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(1.云南民族大學(xué)化學(xué)與環(huán)境學(xué)院,云南昆明 650500;2.云南省勐?？h農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全監(jiān)測(cè)站,云南勐海 666200;3.云南與諾生物工程有限公司,云南昆明 650000;4.云南民族大學(xué)民族藥資源化學(xué)國(guó)家民族事務(wù)委員會(huì)，教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,云南昆明 650500)

傣族發(fā)酵淘米水的初步研究

楊海英1,胡秋月1,王忠誠(chéng)2,黃開心3,劉赟4,杜剛4,*

(1.云南民族大學(xué)化學(xué)與環(huán)境學(xué)院,云南昆明 650500;2.云南省勐?？h農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全監(jiān)測(cè)站,云南勐海 666200;3.云南與諾生物工程有限公司,云南昆明 650000;4.云南民族大學(xué)民族藥資源化學(xué)國(guó)家民族事務(wù)委員會(huì)，教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,云南昆明 650500)

本文對(duì)傣族淘米水的發(fā)酵菌株及物質(zhì)基礎(chǔ)進(jìn)行初步研究,為傣族淘米水在日化領(lǐng)域的開發(fā)應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。從傳統(tǒng)發(fā)酵的淘米水中分離發(fā)酵菌株,結(jié)合菌株形態(tài)和分子生物學(xué)方法進(jìn)行菌株鑒定,通過凱氏定氮法檢測(cè)不同時(shí)間發(fā)酵淘米水的總氮及非蛋白氮含量,采用高效液相色譜法分析測(cè)定淘米水發(fā)酵液中的乳酸和乙酸含量。結(jié)果表明,從發(fā)酵淘米水樣品中分離得到1株乳酸菌和1株酵母菌,通過16S rRNA基因序列及26S rRNA序列分析,結(jié)合表形特征,初步鑒定兩株菌為乳桿菌屬菌株和畢赤酵母屬菌株。經(jīng)48 h發(fā)酵,與未發(fā)酵淘米水相比,總氮含量提高105%,非蛋白氮含量提高77%,乳酸含量提高551%,乙酸含量提高342%。

發(fā)酵淘米水,菌株鑒定,總氮,非蛋白氮,有機(jī)酸

云南傣族有用發(fā)酵淘米水洗發(fā)的傳統(tǒng),淘米水中的微粒具有去污功能,去頭屑、潤(rùn)發(fā)、亮發(fā)和促使頭發(fā)變黑、變粗等作用[1]。淘米水主要含有米糠和糊粉層的營(yíng)養(yǎng)成分,包括淀粉、蛋白質(zhì)、油脂含量、膳食纖維、谷維素、維生素、礦物質(zhì)和生育酚等多種生物活性成分[2]。米糠蛋白具備低過敏性、抗癌活性和保健功能[3],米糠脂類物質(zhì)可降低人體血清膽固醇[4],米糠多糖成分具有抗腫瘤[5],增強(qiáng)免疫力[6]及降血糖[7]的活性,米糠的植酸鈣能促進(jìn)人體新陳代謝、骨骼組織生長(zhǎng)發(fā)育等[8]。米糠肽是米糠蛋白經(jīng)蛋白酶水解得到的低分子量多肽,具有低過敏性、易溶解、無腥味的特點(diǎn)[9]。在米糠肽中還發(fā)現(xiàn)多種功能活性,Fujita等通過酶解黃酒發(fā)酵后的酒糟獲得了九種抑制ACE(血管緊張素轉(zhuǎn)化酶)活性的肽[10],Chen等[11]采用離體豚鼠回腸(GPI)檢定法檢測(cè)米糠蛋白酶解物的類阿片拮抗活性,曲曉婷[12]等發(fā)現(xiàn)米糠肽能促進(jìn)脾淋巴細(xì)胞增殖。韓國(guó)新羅大學(xué)的Choi等[13]對(duì)米糠進(jìn)行CO2超臨界萃取,提取物表現(xiàn)出良好的生發(fā)效果,毛囊顯著增多,其效果與3%的生發(fā)藥物米諾地爾相當(dāng)。針對(duì)雄激素性脫發(fā)進(jìn)行16周的隨機(jī)雙盲實(shí)驗(yàn),實(shí)驗(yàn)表明萃取產(chǎn)物可顯著增加男性樣本的頭發(fā)密度和頭發(fā)直徑,且未出現(xiàn)任何不良反應(yīng)[14]。

本文對(duì)發(fā)酵淘米水中的菌株進(jìn)行分離鑒定,檢測(cè)發(fā)酵過程中總氮、非蛋白氮以及有機(jī)酸含量的變化,為傳統(tǒng)發(fā)酵淘米水在日化工業(yè)的開發(fā)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù),尚未見對(duì)發(fā)酵淘米水的菌株及物質(zhì)基礎(chǔ)進(jìn)行研究的報(bào)道。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

淘米水 云南省西雙版納傣族自治州勐臘縣曼那村傳統(tǒng)發(fā)酵3 d的淘米水；傣族香米 云南省勐?？h傣鄉(xiāng)米廠；甲醇為色譜純 Fisher公司;實(shí)驗(yàn)用水 超純水和蒸餾水;乙酸、乳酸純度大于99%;NaH2PO4(AR)、磷酸(AR)、檸檬酸三銨(AR)、CH3COONa(AR)、MnSO4(AR)、MgSO4(AR)、KH2PO4(AR)、葡萄糖、蛋白胨、牛肉膏、酵母膏等 國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

Agilent 1200高效液相色譜儀 美國(guó)安捷倫公司;LE204E電子天平、FE20K pH計(jì) Mettler Toledo公司;臺(tái)式離心機(jī) 上海安亭/飛鴿;LDZX-40BI蒸汽滅菌鍋 上海申安醫(yī)療器械廠;HP-900隔水式恒溫培養(yǎng)箱 上海一恒科技有限公司;雙目顯微鏡 上海華巖儀器設(shè)備有限公司;TGL-15B高速冷凍離心機(jī) 上海安亭科學(xué)儀器廠;5331型PCR儀 德國(guó) Eppendorf公司;Tanon 2500凝膠成像系統(tǒng) 上海天能科技有限公司;HYP-3智能消化爐、KDN-102C定氮儀蒸餾裝置 上海纖檢儀器有限公司;GUJS-50型發(fā)酵罐 鎮(zhèn)江東方生物工程設(shè)備技術(shù)有限責(zé)任公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 培養(yǎng)基 MRS培養(yǎng)基:葡萄糖20 g,蛋白胨10 g,牛肉膏10 g,酵母膏5 g,檸檬酸三銨2 g,CH3COONa 1 g,MnSO40.25 g,MgSO40.58 g,KH2PO42 g,蒸餾水1000 mL,pH自然。

YPD培養(yǎng)基:葡萄糖20 g,蛋白胨20 g,瓊脂20 g,酵母膏20 g,蒸餾水1000 mL,pH自然。

1.2.2 發(fā)酵淘米水的制備 傳統(tǒng)淘米水發(fā)酵方式為:把每天的淘米倒入盆或桶中厭氧發(fā)酵,溫度30 ℃,48～96 h。傣族香米與水比例為1∶2,浸泡1 h,得到淘米水。以勐臘縣曼那村傳統(tǒng)發(fā)酵3 d的淘米水作種子,接種量為發(fā)酵體積的10%,用50 L發(fā)酵罐裝量20 L,模擬傳統(tǒng)淘米水發(fā)酵方式進(jìn)行厭氧發(fā)酵,121 ℃滅菌30 min,發(fā)酵溫度30 ℃,攪拌速率120 r/min,每12 h攪拌30 min。

1.2.3 菌株的分離純化 在無菌條件下,取勐臘縣曼那村傳統(tǒng)發(fā)酵淘米水樣品1 mL加入99 mL 無菌生理鹽水中,搖勻后取1 mL加入9 mL 無菌生理鹽水的試管中,作10-3～10-10梯度稀釋。吸取稀釋液各200 μL 涂布于MRS培養(yǎng)基,每個(gè)稀釋度3個(gè)平行,32 ℃下培養(yǎng)48 h。挑取單個(gè)菌落,劃線法分離純化,觀察菌株的菌落形態(tài)特征及顯微形態(tài)特征。

1.2.4 細(xì)菌和酵母的分子生物學(xué)鑒定 斜面菌種活化后,細(xì)菌接種于30 mL MRS液體培養(yǎng)基,32 ℃培養(yǎng)24 h,酵母接種于30 mL YPD液體培養(yǎng)基,取5 mL培養(yǎng)物12000 r/min離心10 min,收集菌體,液氮凍融-CTAB法提取DNA。

細(xì)菌16S rDNA引物27f:5′-AGAGTTTGATCC TGGCTCAG-3′和1495r:5′-CTACGGCTACCTT GTTACGA-3′;酵母26S rDNA D2引物NL1:5′-GCATATCAATAAGCG GAGGAAAAG-3′和NL4:5′-GGTCCGTGTTTCAAG-3。PCR反應(yīng)體系為:Taq MIX 25 μL,引物各2 μL,模板5 μL,加無酶水補(bǔ)足50 μL。程序?yàn)?95 ℃ 預(yù)熱5 min,94 ℃ 變性1 min,55 ℃退火30 s,72 ℃延伸 2 min,30個(gè)循環(huán)后72 ℃末端延伸 10 min,4 ℃ 保存。PCR產(chǎn)物以瓊脂糖電泳檢測(cè)送生工生物工程(上海)股份有限公司測(cè)序。

細(xì)菌所得DNA序列用DNAMAN生物軟件進(jìn)行拼接,用MEGA6.0進(jìn)行細(xì)菌和酵母序列的同源性比對(duì)(Alignment)和系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建。

1.2.5 總氮含量測(cè)定 用凱氏定氮法[15]測(cè)定淘米水發(fā)酵時(shí)間為0、6、12、18、24、30、36、42、48 h樣品的總氮含量,每個(gè)樣品平行測(cè)定三次,每次測(cè)定樣品量為3 mL發(fā)酵液。

1.2.6 非蛋白氮含量測(cè)定 測(cè)定發(fā)酵時(shí)間為0、6、12、18、24、30、36、42、48 h樣品的非蛋白氮含量。取3 mL發(fā)酵液樣品加入等體積的乙醇溶液(75%),振蕩5 min,于4000 r/min下離心15 min,取上清液,以上步驟重復(fù)三次。再加入3 mL的5%磺基水楊酸檢測(cè)體系中有無蛋白質(zhì),確定無蛋白質(zhì)后,敞開管口于115 ℃條件下蒸干樣品內(nèi)溶劑,所得樣品以凱式定氮法測(cè)定其含氮量。

1.2.7 有機(jī)酸的檢測(cè)

1.2.7.1 HPLC色譜條件 色譜柱:Agilent Zorbax SB-Aq(4.6 mm×150 mm,5 μm);流動(dòng)相:甲醇-20 mmol/L NaH2PO4緩沖溶液(pH2.0),體積比為1∶99;流速:0.4 mL/min;進(jìn)樣量:3 μL;柱溫:25 ℃;檢測(cè)波長(zhǎng):210 nm。

1.2.7.2 樣品預(yù)處理 取5 mL淘米水發(fā)酵液,經(jīng)12000 r/min離心10 min后取上清液,用0.45 μm濾膜過濾即得待測(cè)樣品溶液。

1.2.7.3 標(biāo)準(zhǔn)品溶液的配制及標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 精確稱取乙酸、乳酸標(biāo)準(zhǔn)品適量,置于100 mL容量瓶中,用超純水溶解并定容,制成每毫升含24.75 mg乳酸、3.93 mg乙酸的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液,4 ℃冰箱保存。

將混合標(biāo)準(zhǔn)溶液按比例稀釋成不同質(zhì)量濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液,按照“1.2.7.1“的色譜條件測(cè)定,以峰面積A對(duì)質(zhì)量濃度C(mg/mL)進(jìn)行線性回歸,得標(biāo)準(zhǔn)曲線方程。

1.2.7.4 淘米水發(fā)酵液樣品中乙酸和乳酸的含量測(cè)定 測(cè)定發(fā)酵時(shí)間為0、6、12、18、24、30、36、42、48 h樣品中乙酸和乳酸的含量,按“1.2.7.2”項(xiàng)對(duì)樣品進(jìn)行預(yù)處理,按照“1.2.7.1”的色譜條件,記錄各個(gè)峰的保留時(shí)間和峰面積。根據(jù)保留時(shí)間確定樣品中有機(jī)酸的種類,根據(jù)峰面積和標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算發(fā)酵液中乙酸和乳酸的含量。

1.2.7.5 pH的測(cè)定 樣品溶液用pH計(jì)測(cè)定溶液pH。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

檢測(cè)數(shù)據(jù)通過Excel求得平均值和標(biāo)準(zhǔn)偏差,以SigmaPlot 12.5軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株的分離純化及分子鑒定

菌株YNCA9102形態(tài)結(jié)構(gòu)如圖1,菌落濕、薄小、光滑、扁平、不透明、正反面勻?yàn)榘咨?菌體為分離的桿狀細(xì)胞,革蘭氏染色陽性。菌株YNCA9102形態(tài)結(jié)構(gòu)如圖2,菌落濕、薄小、光滑、隆起、不透明、正反面勻?yàn)榘咨?菌體呈卵圓形,具藕節(jié)狀假菌絲,碘液染色肝糖粒呈紅色。

圖1 菌株YNCA9101菌落及顯微結(jié)構(gòu)(1000×)Fig.1 Culture characteristics and morphological characteristics of YNCA9101(1000×)

圖2 菌株YNCA9102菌落特征及顯微結(jié)構(gòu)(1000×)Fig.2 Culture characteristics and morphological characteristics of YNCA9102(1000×)

2.2 菌株的分子鑒定

菌株YNCA9101以16S rDNA通用引物27f:5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′和1495r:5′-CTACGGC TACCTTGTTACGA-3′進(jìn)行PCR擴(kuò)增,在1500 bp左右有條帶;菌株YNCA9102以酵母菌26S rDNA D2通用引物NL1:5′-GCATATCAATAAGCG GAGGAAAAG-3′和NL4:5′-GGTCCGTGTTTCAAG-3進(jìn)行PCR擴(kuò)增,在500～700 bp之間有條帶。測(cè)序結(jié)果用Blast在GenBank中進(jìn)行同源性比對(duì),選取模式菌株以領(lǐng)域連接法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。由圖3可知,菌株YNCA9101與植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)聚為一簇,與菌株Lactobacillusplantarumstrain JCM 1149相似度為99%,結(jié)合其形態(tài)特征,菌株YNCA9101初步鑒定為乳桿菌屬菌株(Lactobacillussp.)。由圖4可知,菌株YNCA9102與畢赤酵母屬(Pichia)菌株聚為一簇,與菌株P(guān)ichiakudriavzeviiculture-collectionCBS:5147相似度為99%,結(jié)合其形態(tài)特征,菌株YNCA9102初步鑒定為畢赤酵母屬(Pichia)菌株。

圖3 乳桿菌YNCA9101基于16S rDNA的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.3 Phylogenetic analysis of YNCA9101 based on 16S rDNA

圖4 酵母菌YNCA9102基于26S rDNA D1/D2區(qū)域的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.4 Phylogenetic analysis of YNCA9102 based on 26SrDNA D1/D2

2.3 淘米水發(fā)酵過程中總氮及非蛋白氮含量的變化

圖5 淘米水發(fā)酵過程中的總氮及非蛋白氮含量Fig.5 The content of total nitrogen and nonprotein nitrogen in the process of fermentation of washing water of rice

發(fā)酵淘米水中總氮及非蛋白氮含量隨發(fā)酵時(shí)間變化如圖5所示。從圖中可以看出,淘米水發(fā)酵過程中總氮含量逐步上升,發(fā)酵42 h后趨于平緩,發(fā)酵48 h后總氮含量發(fā)酵初始的0.19%提高到發(fā)酵完成的0.39%,比發(fā)酵初始提高了105%,發(fā)酵過程中總氮含量有一定起伏,因發(fā)酵過程中酵母菌和乳酸菌部分菌體沉降和漂浮可能導(dǎo)致取樣不均勻。對(duì)淘米水發(fā)酵液中非蛋白氮含量的測(cè)定結(jié)果表明,開始發(fā)酵時(shí)非蛋白氮含量為0.13%,發(fā)酵48 h后,非蛋白氮的含量為0.23%,增加了77%;在前18 h增加幅度較為大,發(fā)酵36 h后趨于穩(wěn)定。總氮與非蛋白氮在發(fā)酵完成后含量增加,主要由于菌株發(fā)酵過程中釋放和水解了淘米水中不溶的蛋白質(zhì),同時(shí)發(fā)酵菌株也能合成蛋白質(zhì)和多肽的。非蛋白氮含量增加反映出發(fā)酵淘米水中氨基酸和肽的含量增加。蛋白質(zhì)、肽和氨基酸都有毛發(fā)保濕作用,頭發(fā)保持一定水分,可以防止過度干燥,減少頭發(fā)靜電增加、亂發(fā)及毛燥等發(fā)生機(jī)率,還能使頭發(fā)感覺更柔軟[16]。

2.4 淘米水發(fā)酵液不同階段有機(jī)酸含量分析

2.4.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 各標(biāo)準(zhǔn)品的回歸方程、線性范圍、相關(guān)系數(shù)結(jié)果見表1。

表1 2種有機(jī)酸的線性回歸方程、線性范圍、相關(guān)系數(shù)Table 1 Regression equations,linear ranges, correlation coefficients of the 2 organic acids

2.4.2 發(fā)酵液中有機(jī)酸含量分析及pH變化 通過對(duì)樣品溶液和標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行檢測(cè),確定淘米水發(fā)酵樣品中含有乳酸和乙酸兩種有機(jī)酸,有機(jī)酸標(biāo)樣和樣品的HPLC色譜圖如圖6和圖7。

圖6 有機(jī)酸標(biāo)樣HPLC色譜圖Fig.6 HPLC chromatogram of organic acid standards

圖7 淘米水發(fā)酵樣品HPLC色譜圖Fig.7 HPLC chromatogram of fermentation broth sample of washing water of rice

淘米水發(fā)酵過程中乳酸、乙酸含量及pH隨發(fā)酵時(shí)間的變化見圖8。由圖8可以看出,淘米水發(fā)酵樣品中乙酸和乳酸隨發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)含量增加,乳酸的含量變化更為顯著,42 h后趨于穩(wěn)定。乙酸和乳酸初始含量分別為0.26、1.66 mg/mL,經(jīng)過48 h發(fā)酵時(shí)間,乙酸和乳酸最終含量分別為1.15、10.80 mg/mL,分別增加342%和551%,發(fā)酵開始的乙酸和乳酸由種子液帶入。

圖8 淘米水發(fā)酵過程中乙酸、乳酸的含量及pH變化Fig.8 Changes of the content of organic acids and pH during fermentation of washing water of rice

隨有機(jī)酸含量增加,20 h內(nèi)pH由初始發(fā)酵的6.2下降到4.0以下,42 h后pH穩(wěn)定在3.1,pH的下降與有機(jī)酸的增加有較強(qiáng)的相關(guān)性。

3 結(jié)論

從發(fā)酵的淘米水樣品中分離到兩株菌,結(jié)合菌體形態(tài)和分子鑒定,初步鑒定為植物乳桿菌(L.plantarum)和畢赤酵母(Pichiasp.)。對(duì)淘米水發(fā)酵過程中0、6、12、18、24、30、36、42、48 h樣品進(jìn)行分析,淘米水發(fā)發(fā)酵48 h后總氮含量提高了105%,非蛋白氮的含量增加了77%,乙酸含量增加了342%,乳酸含量增加了551%。與未發(fā)酵淘米水比較,淘米水經(jīng)發(fā)酵后總氮、非蛋白氮、乙酸和乳酸含量都有顯著增加。

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Preliminarystudyonfermentedrice-washingwaterofDai

YANGHai-ying1,HUQiu-yue1,WANGZhong-cheng2,HUANGKai-xin3,LIUYun4,DUGang4,*

(1.School of Chemistry and Environment,Yunnan Minzu University,Kunming 650500,China;2.Menghai Agricultural Products Quality Security Inspection Testing Center,Menghai 666200,China;3.Yunnan Yunuo Bioengineering Company Limited,Kunming 650000,China;4.Key Laboratory of Chemistry in Ethnic Medicinal Resources,State EthnicAffairs Commission & Ministry of Education,Kunming 650500,China)

The fermentation strain and material basis of fermented rice-washing water of Dai were preliminary studied for supporting the development and application of fermented rice-washing water of Dai in the field of daily chemicals. The fermentation strains were isolated from the sample of fermented rice-washing water of Dai in Xishuangbanna and identified by phylogenetic analyses of 16SrRNA gene and 26R rRNA gene respectively,combined with phenotypic characteristics. The content of total nitrogen and non-protein nitrogen were detected by Kjeldahl determination and the concentration of lactic acid and acetic acid were detected by HPLC. The results showed that a lactic acid bacteria and a yeast were isolated from the sample of fermented rice-washing water and were primarily identified asLactobacillussp. andPichiasp.. Compared with unfermented rice-washing water,the non-protein nitrogen was increased 105%,the protein nitrogen was increased 77%,the lactic acid and acetic acid were increased 551% and 342% respectively after 48 h fermentation.

fermented rice-washing water;strain identification;total nitrogen;non-protein nitrogen;organic acid

2017-05-25

楊海英(1975-),女,碩士,教授,研究方向:微生物化學(xué),E-mail:yanghy200401@126.com。

*通訊作者:杜剛(1973-),男,博士,副教授,研究方向:微生物,E-mail:18372454@qq.com。

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(21462051);云南省教育廳科學(xué)研究基金重點(diǎn)項(xiàng)目(2015Z111)。

TS210.9

A

1002-0306(2017)23-0019-05

10.13386/j.issn1002-0306.2017.23.005