薛英++++++王永炫

[摘要] 目的 觀察高脂飲食對絕經(jīng)后雌性SD（sprague-dawiey）大鼠骨微結(jié)構(gòu)、骨組織白介素-6（IL-6）及巨噬細(xì)胞集落刺激因子（M-CSF）mRNA的影響，探討高脂對骨微結(jié)構(gòu)的影響及其可能的發(fā)病機(jī)制。 方法 將40只6月齡雌性SD大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)+普通飼料飼養(yǎng)組（SHAM組）、假手術(shù)+高脂飼料飼養(yǎng)組（HFD組）、去卵巢+普通飼料組（OVX組）、去卵巢+高脂飼料飼養(yǎng)組（OVX+HFD組），每組10只。6個月后用微計(jì)算機(jī)斷層掃描（Micro-CT）等方法檢測大鼠右側(cè)脛骨的骨微結(jié)構(gòu)。用實(shí)時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（Realtime RT-PCR） 測量大鼠左側(cè)股骨中IL-6和M-CSF mRNA的表達(dá)差異。 結(jié)果 6個月后，OVX 組的骨體積（BV/TV）、骨小梁數(shù)目（Tb.N）、骨小梁厚度（Tb.Th）低于SHAM組，骨小梁分離度（Tb.Sp）大于SHAM組（P<0.05）；OVX 組BV/TV、Tb.N均大于OVX+HFD組，Tb.Sp小于OVX+HFD組（P<0.05）；SHAM組 BV/TV、Tb.N、Tb.Th高于SHAM+HFD組， SHAM + HFD與OVX組相比，除Tb.N外，其BV/TV、Tb.Th及Tb.Sp均無明顯差異（P>0.05）。OVX組M-CSF和IL-6 mRNA的表達(dá)均高于SHAM組（P<0.05）。SHAM的 M-CSF和IL-6 mRNA的表達(dá)低于SHAM+HFD組（P<0.05），SHAM+HFD的M-CSF和IL-6 mRNA的表達(dá)低于OVX組（P<0.05），但OVX組與OVX+HFD組比較，M-CSF和IL-6 mRNA的表達(dá)無顯著差異（P>0.05）。 結(jié)論 高脂引起的骨微結(jié)構(gòu)的改變有可能是通過提高IL-6、M-CSF mRNA水平，導(dǎo)致破骨細(xì)胞活性增強(qiáng)、骨吸收增加引起的。

[關(guān)鍵詞] 高脂飲食；骨質(zhì)疏松癥；骨微結(jié)構(gòu)；白介素-6；巨噬細(xì)胞集落刺激因子

[中圖分類號] R392 [文獻(xiàn)標(biāo)識碼] A [文章編號] 1673-9701（2017）31-0035-05

[Abstract] Objective To observe the effects of high-fat diet on bone microstructure， bone interleukin-6（IL-6）and macrophage colony-stimulating factor（M-CSF）mRNA in postmenopausal female SD rats（Sprague-dawiey）， and to explore the impact of high fat on bone microstructure and its potential pathogenesis. Methods A total of 40 female SD rats with 6 months old were randomly divided into sham operation+normal feed group（SHAM group）， sham operation+ high-fat feed group（HFD group）， ovariectomized+ normal feed group（OVX group）and ovariectomized+ high-fat feed group（OVX + HFD group）， with 10 rats in each group. After 6 months， microcomputer tomography（Micro-CT） and other methods were used to detect the bone microstructure of the right tibia. Realtime PT-PCR was used to measure the expression difference of IL-6 and M-CSF mRNA in the left femur of the rats. Results After 6 months， the bone volume（BV/TV）， the number of trabecular bone（Tb.N）and trabecular bone thickness（Tb.Th）in the OVX group were significantly lower than those in SHAM group， while the separation of trabecular bone（Tb.Sp）was higher than that in SHAM group（P<0.05）； BV/TV， Tb.N in OVX group were higher than those in OVX + HFD group， and Tb.Sp was lower than that in OVX + HFD（P<0.05）； BV/TV， Tb.N， Tb.Th in SHAM group were all higher than those in SHAM + HFD group. Compared with OVX group， other than Tb.N， BV/TV， Tb.Th and Tb.Sp in SHAM + HFD group were not significantly different（P>0.05）. The expression of M-CSF and IL-6 mRNA in OVX group was higher than that in SHAM group（P<0.05）. The expression of M-CSF and IL-6 mRNA in SHAM group was lower than that in SHAM + HFD group（P<0.05）. The expression of M-CSF and IL-6 mRNA in SHAM + HFD group was lower than that in OVX group（P<0.05）. However， there was no significant difference in the expression of M-CSF and IL-6 mRNA between OVX group and OVX + HFD group（P>0.05）. Conclusion Changes in bone microstructure induced by high fat may be caused by increased IL-6 and M-CSF mRNA levels， resulting in enhanced osteoclast activity and increased bone resorption.endprint

[Key words] High-fat diet；Osteoporosis；Bone microstructure；Interleukin-6（IL-6）； Macrophage colony-stimulating factor（M-CSF）

研究表明，高脂飲食可以導(dǎo)致肥胖、糖尿病、冠心病、動脈粥樣硬化、胰島素抵抗等一系列疾病，近年來越來越多的研究發(fā)現(xiàn)，高脂飲食隨后引起的膽固醇（total cholesterol，TC）和低密度脂蛋白膽固醇（low density lipoprotein cholesterol，LDLC）及甘油三酯（triglyceride，TG）水平的升高，高密度脂蛋白膽固醇（high density lipoprotein cholesterol，HDLC）水平降低，與骨質(zhì)疏松癥密切相關(guān)，高脂引起骨質(zhì)疏松的機(jī)制包括骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向成骨分化減弱、成脂分化增強(qiáng)[1]；高脂血癥時脂質(zhì)氧化產(chǎn)物能促進(jìn)活性氧簇（ROS）形成，導(dǎo)致氧化應(yīng)激增強(qiáng)[2]，且與炎癥因子的激活有關(guān)。高脂飲食能引起胰島素抵抗、肝臟IL-6水平升高[3]，但其對骨組織IL-6和M-CSF的影響仍未見報道，是否通過增加IL-6，M-CSF的表達(dá)影響破骨活性亟待進(jìn)一步驗(yàn)證，本文就高脂飲食喂養(yǎng)后骨微結(jié)構(gòu)及骨組織IL-6、M-CSF mRNA表達(dá)做一探討。

1材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物與飼料

實(shí)驗(yàn)動物為福建醫(yī)科大學(xué)提供的6月齡清潔級雌性SD（sprague-dawiey）大鼠，實(shí)驗(yàn)動物許可證號：SYXK（閩2016-0007），動物飼料購自福建醫(yī)科大學(xué)，高脂飼料購自江蘇協(xié)同生物，配方見表1。

1.2方法

6月齡清潔級雌性SD（sprague-dawiey）大鼠40只，體重（300±20）g，分籠飼養(yǎng)，室溫（20±3）℃，相對濕度40%～60%，給予不同類型的飼料，自由飲水。將40 只SD大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組（SHAM組，n=20）與去卵巢組（OVX組，n=20），用l0%水合氯醛0.3 mL/l00 g腹腔注射麻醉，后打開腹腔，OVX組摘除雙側(cè)卵巢，SHAM組僅切除卵巢附近與卵巢等大的脂肪組織。術(shù)后所有大鼠均予肌內(nèi)注射青霉素5 萬U/d，持續(xù)3 d，預(yù)防感染。

術(shù)后，去卵巢組進(jìn)一步分為去卵巢后高脂飼料飼養(yǎng)組（OVX+HFD組）和去卵巢后普通飼料飼養(yǎng)組（OVX組），每組各10只。假手術(shù)組分為假手術(shù)后高脂飼料飼養(yǎng)組（SHAM+HFD組）和假手術(shù)后普通飼料飼養(yǎng)組（SHAM），每組10只。

1.3干預(yù)措施

高脂飼料喂養(yǎng)6個月后，拖頸處死，用微計(jì)算機(jī)斷層掃描（micro-CT，型號：SCANCO VIVACT40）檢測大鼠右側(cè)脛骨骨微結(jié)構(gòu)；用實(shí)時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)法（Realtime RT-PCR）（TP800， 日本TaKaRa）檢測大鼠左股骨M-CSF和IL-6 mRNA的表達(dá)。

1.4 檢測指標(biāo)

1.4.1 Micro-CT 各組右側(cè)脛骨Micro-CT骨組織掃描：參數(shù)為：掃描分辨率：50 μm，旋轉(zhuǎn)角度：360 度，旋轉(zhuǎn)角度增：0.72 度，電壓：70 kVP，功率：40 W，幀平均數(shù)：6，像素組合：1×1。BV/TV：相對骨體積，Tb.N：骨小梁數(shù)目，Tb.Sp：骨小梁分離度，Tb.Th.：骨小梁平均厚度。

1.4.2 Realtime PCR 各組大鼠左股骨， 采用Realtime RT-PCR（TP800，日本TaKaRa）檢測左股骨組織。

表達(dá)引物設(shè)計(jì)、骨組織總RNA提取、聚合酶鏈反應(yīng)及目的基因相對量的計(jì)算參照相關(guān)文獻(xiàn)[4]。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 23.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，所得正態(tài)分布的計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用LSD-t 檢驗(yàn)，多組間計(jì)量單位比較采用方差分析及SNK法。兩組計(jì)量資料變量間相關(guān)性比較采用線性相關(guān)分析。計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Micro-CT檢測右側(cè)脛骨的骨微結(jié)構(gòu)

各組大鼠高脂飼養(yǎng)6個月后，予Micro-CT檢測各組右側(cè)脛骨的骨微結(jié)構(gòu)（圖1）及微結(jié)構(gòu)參數(shù)（圖2），OVX 組的BV/TV、Tb.N、Tb.Th低于SHAM組，Tb.Sp大于SHAM組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05或P<0.001），表明造模成功。OVX 組與OVX+HFD組比較，其BV/TV、Tb.N均大于OVX+HFD組，Tb.Sp小于OVX+HFD組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05或P<0.001），但其Tb.Th，兩組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。SHAM組與SHAM+HFD組比較，其BV/TV、Tb.N、Tb.Th高于SHAM+HFD組（P<0.01），但Tb.Sp，兩組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。SHAM + HFD組與OVX組比較，除Tb.N外，其BV/TV、Tb.Th及Tb.Sp均無明顯差異（P>0.05）。見圖2。

2.2 各組大鼠股骨M-CSF和IL-6 mRNA表達(dá)的影響

高脂飼養(yǎng)6個月后，檢測左側(cè)股骨M-CSF和IL-6 mRNA的表達(dá)情況。結(jié)果表明，OVX組與SHAM組比較，其M-CSF和IL-6 mRNA的表達(dá)均高于SHAM組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.001）。SHAM組與SHAM+HFD組比較，其M-CSF和IL-6 mRNA的表達(dá)低于SHAM+HFD組（P<0.001），SHAM+HFD組與OVX組，其M-CSF和IL-6 mRNA的表達(dá)低于OVX組（P<0.001），但OVX組與OVX+HFD組比較，M-CSF和IL-6 mRNA的表達(dá)無顯著差異（P>0.05）。見圖3、4。

3 討論endprint

構(gòu)成骨骼健康和力量的重要因素不僅包括骨礦物質(zhì)密度，而且還包括骨微觀結(jié)構(gòu)的特征[5-6]。Micro-CT是一個常用于評估骨微觀結(jié)構(gòu)的有效測量方法，其提供了量化的結(jié)構(gòu)信息，包括骨區(qū)、骨體積分?jǐn)?shù)、骨小梁數(shù)量、骨小梁厚度及骨小梁分離度之間具體的參數(shù)，并且骨微觀結(jié)構(gòu)的三維重建[7]。

近幾年在肥胖和骨骼健康的相關(guān)性中有許多報道。當(dāng)伴隨著肥胖、血膽固醇、中性脂肪和低密度脂蛋白膽固醇升高，出現(xiàn)骨密度及骨微結(jié)構(gòu)改變，骨折風(fēng)險增加[8]，在一項(xiàng)小鼠模型中，由于高脂飲食導(dǎo)致的肥胖，出現(xiàn)骨髓脂肪的增加，Micro-CT所檢測的骨密度及骨微結(jié)構(gòu)的改變，即使減重后，對已造成的骨丟失仍無法恢復(fù)，表明高脂對骨質(zhì)量的改變是長期、持續(xù)性的損害[9]。研究表明，假手術(shù)組SD大鼠分別經(jīng)高脂飼料及普通飼料飼養(yǎng)6個月后，高脂組骨小梁厚度和數(shù)目減少，骨小梁分離度增加，在三維結(jié)構(gòu)中，高脂飼料飼養(yǎng)的大鼠，與普通飼料飼養(yǎng)的大鼠比較，骨小梁較為稀疏，厚度變薄，且小梁與小梁間的連接中斷，這些微結(jié)構(gòu)的變化導(dǎo)致骨小梁總數(shù)下降，骨質(zhì)量下降。且去除卵巢后，高脂飲食能夠進(jìn)一步加重骨丟失（圖3、4），與目前國內(nèi)外的報道一致。

引起骨質(zhì)疏松的主要原因在于骨微環(huán)境中成骨與破骨的失衡。高脂飲食后導(dǎo)致的機(jī)體脂代謝異常，繼發(fā)骨質(zhì)疏松，可能與以下因素有關(guān)：（1） 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向成脂分化增強(qiáng)，成骨分化減弱，其中包括骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2（BMP-2）活性的抑制，而過氧化物酶體增殖物激活受體γ（PPARγ）活性的增強(qiáng)[9]；（2）與骨組織中脂質(zhì)的持續(xù)聚集有關(guān)；（3）持續(xù)聚集的脂質(zhì)會導(dǎo)致糖基化和氧化修飾，從而誘發(fā)炎癥反應(yīng)以及氧化應(yīng)激的發(fā)生，炎癥因子增加，如白介素-1（IL-1）、白介素-6（IL-6）、腫瘤壞死因子α（TNF-α）等 [10-12]。

IL-6是由T、B細(xì)胞和纖維母細(xì)胞、單核巨噬細(xì)胞以及成骨細(xì)胞激活后分泌而成。絕經(jīng)后，雌激素水平的急劇下降，導(dǎo)致成骨表面的雌激素受體對IL-6的抑制下降，IL-6形成增加。高脂引起的IL-6升高的原因之一與胰島素抵抗有關(guān)，合并代謝綜合征患者（如肥胖、糖尿病等），體內(nèi)一般存在較高水平的IL-6[13]。IL-6能夠促進(jìn)脂肪前體細(xì)胞向脂肪細(xì)胞轉(zhuǎn)化，抑制成骨前體細(xì)胞向成骨細(xì)胞轉(zhuǎn)化，成骨細(xì)胞形成減少，骨細(xì)胞合并骨膠原的能力下降，抑制骨形成。大鼠高脂喂養(yǎng)8周即可產(chǎn)生胰島素抵抗[14]。而脂肪細(xì)胞生成增多導(dǎo)致的肥胖進(jìn)一步促使炎癥因子合成[15]。本課題中，去卵巢6個月后，隨著IL-6的變化，其代表骨質(zhì)量的Tb.N，Tb.Th，BV/TV等微結(jié)構(gòu)參數(shù)下降，且予高脂喂養(yǎng)后，上述參數(shù)進(jìn)一步下降，IL-6 mRNA表達(dá)仍有上升趨勢，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。表明高脂喂養(yǎng)后，除IL-6外，可能還有其他的影響因素參與骨丟失。

在骨骼細(xì)胞形成分化的過程中，還有其他炎癥因子的參與。破骨細(xì)胞的成熟與分化信號之一是通過成骨細(xì)胞提供的M-CS與表達(dá)于破骨細(xì)胞前體細(xì)胞表面的同源受體c-fms進(jìn)行傳遞。M-CSF主要存在于骨髓腔中，它與RANKL同時作用于骨髓中破骨前體細(xì)胞的表達(dá)。本課題的前期實(shí)驗(yàn)中表明，絕經(jīng)后可以導(dǎo)致M-CSF水平的升高[4]，但在高脂環(huán)境下，其與骨微結(jié)構(gòu)的關(guān)系如何未見報道。本實(shí)驗(yàn)表明，絕經(jīng)后，普通飼料飼養(yǎng)組隨著骨質(zhì)量下降，M-CSF mRNA的表達(dá)升高，但高脂飼養(yǎng)后，IL-6未有進(jìn)一步變化。而SHAM組予高脂飼料飼養(yǎng)組，骨質(zhì)量下降，且出現(xiàn)M-CSF的上升。M-CSF調(diào)節(jié)骨代謝的機(jī)制如何？絕經(jīng)后，雌激素缺乏，可引起脂代謝及骨代謝的障礙。動脈粥樣硬化泡沫細(xì)胞與破骨細(xì)胞有同源性，均來源于骨髓的單核巨噬細(xì)胞系統(tǒng)。雌激素缺乏引起膽固醇及低密度脂蛋白等升高，脂質(zhì)斑塊沉著，同時對破骨細(xì)胞的抑制減弱，破骨細(xì)胞活性增強(qiáng)。研究表明，動脈粥樣硬化的脂質(zhì)沉著處M-CSF水平表達(dá)增加[16]，當(dāng)絕經(jīng)后，雌激素水平的下降誘使IL-1和TNF等表達(dá)增加，增加后又可進(jìn)一步引起“下游因子”IL-6，M-CSF的表達(dá)增加，破骨細(xì)胞活性增強(qiáng)，骨吸收增強(qiáng)。故M-CSF的增加可能為脂代謝異常和骨代謝異常的共同機(jī)制。

本實(shí)驗(yàn)?zāi)壳拜^為粗淺地分析高脂飲食與骨微結(jié)構(gòu)變化及炎癥因子表達(dá)的相關(guān)性，仍有許多深層次的機(jī)制有待進(jìn)一步的驗(yàn)證。

[參考文獻(xiàn)]

[1] Kajarabille N，Diaz-Castro J，Hijano S，et al.A new insight to bone turnover：Role of ω-3 polyunsaturated fatty acids[J]. Scientific World Journal，2013， 2013： 589641.

[2] Teppner M，Boss F，Ernst B，et al. Application of lipid peroxidation products as biomarkers for flutamide-induced oxidative stress in vitro[J]. Toxicol Lett，2015，238（3）：53-59.

[3] 向靜，阿布力克木·吐爾地，王寧. 胰島、肝細(xì)胞水平胰島素抵抗與系統(tǒng)胰島素抵抗關(guān)系的研究[J].新疆醫(yī)科大學(xué)學(xué)報，2011，34（1）：1-4.

[4] 薛英，侯建明，林慶明，等.乳鐵蛋白對去卵巢大鼠骨密度及骨M-CSF，IL-6 mRNA的影響[J]. 中華骨質(zhì)疏松和骨礦鹽疾病雜志，2013，5（2）：119-124.

[5] Kleerekoper M，Villanueva AR，Stanciu J，et al. The role of three-dimensional trabecular microstructure in the pathogenesis of vertebral compression fractures[J]. Calcif Tissue Int，1985， 37（6）：594-597.endprint

[6] Koyama A， Kumasaka S， Kashima I. Relationship between bone mineral density and 2D and 3D structure parameters of bone trabeculae[J]. Oral Radiol，2005，21：62-68.

[7] Hanson NA，Bagi CM.Alternative approach to assessment of bone quality using micro-computed tomography[J]. Bone，2004，35（1）：326-333.

[8] Park SJ，Ahn Y，Min HS，et al. Osteoporosis prevalence of radius and tibia and related factors using multiple bone sites quantitative ultrasound measurement of the Korean health and genome study cohort women[J]. Korean J Community Nutr，2005，10：536-545.

[9] Scheller EL，Basma K，Moller KL，et al. Changes in skeletal integrity and marrow adiposity during high-fat diet and after weight loss[J]. Frontiers in Endocrinology，2016，7（2）：102.

[10] Cao JJ. Effects of obesity on bone metabolism[J]. J Orthop Surg Res，2011，15（6）：30.

[11] Halade GV，Rahman MM，Williams PJ，et al .High fat diet-induced animal model of age-associated obesity and osteoporosis[J]. J Nutr Biochem，2010，21（12）：1162-1169.

[12] Hotamisligil GS. Inflammation and metabolic disorders[J]. Nature，2006，444（7121）：860-867.

[13] Ershler WB，Keller ET. Age-associated increased interleukin-6 gene expression，late-life diseases，and frailty[J]. Annu Rev Med，2000，51：245-270.

[14] 雷雨，唐暉，馬光亮.IL-6與AMPK在運(yùn)動抑制胰島素抵抗發(fā)生中的作用研究[J].中國運(yùn)動醫(yī)學(xué)雜志，2014，3（8）：790-803.

[15] Ilich JZ，Kelly OJ，Kim Y，et al.Low-grade chronic inflammation perpetuated by modern diet as a promoter of obesity and osteoporosis[J].Arh Hig Rada Toksikol，2014， 65（2）：139-148.

[16] Qiao JH，Tripathi J，Mishra NK，et al. Role of macrophage colony-stimulating factor in atherosclerosis：Studies of osteopetrotic mice[J].American Journal of Pathology，1997，150（5）：1687.

（收稿日期：2017-08-21）endprint