朱 凡， 林 娟， 李仁寬， 葉秀云

(福州大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院， 福建省海洋酶工程重點實驗室， 福建 福州 350116)

畢赤酵母工程菌發(fā)酵生產(chǎn)重組Cu/Zn-SOD的工藝研究

朱 凡， 林 娟， 李仁寬， 葉秀云

(福州大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院， 福建省海洋酶工程重點實驗室， 福建 福州 350116)

系統(tǒng)考察畢赤酵母工程菌GS115表達(dá)重組銅鋅超氧化物歧化酶(Cu/Zn-SOD)的發(fā)酵工藝參數(shù)， 優(yōu)化后5 L發(fā)酵罐上生產(chǎn)工藝為： 采用BSM培養(yǎng)基， 接種量5%(體積分?jǐn)?shù))， 發(fā)酵溫度35 ℃， 誘導(dǎo)期攪拌轉(zhuǎn)速900 r·min-1， pH值為6.0、 維持溶氧(DO)水平為飽和值的20%以上. 經(jīng)過142 h發(fā)酵實驗， SOD活力最高可達(dá)102.789 kU·mL-1， 比優(yōu)化前提高3.5倍. 采用畢赤酵母工程菌能實現(xiàn)高效、 大量制備優(yōu)質(zhì)動物來源的Cu/Zn-SOD重組蛋白， 具有良好的產(chǎn)業(yè)化潛力和廣泛的應(yīng)用前景.

超氧化物歧化酶； 畢赤酵母； 重組蛋白； 發(fā)酵工藝優(yōu)化

0 引言

超氧化物歧化酶(SOD, E.C. 1.15.1.1)是機(jī)體活性氧自由基清除反應(yīng)過程中第一個發(fā)揮作用的抗氧化酶， 在延緩衰老以及其他由自由基引起的疾病方面有很好的預(yù)防和治療功效. 目前已知的超氧化物歧化酶有4種類型： 銅鋅超氧化物歧化酶(Cu/Zn-SOD)、 錳超氧化物歧化酶(Mn-SOD)、 鐵超氧化物歧化酶(Fe-SOD)和鎳超氧化物歧化酶(Ni-SOD)， 其中Cu/Zn-SOD廣泛存在于大多數(shù)的哺乳動物和真菌[1]等真核生物細(xì)胞質(zhì)、 葉綠體和過氧化氫酶體內(nèi)， 是自然界中分布最為廣泛的一種超氧化物歧化酶， 同時也是目前應(yīng)用最為廣泛的超氧化物歧化酶[2-3].

目前市場上大多數(shù)超氧化物歧化酶(SOD)產(chǎn)品主要來源于動物血液、 內(nèi)臟等， 由于原材料有限、 純化困難等原因， 導(dǎo)致SOD的純度低、 產(chǎn)量少； 特別是隨著世界各地瘋牛病、 禽流感、 口蹄疫以及由動物傳播的SARS等惡性傳染病的疫情不時發(fā)生， 生產(chǎn)動物源血液制品的風(fēng)險加大； 此外， 對產(chǎn)品純度要求的提高也增加了生產(chǎn)成本. 隨著基因工程技術(shù)的發(fā)展， 微生物、 植物和動物等不同來源的SOD基因被克隆表達(dá)， 其中人和動物源的SOD因為酶分子量較小和同源性高， 具有良好的應(yīng)用前景. Yu[4]將Saccharomycescerevisiae中的Cu/Zn-SOD導(dǎo)入Pichiapastoris中表達(dá)， 重組酶活力大約為1 000 U·mL-1. 施惠娟等[5]以人胎肝組織總RNA為模板， 逆轉(zhuǎn)錄擴(kuò)增了cDNA， 構(gòu)建表達(dá)質(zhì)粒后轉(zhuǎn)入E.coli， 經(jīng)誘導(dǎo)表達(dá)酶活可達(dá)1 797 U·mL-1. 實驗室前期構(gòu)建了表達(dá)梅花鹿源銅鋅超氧化物歧化酶的重組工程菌PichiapastorisGS115-pPIC9K-SOD， 5 L發(fā)酵罐上初步實驗重組酶表達(dá)量可達(dá)3 500 U·mL-1[6]， 若能通過對發(fā)酵工藝參數(shù)的優(yōu)化提供有效科學(xué)數(shù)據(jù)， 進(jìn)一步提高生產(chǎn)強(qiáng)度， 縮短發(fā)酵周期， 可為重組銅鋅超氧化物歧化酶的工業(yè)化生產(chǎn)及應(yīng)用奠定良好基礎(chǔ).

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株

表達(dá)梅花鹿源銅鋅超氧化物歧化酶的重組工程菌PichiapastorisGS115-pPIC9K-SOD由福州大學(xué)福建省海洋酶工程重點實驗室自行構(gòu)建并保存.

1.1.2 培養(yǎng)方法

10*D溶液： 200 g·L-1葡萄糖溶液.

YP培養(yǎng)基： Yeast Extract 10 g·L-1， Tryptone 20 g·L-1.

YPD培養(yǎng)基： 滅菌后的YP加入10%(體積分?jǐn)?shù))的10*D溶液， YPD斜面及固體培養(yǎng)基中加入20 g·L-1瓊脂.

基礎(chǔ)鹽培養(yǎng)基(basal salts medium， BSM)及PTM1： 參照Invitrogen公司的畢赤酵母發(fā)酵手冊[7]配制.

基礎(chǔ)鹽培養(yǎng)基(BSM)： CaSO40.93 g·L-1， K2SO418.20 g·L-1， KOH 4.13 g·L-1， MgSO4·7H2O 14.90 g·L-1， Glucose 40.00 g·L-1， H3PO426.70 mL·L-1， PTM1 4.35 mL·L-1， 0.20 g·L-1生物素4.35 mL·L-1， CuSO4·5H2O 0.125 g·L-1， ZnCl20.068 g·L-1， 工業(yè)級消泡劑1.00 mL·L-1.

PTM1溶液： CuSO4·5H2O 6.00 g·L-1， NaI 0.08 g·L-1， MnSO43.00 g·L-1， Na2MoO4·2H2O 0.20 g·L-1， 硼酸0.02 g·L-1， CoCl20.50 g·L-1， ZnCl220.00 g·L-1， FeSO465.00 g·L-1， 生物素0.20 g·L-1， H2SO45.00 g·L-1.

補(bǔ)料培養(yǎng)基： 稱取100 g無水葡萄糖溶解于蒸餾水中并定容至500 mL， 再加入12 mL·L-1PTM1溶液.

甲醇溶液： 含PTM1溶液1.2%(體積分?jǐn)?shù))的甲醇.

發(fā)酵： 5 L臺式小型玻璃發(fā)酵罐(上海洋格生物工程設(shè)備有限公司)， 裝液比40%(體積分?jǐn)?shù))， 接種量5%(體積分?jǐn)?shù)， 以下同)， pH值、 溫度和攪拌轉(zhuǎn)速均采用控制系統(tǒng)自動控制.

1.1.3 主要藥品與試劑

Cu/Zn-SOD活性測試盒購自南京建成科技有限公司(羥胺法)； Yeast Extract 和Tryptone 購自O(shè)XOID公司； 生物素購自生工生物工程(上海)股份有限公司； 甲醇、 葡萄糖及其它常規(guī)藥品均為國產(chǎn)分析純試劑.

1.2 實驗方法

1.2.1 SOD活力測定方法

按照南京建成科技公司超氧化物歧化酶測試盒說明書(貨號： A001-1羥胺法)操作.

酶活力單位定義為： 每毫升反應(yīng)液中SOD抑制率達(dá)對照值的50%時所對應(yīng)的SOD量為一個活力單位(U).

酶活力單位計算：

式中：μ為SOD酶活力， U·mL-1；A0為對照管550 nm下吸光值；A1為樣品管550 nm下吸光值；V0為反應(yīng)液體積， mL；V1為樣品液體積， mL；n為樣品稀釋倍數(shù).

1.2.2 菌體生物量的測定

采用濕重法測定發(fā)酵過程中的菌體生長情況. 取2 mL發(fā)酵液于已烘干并稱重的2 mL離心管內(nèi)， 10 000 r·min-1離心10 min， 棄上清， 稱量沉淀的質(zhì)量， 每樣測3組平行. 設(shè)菌體濕重為ρ(g·L-1)， 則ρ為：

式中：m為離心后沉淀的質(zhì)量， g；V為離心前發(fā)酵液的體積， mL.

2 結(jié)果與討論

2.1 5 L發(fā)酵罐中畢赤酵母工程菌GS115生長曲線和產(chǎn)酶曲線的測定

圖1 發(fā)酵罐中畢赤酵母工程菌的生長和產(chǎn)酶曲線Fig.1 Profile of Cu/Zn-SOD production by Pichia pastoris in fermentors

將畢赤酵母工程菌GS115先經(jīng)過YPD種子培養(yǎng)基(初始pH 值6.0)培養(yǎng)15 h， 再以5%接種量接入BSM培養(yǎng)基(初始pH 值5.0)， 培養(yǎng)溫度30 ℃， 參考Siegel等提出的畢赤酵母發(fā)酵生產(chǎn)重組蛋白的工藝確定發(fā)酵條件參數(shù)[7]， 測定發(fā)酵過程中菌體濕重與酶活力的變化曲線， 見圖1.

在起始階段-菌體生長階段， 用氨水維持pH值為5.0培養(yǎng)23 h， 期間溶氧逐漸下降時， 逐漸增大轉(zhuǎn)速至600 r·min-1使溶氧在不低于飽和值20%的范圍內(nèi)波動. 初始碳源耗盡后溶氧會快速上升至高于飽和值的80%， 此時以18 mL·h-1的速度連續(xù)流加200 g·L-1的葡萄糖溶液8 h， 并增大通氣量至0.6 L·min-1， 維持溶氧在飽和值的20%以上的范圍內(nèi)波動， 到該階段末期(31 h左右)， 菌體濕重達(dá)140 g·L-1.

在誘導(dǎo)階段， 以6 mL·h-1的速度流加甲醇溶液， 使培養(yǎng)基中甲醇終濃度不高于0.3% (體積分?jǐn)?shù))， 采用攪拌轉(zhuǎn)速與溶氧水平關(guān)聯(lián)控制， 維持溶氧在飽和值的20%以上的范圍內(nèi)波動. 發(fā)酵190 h時， 菌體濕重達(dá)314 g·L-1， 重組SOD的表達(dá)水平達(dá)22.727 kU·mL-1.

2.2 攪拌轉(zhuǎn)速對重組SOD表達(dá)量的影響

畢赤酵母在誘導(dǎo)階段氧需求量很高， 溶氧往往成為誘導(dǎo)階段的限制因子[8]. 發(fā)酵過程中的轉(zhuǎn)速、 通氣量、 罐壓、 補(bǔ)料速率等都會影響溶氧量， 在通氣量(0.3～0.9 L·min-1)和罐壓調(diào)整范圍有限的前提下， 攪拌轉(zhuǎn)速的改變將成為決定發(fā)酵過程DO值的主要因素.

實驗設(shè)置3組平行實驗， 除了誘導(dǎo)期的攪拌轉(zhuǎn)速分別設(shè)定為700、 800和900 r·min-1以外， 其余發(fā)酵條件均保持一致: 裝液量2 L， 接種量5%， 發(fā)酵溫度30 ℃， pH值為5.0， 罐壓0.02～0.03 MPa， 取樣測定發(fā)酵過程菌體濕重和酶活力變化， 實驗結(jié)果如圖2、 3所示.

圖2 不同攪拌轉(zhuǎn)速下畢赤酵母工程菌的生長情況Fig.2 Effects of agitation rate on the growth of Pichia pastoris in fermentors

圖3 不同轉(zhuǎn)速對畢赤酵母工程菌的產(chǎn)酶影響Fig.3 Effects of agitation rate on the enzyme production of Pichia pastoris in fermentors

由圖2可知， 菌體生長階段至49 h， 菌體濕重已累積達(dá)150 g·L-1. 隨后進(jìn)入誘導(dǎo)期， 700 r·min-1轉(zhuǎn)速實驗組菌體濕重緩慢增加， 最大濕重值為299 g·L-1， 僅為900 r·min-1轉(zhuǎn)速實驗組最大濕重值(415 g·L-1)的72%； 800 r·min-1轉(zhuǎn)速實驗組最大濕重值為355 g·L-1， 介于另外兩個實驗組的數(shù)據(jù)之間. 由此可見， 在菌體剪切力承受的合理范圍內(nèi)， 隨著誘導(dǎo)期攪拌轉(zhuǎn)速的提高， 發(fā)酵罐內(nèi)溶氧量增加， 菌體代謝速率加快， 菌體累積量提高.

由圖3可知， 進(jìn)入誘導(dǎo)期后不同轉(zhuǎn)速實驗組樣品中SOD活力都隨著時間的延長而增加. 在誘導(dǎo)期的前60 h不同轉(zhuǎn)速實驗組的SOD酶活力相差不大， 發(fā)酵至142 h左右， 酶活開始快速增加， 并且在190 h左右出現(xiàn)峰值并維持相對穩(wěn)定. 700 r·min-1轉(zhuǎn)速實驗組最大酶活力為22.727 kU·mL-1； 800 r·min-1轉(zhuǎn)速實驗組最大酶活力為33.865 kU·mL-1， 是700 r·min-1轉(zhuǎn)速實驗組最大酶活力的1.5倍； 900 r·min-1轉(zhuǎn)速實驗組最大酶活力為50.431 kU·mL-1， 是700 r·min-1轉(zhuǎn)速實驗組的2.24倍， 是800 r·min-1轉(zhuǎn)速實驗組的1.49倍. 以上實驗結(jié)果表明， 在一定范圍內(nèi)， 攪拌轉(zhuǎn)速越高， 發(fā)酵罐中溶氧量越多， 畢赤酵母生長越好， SOD表達(dá)量也越高.

2.3 pH值分段控制對重組SOD表達(dá)量的影響

發(fā)酵環(huán)境的pH值不僅影響著菌體的生長和目標(biāo)蛋白的活性及表達(dá)量， 同時對表達(dá)蛋白的分泌和發(fā)酵液中蛋白酶的活力均有影響. 畢赤酵母在pH值 3～7范圍內(nèi)均可生長及表達(dá)目的蛋白， 降低 pH值有利于抑制發(fā)酵液中蛋白酶活性， 所以對于蛋白酶敏感的酶系， 降低發(fā)酵 pH值可以有效提高目的蛋白的表達(dá)量； 但偏低的pH環(huán)境會導(dǎo)致畢赤酵母體內(nèi)部分酶系的酶活力下降， 并且降低pH值會影響目的蛋白的穩(wěn)定性及降解程度[9]. 綜上， 雖然畢赤酵母耐受pH值的范圍較寬， 但在實際發(fā)酵生產(chǎn)過程中pH值一般選用4～6[10].

為考察不同pH值對畢赤酵母工程菌發(fā)酵生產(chǎn)重組SOD過程生長階段和誘導(dǎo)階段的影響， 實驗在控制其余發(fā)酵條件不變的情況下， 設(shè)置分段控制pH值范圍的策略， 列于表1， 所得實驗結(jié)果如圖4、 5所示.

表1 不同pH值控制策略對重組SOD表達(dá)的影響Tab.1 Effects of different pH value controlling strategies in 5L fermentors

由實驗結(jié)果可知， 在菌體生長階段， 升高pH值導(dǎo)致菌體生長加快， 提前進(jìn)入誘導(dǎo)期， 但誘導(dǎo)期最高菌體濕重值反而略有下降. 而隨著pH值升高， 重組SOD活力顯著增加. 全程控制pH 值6.0發(fā)酵172 h后重組SOD最大活力為78.152 kU·mL-1， 分別是全程控制pH值 5.0實驗組的2.01倍和分段控制pH值實驗組的1.12倍. 可見， 選擇合適的誘導(dǎo)pH值條件可以大幅度提高重組SOD的表達(dá)量， 優(yōu)化后的發(fā)酵過程pH值確定為6.0.

圖4 pH值分段控制對畢赤酵母工程菌生長的影響Fig.4 Effects of different pH value controlling strategies on the growth of Pichia pastoris

圖5 pH值分段控制對重組SOD表達(dá)量的影響Fig.5 Effects of different pH value controlling strategies on the expression of recombinant SOD

2.4 溫度對重組SOD表達(dá)量的影響

前期工作中發(fā)現(xiàn)， 搖瓶實驗中的溫度對畢赤酵母表達(dá)目的蛋白有重要影響[6]， 實驗在控制其余發(fā)酵條件不變的情況下， 比較了不同培養(yǎng)溫度對發(fā)酵過程的影響， 實驗結(jié)果如圖6、 7所示. 由圖6可知， 控制發(fā)酵溫度為30和35 ℃， 對生物量累積影響不大， 35 ℃下生物量略有降低； 但在35 ℃下SOD活力(102.789 kU·mL-1)比30 ℃下(78.512 kU·mL-1)提高了30.9%， 而且在35 ℃下發(fā)酵達(dá)到產(chǎn)酶高峰所需的時間(142 h)要比30 ℃下(190 h)減少48 h， 顯著縮短了發(fā)酵周期.

圖6 發(fā)酵溫度對畢赤酵母工程菌生長的影響Fig.6 Effects of different fermentation temperatures on the growth of Pichia pastoris

圖7 發(fā)酵溫度對重組SOD表達(dá)量的影響Fig.7 Effects of different fermentation temperatures on the expression of recombinant SOD

據(jù)文獻(xiàn)[10-12]報道， 在誘導(dǎo)階段適當(dāng)降低溫度有利于提高蛋白穩(wěn)定性和表達(dá)重組蛋白， 這主要是因為： ① 發(fā)酵溫度會影響畢赤酵母的代謝速率， 溫度過低會抑制其生長， 造成發(fā)酵周期延長等不利影響[12]； ② 畢赤酵母GS115并非蛋白酶缺陷型菌株， 不可避免地會產(chǎn)生蛋白酶， 發(fā)酵條件的變化對發(fā)酵液中蛋白酶含量產(chǎn)生影響， 從而影響重組蛋白的積累， 比如采用較低溫度、 較低pH值、 甘油-甲醇混飼都能一定程度緩解由于蛋白酶酶解目標(biāo)蛋白造成的產(chǎn)物活力不高的問題； ③ 溫度降低時攝氧率(OUR)和二氧化碳釋放率(CER)、 醇氧化酶(AOX)基因轉(zhuǎn)錄水平均有所提高， 從而影響外源蛋白產(chǎn)量； ④ 誘導(dǎo)溫度會影響外源蛋白的聚合情況， 低溫時有利于外源蛋白的正確折疊， 有研究表明隨著溫度的增高， 重組蛋白單體通過二硫鍵形成二聚體蛋白量大大增加[13-14].

而實驗卻發(fā)現(xiàn)畢赤酵母在35 ℃下產(chǎn)酶能力更高， 分析其原因， 可能是： 隨著溫度的升高， 含有半胱氨酸的重組SOD大量形成二硫鍵， 從而增加蛋白的聚合度， 形成二聚體甚至多聚體. 二硫鍵斷開或者還原都可能導(dǎo)致蛋白發(fā)生構(gòu)象變化， 引起酶活力增加或者減少甚至消失[15]. 實驗中表達(dá)的梅花鹿來源Cu/Zn-SOD蛋白天然狀態(tài)下在梅花鹿體內(nèi)以二聚體或多聚體形式存在， 二硫鍵或二聚體的形成有可能改善了目的蛋白SOD的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性和催化效率， 從而促進(jìn)酶活力的提高.

3 結(jié)語

采用微生物工程菌重組表達(dá)SOD已有大量報道[1-2]， 但對梅花鹿來源Cu/Zn-SOD的研究較少， 限制了其應(yīng)用的推廣. 為進(jìn)行鹿源Cu/Zn-SOD的大量制備， 系統(tǒng)考察畢赤酵母工程菌GS115的發(fā)酵過程各項參數(shù)， 優(yōu)化后的5 L發(fā)酵罐生產(chǎn)工藝為： 采用BSM培養(yǎng)基， 控制在pH值 6.0、 溶氧不低于飽和值的20%、 攪拌轉(zhuǎn)速900 r·min-1、 溫度35 ℃下發(fā)酵142 h， 重組Cu/Zn-SOD的最高活力可達(dá)102.789 kU·mL-1， 比優(yōu)化前(22.727 kU·mL-1)提高了3.5倍. 為實現(xiàn)梅花鹿Cu/Zn-SOD重組蛋白的工業(yè)化生產(chǎn)， 可考慮以成本更低、 產(chǎn)量穩(wěn)定的培養(yǎng)基替代價格較高的基礎(chǔ)鹽培養(yǎng)基BSM， 并采用攪拌轉(zhuǎn)速與通氣聯(lián)動的控制方式進(jìn)一步強(qiáng)化發(fā)酵過程中的傳氧效率， 同時深入研究溫度影響畢赤酵母工程菌產(chǎn)酶能力的相關(guān)機(jī)制. 實驗獲得的目標(biāo)蛋白可以減少對自然資源的依賴， 消除動物疾病所帶來的負(fù)面影響， 提高超氧化物歧化酶的應(yīng)用安全性； 同時， 超氧化物歧化酶產(chǎn)業(yè)化的實施將大大降低該酶的生產(chǎn)成本和市場價格， 使其應(yīng)用范圍更加廣闊， 也將帶來很好的經(jīng)濟(jì)和社會效益.

[1] 陳祥娥， 凌沛學(xué)， 張?zhí)烀? 超氧化物歧化酶的應(yīng)用[J]. 食品與藥品， 2013， 15(4)： 283-285； 286.

[2] 徐靖. 超氧化物歧化酶及其應(yīng)用的研究進(jìn)展[J]. 食品工業(yè)科技， 2013， 34(12)： 387-391.

[3] KODYDKOVA J, VAVROVA L, STANKOVA B,etal. Antioxidant status and oxidative stress markers in pancreatic cancer and chronic pancreatitis[J]. Pancreas, 2013, 42(4): 614-621.

[4] YU P. A new approach to the production of the recombinant SOD protein by methylotrophicPichiapastoris[J]. Applied Microbiology and Biotechnology, 2007, 74(1): 93-98.

[5] SHI H, FAN L, WEI D,etal. Cloning, sequencing and expression of human copper, zinc-superoxide dismutase cDNA[J]. Acta Biochimica et Biophysica Sinica, 1999, 31(1): 16-18.

[6] LI R K, FU C L, CHEN P,etal. High-level expression of a sika deer (Cervusnippon) Cu/Zn superoxide dismutase inPichiapastorisand its characterization[J]. Environmental Toxicology & Pharmacology, 2013, 35(2): 185-192.

[7] SIEGEL R S, BRIERLEY R A. Methylotrophic yeastPichiapastorisproduced in high-cell-density fermentations with high cell yields as vehicle for recombinant protein production[J]. Biotechnol Bioeng, 1989, 34(3): 403-404.

[8] 李洪淼， 王紅寧， 許欽坤. 畢赤酵母高密度發(fā)酵研究進(jìn)展[J]. 生物技術(shù)通訊， 2005， 16(2)： 210-212.

[9] 范志華， 梁鵬， 田國軍， 等. 酵母菌受脅迫條件影響積累SOD的研究[J]. 食品與發(fā)酵工業(yè)， 2009， 35(11)： 60-63.

[10] 閔兆升， 郭會明， 顏旭， 等. 巴斯德畢赤酵母(P.pastoris)高密度發(fā)酵研究進(jìn)展[J]. 生物技術(shù)通報， 2014(3)： 42-49.

[11] 林福來. 基因劑量及培養(yǎng)溫度對β-甘露聚糖酶在畢赤酵母中表達(dá)的影響[D]. 長沙： 中南大學(xué)， 2013.

[12] 廖錫豪， 陳明祥， 謝萬勇， 等. 低溫誘導(dǎo)對畢赤酵母表達(dá)重組外源蛋白的影響[J]. 中國釀造， 2013， 32(2)： 9-12.

[13] 王同春， 喻曉蔚， 徐巖. 誘導(dǎo)溫度調(diào)控華根霉(Rhizopuschinensis)前導(dǎo)肽脂肪酶的表達(dá)及穩(wěn)定性研究[J]. 工業(yè)微生物， 2010， 40(4)： 34-39.

[14] 史琪琪， 郝玉有， 吳康， 等. 誘導(dǎo)相溫度對畢赤酵母表達(dá)重組人復(fù)合α干擾素聚合的影響[J]. 生物工程學(xué)報， 2006， 22(2)： 311-315.

[15] 徐國恒. 二硫鍵與蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)[J]. 生物學(xué)通報， 2010， 45(5)： 5-7.

OptimizationofrecombinantCu/Zn-SODproductionbyPichiapastorisinbench-topfermentors

ZHU Fan， LIN Juan， LI Renkuan， YE Xiuyun

(Fujian Provincial Key Laboratory of Marine Enzyme Engineering，College of Biological Science and Technology，F(xiàn)uzhou University， Fuzhou, Fujian 350116, China)

In this study, detailed investigations were performed on effective production in 5 L bench-top fermentor of a sika deer Cu/Zn-SOD byPichiapastoris. The process parameters of recombinant SOD production were optimized to set up an appropriate fermentation procedure as follows: BSM medium, inoculum rate of 5%(volume fraction), temperature of 35 ℃, agitation rate of 900 r·min-1during the induction stage, pH value of 6.0, DO level above 20% of the saturated value, and the cultivation period of 142 h. Under the optimal conditions, the SOD activity in the broth could reach as high as 102.789 kU·mL-1, which was increased by 3.5 folds. The results above established a highly effective fermentation procedure for industrial production of the recombinant sika deer Cu/Zn-SOD byPichiapastoristhat presented significant application prospect in future.

superoxide dismutase；Pichiapastoris； recombinant proteins； fermention optimization

10.7631/issn.1000-2243.2017.05.0736

1000-2243(2017)05-0736-06

TQ920.6

A

2016-03-12

林娟(1970-)， 教授， 主要從事微生物資源開發(fā)與利用方面的研究， ljuan@fzu.edu.cn

福建省高校產(chǎn)學(xué)合作重大資助項目(2013N5005)

(責(zé)任編輯： 洪江星)