趙永華，趙金良，陳曉武，王 燕，魏繼海，傘桂寶，簡(jiǎn)偉業(yè)

( 1.上海海洋大學(xué) 農(nóng)業(yè)部淡水水產(chǎn)種質(zhì)資源重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 201306; 2.廣州市番禺區(qū)農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所，廣東 廣州 511450; 3.茂名市偉業(yè)羅非魚良種場(chǎng)，廣東 茂名 525000 )

尼奧羅非魚雜種性別類型與性腺發(fā)育初步研究

趙永華1，趙金良1，陳曉武1，王 燕1，魏繼海1，傘桂寶2，簡(jiǎn)偉業(yè)3

( 1.上海海洋大學(xué) 農(nóng)業(yè)部淡水水產(chǎn)種質(zhì)資源重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 201306; 2.廣州市番禺區(qū)農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所，廣東 廣州 511450; 3.茂名市偉業(yè)羅非魚良種場(chǎng)，廣東 茂名 525000 )

通過組織學(xué)方法，研究了0.5～4.5月齡尼奧羅非魚雜種(尼羅羅非魚♀×奧利亞羅非魚♂)的性腺發(fā)育特征與性別類型。結(jié)果表明，0.5月齡尼奧羅非魚原始性腺尚未分化；1月齡，精巢中原始生殖細(xì)胞開始分化成精原細(xì)胞；2.5月齡出現(xiàn)初級(jí)精母細(xì)胞；3月齡出現(xiàn)次級(jí)精母細(xì)胞；3.5～4月齡精巢中存在不同發(fā)育階段的生殖細(xì)胞，壺腹空腔中分散著稀疏的精子；4.5月齡精巢壺腹腔內(nèi)密集大量精子。在2.5、3.5、4、4.5月齡抽樣中，均檢測(cè)到雌魚，2.5～3.5月齡卵巢以第Ⅱ時(shí)相卵母細(xì)胞為主；4～4.5月齡卵巢以第Ⅲ時(shí)相卵母細(xì)胞為主。研究結(jié)果初步表明，尼奧羅非魚雜種中觀察到雄性、雌性兩種性別類型，以雄性性別為主；雜種雌、雄魚的性腺均能正常發(fā)育。

尼奧羅非魚；性別類型；性腺發(fā)育；組織切片

羅非魚(Oreochromis)因其具有食性雜、生長(zhǎng)快、繁殖力和抗病力強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，現(xiàn)已成為世界性養(yǎng)殖魚類[1]。由于羅非魚雄性比雌性生長(zhǎng)速度快，為此，生產(chǎn)上一般采用雌性尼羅羅非魚(O.niloticus)和雄性?shī)W利亞羅非魚(O.aureus)種間雜交的方式獲得雄性率高的雜交一代——尼奧羅非魚[2]。

有關(guān)尼奧羅非魚雄性率高的性別形成機(jī)制，早期認(rèn)為，尼羅羅非魚是雄性異質(zhì)型性染色體，雄性由異質(zhì)的XY性染色體決定，雌性由同質(zhì)的XX性染色體決定[3]；奧利亞羅非魚是雌性異質(zhì)型性染色體，雄性由同質(zhì)的ZZ性染色體決定，雌性由異質(zhì)的ZW性染色體決定[4]，因此，雜交一代為XZ型雄性。除性染色體外，Avtalion等[5]提出，一條常染色體上的一對(duì)等位基因(AA或aa)影響性染色體，尼羅羅非魚雌性為AAXX，雄性為AAXY；奧利亞羅非魚雌性為aaZW，雄性為aaZZ，這個(gè)基因平衡模型假設(shè)，當(dāng)性別決定有關(guān)的染色體和常染色體位點(diǎn)的作用超過某一閾值時(shí)，個(gè)體發(fā)育為雄性，低于這一閾值時(shí)則為雌性。

目前研究表明，大多數(shù)魚類不存在性染色體，性腺分化和發(fā)育受相關(guān)基因共同調(diào)控。羅非魚中已發(fā)現(xiàn)與性別分化相關(guān)的基因有很多，且定位于不同的染色體上，如尼羅羅非魚位于LG12染色體上的dmrt1基因，LG23染色體上的amh基因，LG1染色體上的cyp19a1基因，以及一些未成功定位的基因，這些單個(gè)或者多個(gè)基因共同參與羅非魚性別決定與分化調(diào)控[6]。此外，環(huán)境因子如溫度[7]、類固醇激素[8]等對(duì)羅非魚性別分化和發(fā)育也都有顯著影響。

已有的研究表明，尼羅羅非魚早期性腺發(fā)育中出現(xiàn)兩性性腺現(xiàn)象[9]，也有學(xué)者提出雌性致死假設(shè)觀點(diǎn)，為進(jìn)一步探明尼奧羅非魚雜交種性別偏離及性腺發(fā)育，本研究通過對(duì)0.5～4.5月齡尼奧羅非魚性腺組織學(xué)特征連續(xù)觀察，以期揭示尼奧羅非魚的性別類型、性腺發(fā)育特征。

1 材料與方法

尼奧羅非魚魚苗2015年5月28日采自廣州市番禺區(qū)農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所良種繁殖場(chǎng)，于上海海洋大學(xué)羅非魚種質(zhì)資源試驗(yàn)站的7.8 m×3.9 m×1.5 m水泥池中養(yǎng)殖，定時(shí)足量投喂，每個(gè)水泥池放養(yǎng)500尾，用羅非魚專用配合飼料養(yǎng)殖。

每隔15 d采樣一次，每次隨機(jī)采集30～40尾。常規(guī)生物學(xué)測(cè)量體長(zhǎng)、體質(zhì)量。幼魚前期，性腺細(xì)小無法剝?nèi)。厝⌒韵偎谲|干部位，波恩氏液固定；當(dāng)性腺可以剝?nèi)r(shí)，取完整性腺固定。組織經(jīng)石蠟包埋，制成5～8 μm切片，蘇木精—伊紅染色，中性樹膠封片，于顯微鏡(Nikon DS-Ril)觀察拍照。用目微尺測(cè)量性腺橫截面的寬度和厚度以及生殖細(xì)胞的大小、核徑。卵巢、精巢的發(fā)育分期參照劉筠[10]分期標(biāo)準(zhǔn)。

試驗(yàn)所得數(shù)據(jù)用Excel 2013軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。

2 結(jié) 果

2.1 尼奧羅非魚的生長(zhǎng)

0.5～4月齡尼奧羅非魚體長(zhǎng)與體質(zhì)量隨月齡的增加而顯著增加，體質(zhì)量增長(zhǎng)量隨月齡的增加而增大(表1)。

表1 尼奧羅非魚生長(zhǎng)

2.2 尼奧羅非魚性腺發(fā)育

在9次采樣中，絕大多數(shù)為雄性個(gè)體，雌性個(gè)體僅在2.5、3.5、4、4.5月齡中檢測(cè)到，且在這4次采樣中分別只采集到1尾雌性個(gè)體，雄性率高達(dá)98.8%。尼奧羅非魚性腺大小隨生長(zhǎng)而增大，同一批次采樣的卵巢體積比精巢大(表2)。

2.2.1 性腺未分化期

0.5月齡：性腺細(xì)小，肉眼無法辨別，性腺處于原始性腺階段。在顯微鏡下可觀察到性腺原基上布滿原始生殖細(xì)胞(3.21～5.15 μm)，不能明顯區(qū)分精巢、卵巢(圖1a)。

2.2.2 精巢發(fā)育

Ⅰ期精巢(1～1.5月齡)：精巢肉眼無法分辨，體積較小，白色。橫切面呈橢圓形，生殖細(xì)胞核較大，染色較深，細(xì)胞質(zhì)色質(zhì)較淡。1月齡，原生殖細(xì)胞開始分裂為精原細(xì)胞(圖1b)；1.5月齡，精原細(xì)胞數(shù)目增多，無定向的分散在結(jié)締組織中，精原細(xì)胞直徑7.25～8.15 μm(圖1c)。

Ⅱ期精巢(2月齡)：精巢體積增大1倍，呈白色線狀。部分單層精原細(xì)胞集中排列，形成精細(xì)小管，部分有管腔。精細(xì)小管大多呈圓形或橢圓形，直徑13.19～18.21 μm，其內(nèi)的精原細(xì)胞細(xì)胞核位于中央或稍微偏離中心，精原細(xì)胞直徑6.15～7.94 μm，核徑1.6～2.3 μm(圖1d)。

Ⅲ期精巢(2.5月齡)：精巢成肉色圓柱狀，表面有細(xì)小血管分布，體積繼續(xù)增大。精巢中產(chǎn)生數(shù)量較多的精原細(xì)胞，精小葉內(nèi)出現(xiàn)空腔，精原細(xì)胞、初級(jí)精母細(xì)胞沿精小葉邊緣單層或多層排列，初級(jí)精母細(xì)胞直徑6.32～8.25 μm，核徑3.21～4.19 μm。精巢中形成1個(gè)大型空腔和1～2個(gè)小型空腔(圖1e)。

Ⅳ期精巢(3～4月齡)：3月齡，精巢肉白色，扁平三棱柱狀，表面血管分布明顯。精小葉增大，其內(nèi)可見由初級(jí)精母細(xì)胞、次級(jí)精母細(xì)胞及精細(xì)胞組成的精小囊，次級(jí)精母細(xì)胞直徑3.14～4.21 μm，核徑2.05～3.13 μm，此時(shí)小葉腔中已存在少量的精子，小型空腔數(shù)有所增加(圖1f)。3.5～4月齡，精巢呈肉色或肉白色，精巢背部帶有縱橫血管。細(xì)胞分裂較為明顯，部分精子通過精細(xì)小管壁經(jīng)結(jié)締組織向小葉空腔游動(dòng)，腔內(nèi)分散著稀疏的精子(圖1g,h)。

表2 尼奧羅非魚不同發(fā)育階段性腺寬度和厚度

Ⅴ期精巢(4.5月齡)：精巢體積顯著增大，呈乳白色，擠壓腹部可擠出精子。小葉腔中一些相鄰精小囊壁互相融合，小葉空腔很大，其內(nèi)充滿成熟的精子。精子嗜堿性極強(qiáng)，被蘇木精染成深藍(lán)色，直徑2.1～2.5 μm(圖1i)。

2.2.3 卵巢發(fā)育

Ⅱ期卵巢(2.5～3.5月齡)：2.5月齡，卵巢呈白色細(xì)線狀，肉眼無法辨認(rèn)，性腺末端未見血管分布。卵母細(xì)胞大小均勻，圓形不規(guī)則排列，細(xì)胞核居中央，占卵細(xì)胞一半左右，卵細(xì)胞直徑36.18～44.07 μm，核徑16.79～22.23 μm，核仁10個(gè)以上，不規(guī)則地分散在細(xì)胞核中，卵細(xì)胞外具有一層濾泡膜，以第Ⅱ時(shí)相卵母細(xì)胞為主(圖1j)。在3.5月齡卵巢中，卵母細(xì)胞直徑33.18～57.07 μm，核徑17.83～26.15 μm，出現(xiàn)少量卵黃核(圖1k)。

Ⅲ期卵巢(4～4.5月齡)：4月齡，卵巢增大，呈囊狀，表面可見血管，肉眼已能夠看清細(xì)小的卵粒。卵母細(xì)胞不規(guī)則的排列在卵巢基質(zhì)中，卵徑50～110 μm，核徑20～50 μm，核仁數(shù)增多沿核膜分布，外側(cè)由一層濾泡膜發(fā)育成二層濾泡膜，開始出現(xiàn)輻射帶，切片中以第Ⅲ時(shí)相卵母細(xì)胞為主，有少部分第Ⅱ時(shí)相卵母細(xì)胞(圖1l)。4.5月齡，卵巢表面血管增多，卵徑為50～200 μm，核徑40～95 μm，切片上出現(xiàn)少數(shù)Ⅳ時(shí)相卵母細(xì)胞，輻射帶增厚，細(xì)胞質(zhì)中開始出現(xiàn)許多空泡，卵黃顆粒數(shù)量和體積增加(圖1m)。

3 討 論

3.1 性腺未分化期

性腺形成的標(biāo)志是原始生殖細(xì)胞的出現(xiàn)。本研究中，0.5月齡尼奧羅非魚的性腺原基上已布滿原始生殖細(xì)胞，原始性腺已經(jīng)形成，尚處于性腺未分化期，此時(shí)還不能區(qū)分精巢和卵巢，性腺平均寬度為(26.62±3.50) μm，平均厚度為(15.25±1.81) μm，略低于同期的尼羅羅非魚、莫桑比克羅非魚(O.mossambicus)性腺大小[11-12]。研究表明，孵化后10日齡，尼羅羅非魚性腺原基分化明顯，至15日齡，原始性腺已形成[11]；莫桑比克羅非魚在孵化后10～11日齡，性腺原基分化明顯，生殖細(xì)胞數(shù)目迅速增加，逐漸形成原始性腺[12]。這些表明，尼奧羅非魚原始性腺形成與其他羅非魚較為接近，形成時(shí)間約為孵化后10～15 d完成。

3.2 性腺分化期

3.3 性腺分化發(fā)育完整性

在尼羅羅非魚性腺早期發(fā)育研究中，劉筠等[9,11]在Ⅰ、Ⅱ期精巢和卵巢中發(fā)現(xiàn)有精母細(xì)胞和卵母細(xì)胞共存的現(xiàn)象。但在本研究中，1～4.5月齡尼奧羅非魚的精巢(或卵巢)中均未觀察到兩性細(xì)胞共存的現(xiàn)象，性腺明顯分化為精巢或卵巢，未發(fā)現(xiàn)有“假雄”性別或“中間”性別類型。根據(jù)尼奧羅非魚成熟精巢中存在不同發(fā)育階段的生殖細(xì)胞，Ⅱ、Ⅲ期卵巢中同時(shí)存在多個(gè)時(shí)相的卵母細(xì)胞，初步認(rèn)為，尼奧羅非魚的精巢、卵巢也屬于非同步發(fā)育型。

圖1 尼奧羅非魚性腺分化和發(fā)育

a：0.5月齡原始性腺，×100；b：1月齡Ⅰ期精巢，×100；c：1.5月齡精巢，×100；d：2月齡，Ⅱ期精巢，×40；e：2.5月齡，Ⅲ期精巢，×40；f：3月齡精巢，×40；g：3.5月齡精巢，×40；h：4月齡精巢，×40；i：4.5月齡，Ⅳ期精巢；j：2.5月齡，Ⅱ期卵巢，×40；k：3.5月齡卵巢，×40；l：4月齡，Ⅲ期卵巢，×40；m：4.5月齡，Ⅲ期卵巢，×40；PGCs：原始生殖細(xì)胞；SG：精原細(xì)胞；PS：初級(jí)精母細(xì)胞；SPG：精小囊；SS：次級(jí)精母細(xì)胞；St：精細(xì)小管；ST：精子細(xì)胞；Pi：壺腹腔；Og：卵原細(xì)胞；Nu：核仁；YN：卵黃核；FM：濾泡膜.

本研究結(jié)果初步表明，尼奧羅非魚存在雌、雄兩種性別類型，以雄性性別占主導(dǎo)(98%)，雄魚中精原細(xì)胞、初級(jí)精母細(xì)胞、次級(jí)精母細(xì)胞、精子細(xì)胞正常發(fā)育，能夠產(chǎn)生成熟精子。據(jù)此認(rèn)為，種間雜交對(duì)尼奧羅非魚的性腺分化與生殖細(xì)胞發(fā)育并未產(chǎn)生明顯影響，但雜交對(duì)雜種的精子數(shù)量、活力影響尚需進(jìn)一步分析。許玉德等[17]對(duì)尼羅羅非魚、奧利亞羅非魚及尼奧羅非魚精巢組織學(xué)觀察，發(fā)現(xiàn)尼奧羅非魚精巢內(nèi)生殖細(xì)胞密度比親本略疏，間質(zhì)組織相對(duì)發(fā)達(dá)，間質(zhì)細(xì)胞數(shù)目相對(duì)較多。萬英杰等[18]對(duì)體質(zhì)量400～500 g尼奧羅非魚雌魚解剖觀察發(fā)現(xiàn)，卵巢分正常型和萎縮型，萎縮型的雌魚數(shù)量約為正常型雌魚的3倍，由于萎縮型雌魚不能正常排卵，表現(xiàn)出“雄性化”現(xiàn)象。本研究中，由于雌魚數(shù)量過少，也未能觀察到“萎縮型”卵巢。今后，還需擴(kuò)大樣本數(shù)量，分析探討雜交對(duì)雜種卵巢后期發(fā)育及卵母細(xì)胞成熟是否產(chǎn)生影響，理解尼奧羅非魚雜種雄性率高的生理機(jī)制。

在尼奧羅非魚性腺解剖中也發(fā)現(xiàn)，大多數(shù)個(gè)體的性腺為雙側(cè)對(duì)稱型，也有些個(gè)體為雙側(cè)不對(duì)稱型，一側(cè)短小，甚至還出現(xiàn)單側(cè)性腺發(fā)育，這類性腺比正常型短小，這種現(xiàn)象是與羅非魚性腺不同步發(fā)育有關(guān)，或是由于雜交引起的雜種不育性，還需進(jìn)一步研究確定。

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GendersandGonadalDevelopmentinHybridsofNileTilapiaOreochromisniloticus♀×O.aureus♂

ZHAO Yonghua1, ZHAO Jinliang1, CHEN Xiaowu1, WANG Yan1, WEI Jihai1,SAN Guibao2,JIAN Weiye3

( 1. Laboratory of Freshwater Fisheries Germplasm Resources, Ministry of Agriculture, Shanghai Ocean University, Shanghai 201306, China; 2. Guangzhou Panyu Institute of Agricultural Sciences, Guangzhou 511450,China;3. Maoming Weiye Tilapia Seed Farm, Maoming 525000, China )

The gender type and gonadal development of 0.5—0.45 month old Nile tilapiaOreochromisniloticus(♀)×O.aureus(♂) were observed by microscopic histology. The results showed that primordial gonad of the tilapia was undifferentiated at 0.5-month-old.The primordial germ cells in the testis differentiated into spermatogonia around 1 month, primary spermatocytes occurred at the age of 2.5 month, while secondary spermatocytes presented around 3-month-old. The germ cells were present in different developmental stages in the testis and sparse sperm dispersed in ampulla cavity at the age of 3.5-4.5 months,while intensive sperm were dispersed in ampulla cavity around 4.5 months. Among the samples, female individuals were also detected at 2.5,3.5,4 and 4.5 months, respectively,the oocytes were in phase Ⅱat 2.5-3.5 months ovarian,and phase Ⅱat 4 and 4.5 month-old.The findings suggested that there were two kinds of gender in hybrids with the male dominated, and that the testis and ovarian in the hybrids developed normally.

Oreochromisniloticus♀×O.aureus♂;gender type; gonadal development; histological method

10.16378/j.cnki.1003-1111.2017.04.011

S965.125

A

1003-1111(2017)04-0467-05

2016-04-08；

2016-11-28.

國(guó)家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系專項(xiàng)資金資助項(xiàng)目(CARS-49)；水產(chǎn)動(dòng)物遺傳育種中心上海市協(xié)同創(chuàng)新中心資助項(xiàng)目(ZF1206)；廣東省水產(chǎn)良種體系建設(shè)專項(xiàng)(2016).

趙永華(1990-)，男，碩士研究生；研究方向:水產(chǎn)動(dòng)物遺傳育種與繁殖. E-mail：1099875884@qq.com. 通訊作者：趙金良(1969-)，男，教授；研究方向：動(dòng)物遺傳育種與繁殖.E-mail：jlzhao@shou.edu.cn.