04-15；

2016-06-07

國家林業(yè)公益行業(yè)專項(xiàng)“干熱河谷牛角瓜人工林定向培育關(guān)鍵技術(shù)研究(201304810)”；國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31260175)；云南省高校干熱河谷植被恢復(fù)創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)；“云南省重點(diǎn)學(xué)科森林保護(hù)學(xué)”(XKZ200905)，云南省高等學(xué)校森林病蟲害綜合治理教學(xué)團(tuán)隊(duì)

葛立傲(1991—)男，安徽蕪湖人，在讀碩士，主要從事園林植物保護(hù)學(xué)和資源微生物利用研究，E-mail：geliaogao@163.com

伍建榕，教授，主要從事森林病理學(xué)和資源微生物利用研究，E-mail：wujianrong63@aliyun.com。

S763.15

A

1671-0886(2017)03-0038-04

(責(zé)任編輯 楊靜莉)