胡 磊， 陳藝賓， 王惠敏， 孟 春， 洪 晶， 葉南慧

(福州大學生物科學與工程學院， 福建 福州 350116)

紫蘇籽抗氧化肽的制備工藝研究

胡 磊， 陳藝賓， 王惠敏， 孟 春， 洪 晶， 葉南慧

(福州大學生物科學與工程學院， 福建 福州 350116)

采用堿提酸沉法從紫蘇籽粕中提取蛋白質， 進行蛋白酶篩選， 發(fā)現(xiàn)紫蘇籽蛋白經堿性蛋白酶酶解后有最好的抗氧化活性和水解度(DH). 在單因素試驗的基礎上， 采取響應面分析方法， 并建立數(shù)學模型， 確定最佳酶解工藝. 試驗結果表明： 各因素影響紫蘇籽粗蛋白酶解液DPPH自由基清除率的主次順序是： 加酶量>酶解時間>pH值， 最佳條件是： 加酶量3 000 U·g-1， 酶解時間5.00 h， pH值9.80， 溫度50 ℃， 此時DPPH自由基清除率為73.64%， 說明紫蘇籽蛋白質酶解多肽擁有很高的抗氧化活性.

紫蘇籽； 抗氧化肽； 酶解； 響應面分析法

0 引言

紫蘇籽即紫蘇(Perillafrutescens)的種子. 紫蘇是我國傳統(tǒng)藥材， 《本草綱目》中明確記載， 紫蘇具有潤肺止咳、 下氣消痰、 寬腸、 止痛、 安胎之功效. 近年來， 紫蘇活性物質及其藥理作用依然是科學家們研究的熱點， 研究發(fā)現(xiàn)紫蘇具有抗氧化、 防衰老[1]和抗菌、 抗病毒， 抗腫瘤、 抗炎、 抗過敏、 降血脂、 降血壓等藥理功能[2-3]. 紫蘇莖葉及種子蛋白含量豐富， 尤其是種子， 高達20%. 其氨基酸種類齊全， 不僅含有8種人體必需的氨基酸， 還含有其他10種氨基酸， 是組成均衡的完全蛋白質[4]. 植物蛋白通?？梢允褂玫鞍酌笇⑵渌獾玫缴锘钚噪? 童波等[5]將紫蘇籽粕提取蛋白分步水解， 可得到F值達79.25的低聚肽； 姜文鑫等[6]將紫蘇籽粕分離蛋白通過堿性蛋白酶水解可得到對大腸桿菌等常見菌株均具有抑制作用的廣譜抗菌多肽.

以脫脂后的紫蘇籽粕堿提酸沉得到的蛋白為原料， 篩選最適蛋白酶進行酶解得到抗氧化肽， 并在單因素試驗的基礎上， 以DPPH自由基清除率為指標， 采取響應面分析法(response surface method， RSM)研究酶解時間、 加酶量及pH值對抗氧化活性強弱的影響. 通過Design-Expert V8.0.6 軟件設計中心組合實驗， 獲取最佳酶解工藝， 為紫蘇籽蛋白的綜合利用及紫蘇籽抗氧化肽的制備提供理論依據(jù)和參考.

1 材料與方法

1.1 主要材料與設備

紫蘇種子， 購于福州種子市場.

723PCS 分光光度計， 購自鄭州南北儀器設備有限公司； XZ-21K 高速冷凍離心機， 購自長沙湘智離心機儀器有限公司.

1.2 實驗方法

1.2.1 制備紫蘇籽抗氧化肽工藝流程

紫蘇籽→脫脂→浸提→離心→取上清液→酸沉→冷凍干燥→紫蘇籽粗蛋白干粉→按一定料液比溶解→調pH值→酶解→浸提→100 ℃滅酶10 min→離心→取上清液→紫蘇籽抗氧化肽.

1.2.2 紫蘇籽粗蛋白粉中蛋白含量的測定

采用《谷物和豆類氮含量測定和粗蛋白質含量計算凱氏法(GB/T 5511-2008)》[7]測定紫蘇籽粗蛋白干粉中蛋白含量.

1.2.3 水解度的測定

對酶解液的DH值進行甲醛滴定法測定[8].

1.2.4 DPPH自由基清除率的測定

按照Hong等[9]報道的方法進行測定.

1.2.5 蛋白酶篩選實驗

以紫蘇籽粗蛋白為酶解底物， 選擇不同性質蛋白酶為水解反應催化劑， 在各種酶的最適條件下進行實驗， 按1.2.3和1.2.4的方法分別測定蛋白DH和多肽DPPH自由基清除率.

1.2.6 單因素實驗

表1 酶解紫蘇籽粗蛋白響應面分析因素水平表Tab.1 Experimental factors and levels used in response surface analysis of Perilla seed protein enzymolysis

酶解時間、 加酶量、 pH值和溫度都會對蛋白酶解體系產生一定的影響. 準確稱取一定量紫蘇籽粗蛋白樣品， 選取以上4 種因素的不同水平做單因素試驗. 酶解步驟按節(jié)1.2.1, 蛋白DH和多肽DPPH自由基清除率測定分別按1.2.3和1.2.4的方法.

1.2.7 響應面法優(yōu)化紫蘇籽粗蛋白酶解工藝

根據(jù)中心組合設計， 采用軟件Design-Expert V8.0.6 建立3因素3水平的試驗， 確定紫蘇籽粗蛋白酶解的最佳工藝. 以酶解液DPPH自由基清除率(Y/%)為考察指標， 酶解時間(A)， 加酶量(B)及pH值(C)為自變量， 因素水平編碼見表1.

2 結果與分析

圖1 不同蛋白酶水解液DH和DPPH自由基清除率Fig.1 The DH and DPPH radical-scavenging activity of hydrolysate prepared by different proteases

2.1 粗蛋白含量測定結果

采用凱氏定氮法測得紫蘇籽粗蛋白粉中總蛋白含量為(41.83±1.36)%.

2.2 蛋白酶篩選結果

酶的特異性及酶切位點存在差異， 所以蛋白酶種類不同酶解紫蘇籽粗蛋白會獲得不同一級結構的多肽， 其抗氧化活性也會存在差異[10]. 有學者采用2種或3種蛋白酶協(xié)同酶解蛋白制備生物活性肽， 但多酶酶解可能將原有抗氧化強的多肽進一步水解成抗氧化性較弱的寡肽和氨基酸. Zou等[11]對不同來源的42種抗氧化肽進行分析, 發(fā)現(xiàn)相對分子質量在1 000 u以下的3-6肽具有更好的自由基清除活性， 故不采用多酶協(xié)同酶解制備紫蘇籽粕抗氧化多肽. 圖1 為不同蛋白酶水解液DH和DPPH自由基清除率. 由圖1可見， 紫蘇籽粕蛋白Alcalase酶解產物具有最高的DH(25.18%)和DPPH自由基清除率(71.95%). Alcalase是一種絲氨酸蛋白酶， 對羧端疏水性氨基酸有較強的專一性， Adamson等[12]研究表明， 酪蛋白中Met、 Leu、 Glu等羧端肽鍵易被Alcalase裂解. 從抗氧化肽構效關系上看， 多肽若在其N端或其C端存在疏水性氨基酸具有更好的抗氧化活性[11]. 因而將堿性蛋白酶選為水解紫蘇籽粕蛋白的最適酶.

2.3 紫蘇籽粗蛋白酶解單因素試驗結果

2.3.1 酶解時間對DH和DPPH自由基清除率的影響

在溫度50 ℃、 底物質量濃度0.03 g·mL-1、 加酶量2 500 U·g-1、 pH值9.00條件下， 依次酶解 1.00、 2.00、 4.00、 6.00和8.00 h， 研究結果如圖2(a)所示. 由圖2(a)可見， 酶解時間由1.00 h增加至4.00 h時， DH和DPPH自由基清除率相對于前一水平顯著升高(P<0.05)， 然而， 酶解時間進一步延長， 相連水平均無顯著差異(P>0.05). 其原因在于， 當酶解時間達到4.00 h后， 底物已基本反應， 酶解反應處于一種動態(tài)平衡中， 延長酶解時間， 也不會有很大的提升. 故選擇最適酶解時間是4.00 h.

2.3.2 加酶量對DH和DPPH自由基清除率的影響

在溫度50 ℃， 底物質量濃度0.03 g·mL-1， pH值9.00， 酶解時間4.00 h條件下， 控制加酶量分別為500、 1 500、 2 500、 3 500和4 500 U·g-1， 研究結果如圖2(b)所示. 由圖2(b)可見， 加酶量由500增至2 500 U·g-1時， DH和DPPH自由基清除率相對于前一水平顯著提升(P<0.05)， 然而， 進一步增加加酶量， 相連水平均無顯著變化(P>0.05). 這是因為當酶與底物達到一種飽和狀態(tài)后， 再增加加酶量也不會改變其酶解速率[13]， 而且大量酶會增加酶與酶之間競爭性抑制， 對酶解反應產生不利影響， 同時無抗氧化作用的游離氨基酸及小肽段也會因為抗氧化肽繼續(xù)被酶降解而增加[14]. 故選用2 500 U·g-1為酶的最佳添加量.

2.3.3 pH值對DH和DPPH自由基清除率的影響

在溫度50 ℃， 底物質量濃度0.03 g·mL-1， 加酶量2 500 U·g-1， 酶解時間4.00 h條件下， 調節(jié) pH值分別為7.00、 8.00、 9.00、 10.00和11.00， 研究結果如圖2(c)所示. 由圖2(c)可見， 若pH值處于9.00～10.00之間， 則有最高的DH和DPPH自由基清除率， 這是由于過堿或過酸環(huán)境都會破壞酶的空間結構， 使其部分失活， 從而降低其催化效率. 因此， 將pH控制在9.00～10.00之間最合適.

注： ***表示P<0.001， 差異極顯著； **表示0.0010.05， 表示差異不顯著圖2 單因素試驗結果Fig.2 The results of single factor test

2.3.4 溫度對DH和DPPH自由基清除率的影響

在底物質量濃度0.03 g·mL-1， 加酶量2 500 U·g-1， pH 值9.00， 酶解時間4.00 h條件下， 控制溫度分別為 30、 40、 50、 60和70 ℃， 研究溫度的影響， 結果如圖2(d)所示. 由圖2(d)可見， 在50 ℃時， 有最高的DH和DPPH自由基清除率， 該情況可能與Alcalase的最適溫度范圍有關. 當溫度較低時， 酶活受到抑制， 但是當溫度上升， 體系內能也會隨之增加， 加快酶促反應速率， 當溫度持續(xù)升高就會改變酶結構， 抑制酶活性甚至使之失活[14]. 因此， 選擇50 ℃為最適酶解溫度.

2.4 紫蘇籽蛋白酶解工藝的優(yōu)化方案設計及結果分析

在單因素實驗結果的基礎上， 選擇對DPPH自由基清除率影響較大的因素進行優(yōu)化. 溫度在30～60 ℃的范圍內， DPPH自由基清除率變化范圍小， 當溫度升至70 ℃時， 清除率雖有顯著降低， 但主要是高溫使蛋白酶失活的結果， 故不作后續(xù)優(yōu)化. 不同的pH值會影響蛋白在溶液中的溶解度， 確定最佳的酶解pH值很有必要， 故選擇酶解時間(A)、 加酶量(B)及pH值(C)進行優(yōu)化. 表2為響應面的設計及結果.

表2 試驗設計與結果Tab. 2 Respond surface experimental design and results

利用Design-Expert V8.0.6 軟件回歸擬合， 模型方程如下：

Y=75.04+2.28A+4.51B-0.47C+0.45AB+0.026AC-0.24BC-2.31A2-4.82B2-2.06C2

表3為回歸方程的方差分析結果. 所得模型極顯著(P<0.000 1)， 誤差失擬項P=0.259 9(>0.05)， 表明此模型失擬不顯著， 此方程對試驗擬合度好[15].R2= 0.996， 接近1， 可以看出影響紫蘇籽蛋白酶解液DPPH自由基清除率的因素與所擇取的3個變量有99.6%的相關度. 因此應用該回歸模型能夠有效預測紫蘇籽多肽DPPH自由基清除能力.

表3 模型回歸方程方差分析Tab.3 ANOVA of regression equation

續(xù)表3

變異來源平方和自由度均方F值P值顯著性C1．7811．7810．080．0156?AB0．8310．834．670．0675AC0．002810．00280．0160．9030BC0．2410．241．350．2841A222．52122．52127．05<0．0001???B297．90197．90552．42<0．0001???C217．81117．81100．49<0．0001???回歸1．2470．18失擬0．7430．251．970．2599凈誤差0．5040．125總和359．3816R2=0．996R2Adj=0．99

注： ***表示P<0.001， 差異極顯著； *表示P<0.05， 差異顯著；P>0.05， 表示差異不顯著

2.4.1 各因素對紫蘇籽抗氧化肽DPPH自由基清除率的綜合影響分析

由表3可知， 因素水平項A、B、A2、B2和C2是極顯著水平，C是顯著水平， 交互作用水平項AB、BC和AC影響不顯著. 可通過各因素F值評價其對指標影響程度，F(xiàn)值越大， 影響越顯著[16].F(A)=234.15，F(xiàn)(B)=917.41，F(xiàn)(C)=10.08， 因此， 影響DPPH自由基清除率的順序為加酶量>酶解時間>pH值.

圖3直觀地給出了兩兩因素交互作用的響應面和等高線. 若響應面是凸狀， 等高線是橢圓， 則說明兩因素之間具有顯著的交互作用[17-18]. 由圖3(c)可知， 酶解時間A和加酶量B的交互作用顯著， 在pH=10.00時， 等高線沿B軸變化趨勢比沿A軸變化趨勢更快， 說明加酶量對酶解液抗氧化性的影響較酶解時間更大. 另外兩組曲線趨于平滑， 等高線接近圓形， 說明AC、BC具有不顯著的交互作用.

圖3 各因素的交互作用對紫蘇籽抗氧化肽DPPH自由基清除率影響的響應面和等高線Fig.3 Responsive surfaces and contour plot of the effect for every two factors on DPPH radical-scavenging activity

2.4.2 最佳酶解條件及驗證

由Design-Expert V8.0.6 軟件分析得最佳酶解條件為： 酶解時間5.08 h， 加酶量2 996 U·g-1， pH值9.86. 按照實驗可操作性， 將最佳條件調整為酶解時間5.00 h， 加酶量3 000 U·g-1， pH值9.80， 溫度50 ℃， 此條件下DPPH理論清除率為76.81%. 在此條件下進行3次驗證試驗， 測得實際DPPH自由基清除率為73.64%， 與理論值的相對誤差為[(76.81%-73.64%)/76.81%]×100=4.13%， 表明由響應面法得到的模型回歸方程及最佳條件可靠.

2.5 抗氧化活性測定

紫蘇籽粗蛋白經上述最優(yōu)酶解條件所得多肽液， 冷凍干燥后測定其抗氧化活性. 當紫蘇籽多肽質量濃度為1.0 mg·mL-1時， DPPH自由基清除率達89.15%， 同等質量濃度下GSH的清除率為93.13%. 說明在最優(yōu)酶解條件下獲得的紫蘇籽多肽具有媲美谷胱甘肽的抗氧化活性.

3 結語

通過比較不同的蛋白酶酶解紫蘇籽蛋白， 可知紫蘇籽蛋白經堿性蛋白酶酶解后具有更高的DH和抗氧化性. 通過單因素實驗和響應面分析實驗， 并建立數(shù)學模型及方差分析， 得出影響紫蘇籽蛋白酶解液DPPH自由基清除率的各因素主次順序是： 加酶量>酶解時間>pH值， 最佳工藝條件是： 酶解時間5.00 h， 加酶量3 000 U·g-1， pH值9.80， 溫度50 ℃. 實驗驗證在最佳條件下， DPPH自由基清除率為73.64%， 與所建立的數(shù)學模型在最佳條件下的理論值無顯著差異， 說明通過響應面分析法得到的回歸方程可較好地預測實驗結果. 質量濃度為1.0 mg·mL-1的紫蘇籽抗氧化肽DPPH自由基清除率達89.15%， 可見在最優(yōu)酶解條件下獲得的紫蘇籽多肽具有很好的抗氧化活性. 本研究結果為紫蘇籽抗氧化肽的制備、 開發(fā)和利用提供了理論依據(jù).

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StudyonpreparationofantioxidantpeptidesfromPerillaseed

HU Lei, CHEN Yibin, WANG Huimin, MENG Chun, HONG Jing, YE Nanhui

(College of Biological Science and Engineering, Fuzhou University, Fuzhou, Fujian 350116, China)

In the present study, the protein is extracted by alkali extraction and acid precipitation fromPerillaseed meal, and hydrolyzed by different proteases. The enzymatic hydrolysate by Alcalase have the highest degree of hydrolysis (DH) and DPPH radical-scavenging rates. Based on single factor test, design response surface method, establish mathematical model and determine the best technology. The results showed that all investigated parameters had also a notable effect on DPPH radical-scavenging activity of protein enzymolysis and could be ranked in decreasing order of importance in their effects as follows: protease dosage, time, pH value. The optimum conditions for protein enzymolysis as follow: time 5.00 h, protease dosage 3 000 U·g-1, pH value 9.80, temperature 50 ℃, DPPH radical-scavenging rate 73.64%. The results show that peptides have high antioxidant activity.

Perillaseed; antioxidant peptides; enzymolysis; response surface method

10.7631/issn.1000-2243.2017.05.0742

1000-2243(2017)05-0742-06

Q51

A

2016-03-16

洪晶(1981- )， 副教授， 主要從事食品生物技術的研究， jhong@fzu.edu.cn

福建省自然科學基金資助項目(2013J05050)； 福建省教育廳科研資助項目(JA11019， JA12034)； 福州大學科研啟動基金資助項目( 022304)

(責任編輯： 洪江星)