孟霄鵬，孟 陽，王 悅，楊 碩，袁春營，崔青曼

( 天津科技大學 海洋與環(huán)境學院，天津市海洋資源與化學重點實驗室，天津 300457 )

益生菌對凡納濱對蝦免疫功能及腸道菌群的影響

孟霄鵬，孟 陽，王 悅，楊 碩，袁春營，崔青曼

( 天津科技大學 海洋與環(huán)境學院，天津市海洋資源與化學重點實驗室，天津 300457 )

以類芽孢桿菌和雙歧桿菌為益生菌，添加到凡納濱對蝦(平均體質(zhì)量3.45 g)的飼料中，飼養(yǎng)28 d(水溫25～27 ℃，鹽度25～26，pH 7.8～8.1，溶解氧>6 mg/L)，采用南京建成試劑盒和變性梯度凝膠電泳技術，研究益生菌對凡納濱對蝦免疫功能及腸道菌群的影響。結果表明，益生菌能夠顯著提高對蝦血清過氧化物酶(對照組43.22 U/mL，試驗組76.33 U/mL)、超氧化物歧化酶(對照組60.61 U/mL，試驗組101.18 U/mL)、一氧化氮合酶(對照組7.54 U/mL，試驗組12.44 U/mL)、酸性磷酸酶(對照組0.0446 U/mL，試驗組0.0574 U/mL)和堿性磷酸酶(對照組0.0183 U/mL，試驗組0.0236 U/mL)的活性 (P<0.01)，明顯改善對蝦腸道的菌群組成，從而提高對蝦抵抗疾病的能力。

類芽孢桿菌；雙歧桿菌；凡納濱對蝦；免疫學指標；腸道菌群

近年來，隨著凡納濱對蝦(Litopenaeusvannamei)集約化養(yǎng)殖的迅猛發(fā)展，水環(huán)境惡化和種質(zhì)退化導致病害頻發(fā)，抗生素及其他違禁藥物引起的細菌抗藥性及藥物殘留等問題，影響了對蝦養(yǎng)殖業(yè)的健康穩(wěn)定發(fā)展。為了解決養(yǎng)殖病害和食品安全等諸多矛盾，尋找綠色環(huán)保的抗生素替代品成為研究的熱點[1-2]。

益生菌是一類能定殖于宿主腸道內(nèi)、能產(chǎn)生健康功效，改善宿主微生態(tài)平衡、發(fā)揮有益作用的活性有益微生物的總稱。目前微生態(tài)活菌制劑在對蝦養(yǎng)殖生產(chǎn)中大多應用于水質(zhì)調(diào)控，作為對蝦飼料添加劑以能耐高溫高壓的芽孢桿菌屬為主[3-6]。對蝦獨有的免疫系統(tǒng)，只能通過提高機體免疫力抵抗外界病害的侵襲。本研究從對蝦腸道中分離類芽孢桿菌(Paenibacillussp.)，與雙歧桿菌(Bifidobacteriussp.)配伍制備益生菌，應用于凡納濱對蝦養(yǎng)殖，探討益生菌對對蝦生長、機體免疫力和腸道菌群的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗用益生菌為自行研制，成分組成：類芽孢桿菌和雙歧桿菌(比例為1∶1，菌體數(shù)2.2×109cfu/mL)，其中類芽孢桿菌由養(yǎng)殖對蝦腸道分離純化得到，雙歧桿菌由天津海河乳業(yè)的酸奶中分離得到。試驗用凡納濱對蝦蝦苗由天津鑫永豐水產(chǎn)養(yǎng)殖有限公司提供。試驗飼料為廣東海大集團股份有限公司生產(chǎn)。

主要儀器：立式蒸汽滅菌器(上海迅博業(yè)實有限公司)，超凈工作臺(上海躍進醫(yī)療器械廠)，紫外可見分光光度計(北京普析通用儀器有限責任公司)，T100TMPCR儀(美國熱電公司)，ChemiDoc XRS凝膠成像儀(美國熱電公司)，DYY-6C電泳儀(北京六一儀器廠)。

1.2 方法

本試驗設置1個試驗組(每千克飼料中加入0.1 mL益生菌)和1個對照組(未添加益生菌)。每組設3個平行，共計6個處理組。正式試驗前，對蝦放于室內(nèi)海水循環(huán)系統(tǒng)中暫養(yǎng)，并以試驗對照飼料飽食投喂。暫養(yǎng)8 d后進行養(yǎng)殖試驗，每個水族箱中投放蝦30尾。

28 d飼養(yǎng)試驗，每日6:00、11:00、18:00和23:00按對蝦體質(zhì)量的5%～6%投喂，且根據(jù)對蝦的攝食情況適當調(diào)整。各時間點投喂量占日總投餌量的比值分別為30%、20%、30%和20%。飼養(yǎng)期間連續(xù)充氣，水溫25～27 ℃，鹽度25～26，pH 7.8～8.1，溶解氧>6 mg/L。

養(yǎng)殖試驗結束時，分別對每個重復對蝦進行計數(shù)，稱量質(zhì)量，計算對蝦的存活率及特定生長率：

成活率/%=Nt/N0×100%

特定生長率/%·d-1= (lnmt——lnm0)/t×100%

式中，N0和Nt分別為每個重復對蝦初始尾數(shù)和終末尾數(shù)，m0和mt分別為初始體質(zhì)量和終末體質(zhì)量(g)，t為試驗天數(shù)(d)。

1.2.1 對蝦血淋巴免疫學指標的測定

1.2.1.1 抗凝血的制備

從每個重復中隨機取出5～6尾蝦，自腹竇取血，血淋巴與抗凝劑的比例為1∶2，離心10 min(3000 r/min，4 ℃)，所得上清液用于測定免疫指標。

1.2.1.2 對蝦血清中過氧化物酶、超氧化物歧化酶、一氧化氮合酶、酸性磷酸酶、堿性磷酸酶活性的測定

過氧化物酶、超氧化物歧化酶、一氧化氮合酶、酸性磷酸酶、堿性磷酸酶的活性均采用南京建成試劑盒測定。

過氧化物酶的活性定義為：以37 ℃條件下，每毫升血清(血漿)每分鐘催化1 μg底物的酶量定義為1個酶活力單位 (U)。

以每毫升血清中超氧化物歧化酶抑制率達到50%時所對應的超氧化物歧化酶量為1個超氧化物歧化酶活力單位(U)。

以每毫升血清每分鐘生成1 nmol 一氧化氮為1個一氧化氮合酶活力單位(U)。

以1 mL血清在37 ℃與基質(zhì)作用30 min，產(chǎn)生1 mg酚為1個酸性磷酸酶活力單位(U)。

以1 mL血清在37 ℃與基質(zhì)作用15 min，產(chǎn)生1 mg酚為1個堿性磷酸酶活力單位(U)。

1.2.2 腸道菌群的變性梯度凝膠電泳分析

1.2.2.1 樣品的采集與處理

75%乙醇體表消毒，活體解剖，用鑷子擠壓腸道，將內(nèi)含物擠出，同時將腸道剪碎，一并放置于預冷的磷酸緩沖液中，4 ℃靜置2～4 h，3000 r/min離心10 min，將上清液放置于50 mL離心管中，12 000 r/min離心10 min，棄上清液，收集沉淀用于后續(xù)試驗。

1.2.2.2 總DNA的提取與純化

采用AxyPrep細菌基因組DNA小量試劑盒(愛思進生物技術有限公司)，提取總DNA。DNA純化采用天根公司生產(chǎn)的通用型DNA純化回收試劑盒。瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA。

1.2.2.3 PCR擴增

采用16S rDNA V3高變區(qū)序列的通用引物，進行總DNA的PCR擴增。引物：341F(5′段連接GC夾)：5′-CGC CCG CCG CGC CCC GCG CCC GGC CCG CCG CCC CCG CCC CCC TAC GGG AGG CAG CAG-3′，534R：5′-ATTACCGCGGCTGCTGG-3′。

采用降落 PCR 進行擴增：94 ℃預變性4 min；94 ℃ 1 min，65 ℃，45 s，72 ℃，45 s，每個循環(huán)退火溫度降低1 ℃，當退火溫度降至55 ℃ 后，再以該溫度擴增25個循環(huán)；最后72 ℃補平10 min[7]。PCR 產(chǎn)物用1.5%的瓊脂糖凝膠進行檢測。

1.2.2.4 變性梯度凝膠電泳

純化后的PCR產(chǎn)物上樣進行8%的變性梯度凝膠電泳(變性梯度35%～55%)，溫度60 ℃，恒壓150 V，電泳6 h，溴化乙錠染液染色30 min，凝膠成像系統(tǒng)觀察并拍照，進行切膠。切完后放進2 mL離心管內(nèi)，加入1 mL無菌水沖洗2次，沖洗完畢后加入30 μL超純水，-20 ℃冷藏過夜后，將離心管12 000 r/min離心10 min，取上清液作為變性梯度凝膠電泳條帶回收后的模板再進行PCR擴增，PCR產(chǎn)物送至北京奧科鼎盛生物公司測序，將測序結果通過Blast進行比對分析，選取與PCR序列相似度最高的一個GenBank收錄序列，對比分析對照組和試驗組凡納濱對蝦腸道菌群。

2 結果與分析

2.1 益生菌對凡納濱對蝦生長及存活率的影響

試驗組的對蝦存活率和特定生長率均高于對照組，說明添加益生菌降低了凡納濱對蝦的死亡率，提高其特定生長率(表1)。

表1 試驗凡納濱對蝦存活率和特定生長率

2.2 益生菌對凡納濱對蝦5項免疫學指標的影響

添加益生菌組的凡納濱對蝦血清的過氧化物酶、超氧化物岐化酶、一氧化氮合酶、酸性磷酸酶和堿性磷酸酶活性均顯著高于對照組(P<0.01)(圖1～圖5)，其中試驗組對蝦過氧化物酶、超氧化物岐化酶、一氧化氮合酶的活性均隨著時間的延長而升高，14 d以后升高緩慢，試驗組對蝦的酸性磷酸酶和堿性磷酸酶活性在14 d時均最高，28 d時略微下降，說明該益生菌可以明顯提高凡納濱對蝦血清的非特異性免疫指標，提高對蝦機體的免疫力。

圖1 益生菌對凡納濱對蝦血清過氧化物酶活性的影響與對照組相比較，*P < 0.05, **P < 0.01.下同.

圖2 益生菌對凡納濱對蝦血清超氧化物岐化酶活性的影響

圖3 益生菌對凡納濱對蝦血清一氧化氮合酶活性的影響

圖4 益生菌對凡納濱對蝦血清酸性磷酸酶活性的影響

圖5 益生菌對凡納濱對蝦血清堿性磷酸酶活性的影響

2.3 益生菌對凡納濱對蝦腸道菌群的影響

對照組和試驗組對蝦腸道細菌基因組圖譜見圖6，對蝦腸道菌群的16S rDNA電泳圖譜見圖7，將PCR產(chǎn)物進行變性梯度凝膠電泳分析，結果見圖8、表2和表3。從圖譜中亮度和位置可看出二者不同的優(yōu)勢菌群的差異。對照組對蝦腸道的優(yōu)勢菌群主要是玫瑰桿菌(Rosebacter)和弧菌(Vibrio)，而試驗組凡納濱對蝦腸道中優(yōu)勢菌群主要是類芽孢桿菌、雙歧桿菌和弧菌等。對照組對蝦腸道的細菌種類主要屬于變形菌門，試驗組凡納濱對蝦腸道中的細菌種類屬于厚壁菌門、放線菌門、擬桿菌門和變形菌門，微生物種類明顯增加，且益生菌占居優(yōu)勢地位。

圖6 試驗凡納濱對蝦腸道細菌基因組圖譜1為對照組，2為試驗組.

圖7 試驗凡納濱對蝦腸道菌群的16S rDNA電泳圖譜1、2、3為對照組，4、5、6為試驗組.

圖8 試驗凡納濱對蝦腸道菌群的變性梯度凝膠電泳圖譜左側(cè)為對照組，右側(cè)為試驗組.

編號比對相似度/%親緣關系CT1假交替單胞菌(Pseudoalteromonasnigrifaciens)(AB793704．1)89變形菌門CT2未能培養(yǎng)的γ?變形菌克隆(JX966218．1)95γ?變形菌門CT3弧菌(FR821229．1)98變形菌門CT4發(fā)光弧菌(KP319180．1)94變形菌門CT5未能培養(yǎng)的α?變形菌(JQ974826．1)92α?變形菌門CT6弧菌(JQ665318．1)94變形菌門CT7未能培養(yǎng)的細菌克隆(KF799155．1)98未知細菌CT8玫瑰桿菌(DQ479380．1)100變形菌門CT9未能培養(yǎng)的紅環(huán)菌科細菌克隆(GQ324225．1)94變形菌門CT10克雷伯菌屬(Klebsiella)(FJ823022．1)92γ?變形菌門CT11玫瑰桿菌(DQ479380．1)94變形菌門CT12未能培養(yǎng)的細菌克隆(KC884574．1)92未知細菌CT13未能培養(yǎng)的細菌克隆(JQ197251．1)90未知細菌CT14弧菌(FR821230．1)95變形菌門

表3 試驗組凡納濱對蝦腸道微生物16S rDNA-V3的序列分析

3 討 論

3.1 益生菌對凡納濱對蝦免疫功能的作用

益生菌為抗生素的替代品，應用發(fā)展迅速[1,8-9]。在飼料中添加益生菌，不同程度提高了凡納濱對蝦的血清酚氧化酶活力、溶菌酶活力和總抗氧化力等免疫指標[10-11]及淀粉酶、脂肪酶等消化酶活性[12]；在凡納濱對蝦養(yǎng)殖水體中投入微生態(tài)制劑，明顯增強對蝦血清的酚氧化酶、超氧化物歧化酶、堿性磷酸酶、抗菌活力和溶菌活力[13]。溫俊等[14]在飼料中添加合生素，研究了其對凡納濱對蝦腸道菌群和免疫機能的影響，證實合生素能顯著提高凡納濱對蝦酚氧化酶活力和堿性磷酸酶活力。郝凱[15]分析了健康凡納濱對蝦的腸道微生物菌群，通過溶血試驗、產(chǎn)酶試驗、拮抗試驗和安全性評價，篩選獲得3株潛在益生菌，分別為鮑魚希瓦氏菌(Shewanellahaliotis)、臘樣芽孢桿菌(B.cereus)和雙殼氣單胞菌(Aeromouasbivalvium)，通過在飼料中添加單一菌體和按一定比例混合的菌體，研究其對凡納濱對蝦免疫機能、生長性能和抗病力的影響，結果表明，雙殼氣單胞菌能夠顯著性提高呼吸爆發(fā)活性、酸性磷酸酶活性和溶菌酶活力，混合菌組能夠顯著提高呼吸爆發(fā)活性和酸性磷酸酶活力，鮑魚希瓦氏菌和雙殼氣單胞菌能夠顯著上調(diào)proPO和LGBP基因的表達，混合菌能夠顯著上調(diào)PE-3a基因的表達，雙殼氣單胞菌和混合菌能夠顯著提高凡納濱對蝦的抗病力，不同處理組的凡納濱對蝦質(zhì)量增加顯著，其中混合菌的質(zhì)量增加效果最好。本研究也得到了類似的結果，益生菌能夠明顯增強凡納濱對蝦血清的過氧化物酶、超氧化物岐化酶、一氧化氮合酶、酸性磷酸酶和堿性磷酸酶的活性，提高了對蝦的防病能力和成活率。

3.2 益生菌改善凡納濱對蝦腸道菌群的作用

變性梯度凝膠電泳技術有無需培養(yǎng)、分辨率高、結果準確、重復性好、檢測速度快、同時檢測多種微生物等優(yōu)點，已成為微生物分子生態(tài)學研究的主要方法之一，廣泛應用于微生物群落結構的研究，包括土壤、植物根系、海洋、溫泉、人體和動物腸道等。王亭芳等[16]采用變性梯度凝膠電泳技術分析7—9月凡納濱對蝦養(yǎng)殖水體中微生物的種類，優(yōu)勢種屬于變形菌門和厚壁菌門。溫俊等[14]研究發(fā)現(xiàn)，合生素能調(diào)節(jié)凡納濱對蝦腸道微生物群落結構，穩(wěn)定腸道的微生態(tài)環(huán)境。在飼料中添加中草藥和芽孢桿菌，投喂56 d后，發(fā)現(xiàn)中草藥和芽孢桿菌促進了凡納濱對蝦的生長，且共同添加的效果好于單獨添加，同時改變了對蝦腸道細菌的數(shù)量和組成[17]。張盛靜等[18]在飼料中添加地衣芽孢桿菌(B.licheniformis)，研究其對凡納濱對蝦腸道菌群、Toll 受體及溶菌酶基因表達量和抗哈維氏弧菌(V.harveyi)能力的影響，結果表明，地衣芽孢桿菌可顯著提高對蝦抗哈維氏弧菌感染的能力，顯著降低對蝦腸道內(nèi)弧菌數(shù)量，感染哈維氏弧菌后，試驗組溶菌酶mRNA 的相對表達量在12、18、24、36、48、72 h 均顯著高于對照組，試驗組感染哈維氏弧菌后在6、12、18、24、36、48、72和7 d 的Toll 受體mRNA 的相對表達量均顯著高于對照組，推測地衣芽孢桿菌可能是通過降低對蝦腸道內(nèi)的弧菌量，并提高抗病相關基因的表達量，從而增強對蝦抗哈維氏弧菌感染的能力。筆者采用變性梯度凝膠電泳技術研究發(fā)現(xiàn)，對照組凡納濱對蝦腸道中菌群以變形菌門為主，試驗組中對蝦腸道菌群則為4類菌群，可見外來微生物可明顯改變對蝦腸道的菌群組成。

4 結 論

通過在飼料中添加益生菌，研究凡納濱對蝦生長、免疫學指標和腸道菌群的變化，證實益生菌能明顯提高凡納濱對蝦的特定生長率和存活率，增強凡納濱對蝦過氧化物酶、超氧化物岐化酶、一氧化氮合酶活性、酸性磷酸酶和堿性磷酸酶的活性，有效改善對蝦腸道菌群的組成，提高凡納濱對蝦的特定生長率和存活率，不失為一種良好的對蝦用微生態(tài)制劑。

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EffectsofProbioticsonImmunologicFunctionsandIntestinalMicroflorainPacificWhiteLegShrimpLitopenaeusvannamei

MENG Xiaopeng, MENG Yang, WANG Yue, YANG Shuo, YUAN Chunying, CUI Qingman

( Tianjin Key Laboratory of Marine Resource and Chemistry, College of Marine & Environment, Tianjin University of Science and Technology, Tianjin 300457, China )

In this paper, bacillus and bifidobacteria were added to the feed of Pacific white leg shrimpLitopenaeusvannamei(average body weight of 3.45 g), and fed for 4 weeks, and the effects of probiotics on immunologic functions and intestinal microflora ofL.vannameiwas studied by Nanjing Jiancheng kit and denaturing gradient gel electrophoresis (DGGE) technology. The results showed that probiotics led to increase activities of peroxidase (control group, 43.22 U/mL; experimental group, 76.33 U/mL), superoxide dismutase (control group, 60.61 U/mL; experimental group, 101.18 U/mL), nitric oxide synthase (control group, 7.54 U/mL; experimental group, 12.44 U/mL), acid phosphatase (control group, 0.0446 U/mL; experimental group, 0.0574 U/mL) and alkaline phosphatase (control group, 0.0183 U/mL; experimental group, 0.0236 U/mL) in Pacific white leg shrimp, obviously improved intestinal bacterial group composition of the shrimp, and the ability of shrimp to resist disease.

Paenibacillussp.;Bifidobacteriumsp.;Litopenaeusvannamei; immunologic function; intestinal microflora

10.16378/j.cnki.1003-1111.2017.01.010

S968.22

A

1003-1111(2017)01-0060-06

2016-01-21；

2016-04-18.

國家星火計劃項目(2011GA610005).

孟霄鵬(1992—)，男，碩士研究生；研究方向：海洋生物資源開發(fā)利用. E-mail：meng12@mail.tust.cn. 通訊作者：袁春營(1965—)，男，副教授；研究方向：海洋生物資源開發(fā)利用. E-mail：ycy201388@163.com.