魯芳芳，沈 楠，高鴻翔，莫 茜，王 偉

·基礎(chǔ)研究·

細(xì)胞外組蛋白在腦缺血再灌注損傷中的作用研究

魯芳芳，沈 楠，高鴻翔，莫 茜，王 偉

目的研究細(xì)胞外組蛋白在腦組織缺血再灌注(I/R)中的損傷作用，并探索組蛋白的來(lái)源。方法采用Longa法建立大鼠I/R模型，腦組織切片后H3熒光染色，觀察腦組織中組蛋白含量。采用酶消化法培養(yǎng)孕18 d SD胎鼠腦皮質(zhì)神經(jīng)元，小牛胸腺組蛋白不同濃度(μg/ml)(50、100、200、400、800)刺激神經(jīng)元1 h后檢測(cè)細(xì)胞存活率。分別在2% O2培養(yǎng)箱培養(yǎng)細(xì)胞0 h、24 h、48 h，然后H3熒光染色，觀察核內(nèi)組蛋白的釋放。結(jié)果大鼠腦組織梗死側(cè)H3含量較未梗死側(cè)增多。50 μg/ml組蛋白處理1 h后細(xì)胞存活率為45.69%(P<0.01)，并呈濃度依賴性下降。低氧培養(yǎng)24 h時(shí)組蛋白分布在細(xì)胞核以及細(xì)胞質(zhì)中，48 h時(shí)組蛋白分布范圍進(jìn)一步擴(kuò)大，少量位于細(xì)胞核外。結(jié)論腦I/R損傷中，神經(jīng)元在缺氧刺激下主動(dòng)釋放組蛋白至細(xì)胞外，直接損傷神經(jīng)元，加重腦損傷。

腦缺血再灌注損傷；細(xì)胞外組蛋白；神經(jīng)元

近年來(lái)，隨著我國(guó)醫(yī)療技術(shù)的進(jìn)步，每年心臟病手術(shù)病例逐年增多，其中80%需要進(jìn)行心肺轉(zhuǎn)流[1](cardiopulmonary bypass，CPB)。由于外科手術(shù)的進(jìn)步、重癥監(jiān)護(hù)設(shè)備的完善，患者的術(shù)后生存率不斷提高，CPB相關(guān)的中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷逐漸成為影響患者術(shù)后生存質(zhì)量的最重要并發(fā)癥[2]，這不僅嚴(yán)重影響了患者的術(shù)后生存質(zhì)量[3]，也給社會(huì)帶來(lái)沉重的負(fù)擔(dān)，在低齡的先天性心臟病患兒中表現(xiàn)尤為突出[4]。然而，針對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)損傷目前卻沒(méi)有更好的辦法治療。目前研究發(fā)現(xiàn)，小兒中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷主要原因是CPB過(guò)程引起大腦亞缺血缺氧狀態(tài)，其機(jī)理和腦缺血再灌注(ischemic/reperfusion，I/R)損傷非常相似[5-6]，再灌注過(guò)程對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)造成二次損傷打擊。

組蛋白(histone)是一種核內(nèi)蛋白，主要功能是在核內(nèi)與DNA結(jié)合，形成核小體，參與染色質(zhì)形成。組蛋白可由激活的中性粒細(xì)胞、受損傷后的肝細(xì)胞、死亡細(xì)胞被動(dòng)或主動(dòng)地分泌到細(xì)胞外，統(tǒng)稱為細(xì)胞外組蛋白[7-8]，參與不同的病理過(guò)程[9]。在腦I/R損傷研究中發(fā)現(xiàn)，循環(huán)以及腦組織中均檢測(cè)到高濃度胞外組蛋白[10]，而拮抗組蛋白后腦梗死面積顯著下降[11]。這表明，組蛋白參與了腦I/R損傷二次打擊神經(jīng)系統(tǒng)過(guò)程。然而目前尚不了解腦組織內(nèi)胞外組蛋白的來(lái)源，因此，本文旨在研究細(xì)胞外組蛋白在腦I/R損傷中的作用以及釋放途徑。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 健康雄性Sprague Dawley(SD)大鼠用于建立大鼠短暫大腦中動(dòng)脈栓塞(transient middle cerebral artery occlusion, tMCAO)模型；健康雄性和雌性SD大鼠一對(duì)，> 200 g，用于配種獲得孕18 d胎鼠培養(yǎng)原代皮質(zhì)神經(jīng)元。整個(gè)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)過(guò)程中對(duì)動(dòng)物的處置符合動(dòng)物倫理學(xué)標(biāo)準(zhǔn)。

1.2tMCAO模型的建立 采用改良的Longa[12]線栓法制備tMCAO模型，簡(jiǎn)要敘述如下：腹腔注射水合氯醛麻醉大鼠，做頸部正中切口，游離右側(cè)頸總動(dòng)脈、頸內(nèi)動(dòng)脈和頸外動(dòng)脈，結(jié)扎頸總動(dòng)脈近心端、頸外動(dòng)脈，在頸總動(dòng)脈上做一切口，將包被聚乙烯的尼龍栓線插入頸總動(dòng)脈，并沿頸總動(dòng)脈、頸內(nèi)動(dòng)脈到達(dá)大腦中動(dòng)脈并形成栓塞，1 h后拔除栓線，形成再灌注，結(jié)扎頸內(nèi)動(dòng)脈避免失血，再灌注23 h后，心臟灌注，取出腦組織。

1.3心臟灌注后取腦組織 水合氯醛麻醉大鼠，從上腹部正中剪開(kāi)大鼠皮膚，剪開(kāi)膈肌，暴露心臟，找到并剪開(kāi)右心耳，待流出血液時(shí)，立即用注射器插入心尖緩慢注射生理鹽水，待觀察到右心房流出清亮液體后，換用4%多聚甲醛，繼續(xù)灌注。待灌注完全后，剝出腦組織，用30%蔗糖溶液脫水3 d。3 d后吸干腦組織表面水后包埋。

1.4腦切片免疫熒光染色 腦組織進(jìn)行冠狀面連續(xù)冰凍切片，切片為40 μm厚度，然后進(jìn)行熒光染色?？乖迯?fù)液1.5 ml，95℃水浴，熱修復(fù)5 min；加入含1∶300比例稀釋的H3抗體，室溫下孵育1 h，然后置于4℃冰箱過(guò)夜。第二天取出，加入二抗，室溫下避光孵育2 h后，DAPI(4',6-diamidino-2-phenylindole，4',6-二脒基-2-苯基吲哚)染色。描片后用80%的甘油封片，觀察并記錄結(jié)果。

1.5原代神經(jīng)元培養(yǎng)[13-14]及純度鑒定 取孕18 d SD胎鼠，消毒后取腦組織，用PBS(磷酸鹽緩沖液)清洗三次，剪碎成1 mm3碎塊，0.5%胰酶37℃下消化10 min，含血清培養(yǎng)基終止消化后吹打成細(xì)胞懸液，過(guò)200目篩網(wǎng)后離心，接種液重懸，以5×105濃度接種至事先包被PDL(多聚賴氨酸)的12孔板中。培養(yǎng)第8 天時(shí)，使用神經(jīng)元特異性抗體MAP-2(微管蛋白-2)進(jìn)行免疫熒光染色，鑒定神經(jīng)元純度。

1.6細(xì)胞外組蛋白對(duì)神經(jīng)元毒性作用 分別用濃度為50 μg/ml，100 μg/ml，200 μg/ml，400 μg/ml，800 μg/ml小牛胸腺組蛋白(calf thymus histone，CTH)加入培養(yǎng)基中，37℃孵育1 h后，吸棄上清，加入20%MTS[水溶性甲臢化合物，3-(4，5-二甲基噻唑-2-基)-5-(3-羧甲酯基)-2-(4-磺苯基)-2H-四唑，內(nèi)鹽]溶液，37℃孵育4 h，酶標(biāo)儀OD=490測(cè)光度值。

1.7低氧培養(yǎng)神經(jīng)元后H3免疫熒光染色 使用低氧培養(yǎng)箱(2% O2，5% CO2，93% N2)培養(yǎng)神經(jīng)元，試驗(yàn)設(shè)置3個(gè)時(shí)間點(diǎn)：0 h，24 h，48 h。取出細(xì)胞，棄去培養(yǎng)基；4%多聚甲醛固定60 min；0.5%Txiton X-100 處理20 min；3% H2O2處理15 min；5% BSA的血清封閉液，37°C，30 min；加入一抗(Anti-Histone H3antibody，ab1791)(1∶200稀釋)，4°C過(guò)夜；二抗(Alex flour 488-山羊抗兔，1∶500)孵育60 min；PBS漂洗；拍照記錄。

2 結(jié) 果

2.1I/R損傷中組蛋白變化 在損傷模型組，腦組織內(nèi)梗死側(cè)的H3較未梗死側(cè)明顯增多，如圖1所示。數(shù)據(jù)表明，在腦I/R損傷中，組蛋白釋放至細(xì)胞外，分散在細(xì)胞周圍，直接接觸神經(jīng)元。

注：圖中左側(cè)為未梗死側(cè)腦組織，右側(cè)為梗死損傷側(cè)腦 組織，左右兩側(cè)取材為大腦相同區(qū)域。藍(lán)色熒光為 DAPI，染色細(xì)胞核；黃色熒光為H3。圖1 H3熒光染色結(jié)果

2.2神經(jīng)元鑒定及組蛋白處理后細(xì)胞存活率 如圖2所示，A圖為培養(yǎng)至第3天的神經(jīng)元，細(xì)胞樹(shù)突短小，量較多，形成疏散的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，細(xì)胞多樣性，紡錘形、三角形及圓形多見(jiàn)；B圖為培養(yǎng)至第七天的神經(jīng)元。胞體進(jìn)一步增大，樹(shù)突增多且延長(zhǎng)，呈密集的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，形成復(fù)雜緊密的神經(jīng)元網(wǎng)絡(luò)；C圖為核染DAPI鏡下，為原代神經(jīng)元細(xì)胞核，核圓，大小均勻；D圖為MAP-2熒光染色鑒定圖，神經(jīng)元核呈橢圓形，樹(shù)突交織成網(wǎng)狀，手動(dòng)計(jì)數(shù)神經(jīng)元細(xì)胞陽(yáng)性率為96%。細(xì)胞在培養(yǎng)第七天時(shí)生長(zhǎng)狀態(tài)良好，隨后使用CTH處理1 h，使用MTS檢測(cè)細(xì)胞存活率，檢測(cè)組蛋白對(duì)皮質(zhì)神經(jīng)元的直接細(xì)胞毒性。結(jié)果如圖3所示：當(dāng)CTH濃度50 μg/ml時(shí)細(xì)胞生存率為45.69%，與對(duì)照組比較P<0.01；CTH為100 μg/ml時(shí)為27.79%，P<0.001。細(xì)胞生存率下降與組蛋白濃度呈劑量依賴關(guān)系。

注：A：培養(yǎng)至第三天的神經(jīng)元；B：培養(yǎng)至第七天的神 經(jīng)元；C：核染DAPI；D：MAP-2熒光染色。圖2 神經(jīng)細(xì)胞生長(zhǎng)及MAP-2鑒定圖

注：**P<0.01，***P<0.001。圖3 不同濃度組蛋白處理后神經(jīng)細(xì)胞存活率

2.3低氧下組蛋白分布 先前的實(shí)驗(yàn)表明，腦I/R損傷再灌注模型中組蛋白直接被釋放，以至循環(huán)以及腦組織中組蛋白升高，再次損傷神經(jīng)元，對(duì)細(xì)胞造成二次打擊損傷。如圖4所示，藍(lán)色熒光為DAPI染色，表示細(xì)胞核，綠色熒光為H3染色。0 h時(shí)組蛋白完全位于細(xì)胞核內(nèi)。24 h時(shí)組蛋白部分分布在核外，胞質(zhì)中有大量H3分布；48 h組蛋白分布范圍進(jìn)一步擴(kuò)大，組蛋白呈顆粒狀分布在軸突附近。在低氧(2% O2)的培養(yǎng)箱處理24 h后，可觀察到組蛋白(綠色熒光)釋放至核外，在48 h時(shí)組蛋白分布范圍進(jìn)一步擴(kuò)大，甚至在軸突也有組蛋白分布。

3 討 論

腦I/R損傷是在包含腦卒中等一系列病理生理中造成腦損傷的重要機(jī)制。目前對(duì)缺血造成的腦損傷的治療方向主要在試圖令病變血管再通，然而這同時(shí)又不可避免地引發(fā)再灌注的損傷，而目前針對(duì)再灌注損傷本身并沒(méi)有十分有效的控制手段，因此對(duì)腦缺血治療的手段十分有限。

組蛋白是一種核內(nèi)蛋白，參與染色質(zhì)的組成。2009年首次發(fā)現(xiàn)組蛋白的病理作用[15]后，陸續(xù)發(fā)現(xiàn)組蛋白可能通過(guò)損傷內(nèi)皮細(xì)胞，激活凝血系統(tǒng)，引起一系列細(xì)胞炎性因子釋放，激活細(xì)胞表面Toll樣受體[16-19]等，引起體內(nèi)免疫功能紊亂、血小板聚集、血栓形成等，損傷機(jī)體各器官。目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的與組蛋白相關(guān)的損傷包括急性肺損傷、肝臟無(wú)菌性炎癥、急性腎損傷[20-23]等，表明組蛋白可能是一種參與各種炎癥損傷過(guò)程的致病因子。

本研究中，筆者對(duì)大鼠建立I/R模型，通過(guò)免疫熒光染色的方法觀察到I/R損傷時(shí)腦組織內(nèi)組蛋白含量增高，梗死側(cè)腦組織組蛋白H3較未梗死側(cè)明顯增多，提示在I/R損傷中，組蛋白被釋放出細(xì)胞核，這些組蛋白分布在腦組織內(nèi)。為進(jìn)一步探索組蛋白的來(lái)源，筆者進(jìn)行細(xì)胞層面研究。首先培養(yǎng)原代皮質(zhì)神經(jīng)元，組蛋白刺激后，驗(yàn)證了組蛋白對(duì)神經(jīng)細(xì)胞的直接毒性，如圖3所示。本研究還觀察到，在低氧箱中孵育一段時(shí)間的神經(jīng)元其組蛋白已不局限于細(xì)胞核內(nèi)，胞質(zhì)內(nèi)有H3分布，以及呈顆粒狀分布于細(xì)胞軸突附近，細(xì)胞核形狀發(fā)生變化。這表明，在低氧環(huán)境中，神經(jīng)元可將核內(nèi)組蛋白釋放至核外。由此，筆者認(rèn)為腦I/R中，梗死側(cè)組蛋白含量增高，接觸周圍神經(jīng)元，使細(xì)胞死亡，進(jìn)一步損傷神經(jīng)系統(tǒng)，其來(lái)源是神經(jīng)元主動(dòng)釋放至細(xì)胞核外。

綜上所述，本研究初步探索了腦I/R損傷時(shí)，組蛋白可能是加劇神經(jīng)元死亡的主要物質(zhì)，而這一機(jī)理可能是腦I/R過(guò)程中神經(jīng)元受到持續(xù)的缺血缺氧導(dǎo)致細(xì)胞釋放核內(nèi)組蛋白至胞外，通過(guò)直接接觸周圍神經(jīng)元，發(fā)揮細(xì)胞毒性作用，進(jìn)一步損傷神經(jīng)元。

注：藍(lán)色熒光為DAPI核染，綠色熒光為H3 染色，MERGE為藍(lán)色與綠色合成圖。圖4 組蛋白分布變化圖

[1]Jepson BM, Mackay-Bojack S, Moller JH. The first cardiac operation using cardiopulmonary bypass[J]. Ann Thorac Surg, 2017, 103(4): e339-e340.

[2]韓思揚(yáng), 蔡國(guó)華, 刁力為，等. 老年患者心臟手術(shù)后認(rèn)知功能障礙影響因素的臨床研究[J]. 心肺血管病雜志, 2016, 35(12): 943-945.

[3]Wernovsky G, Shillingford AJ, Gaynor JW. Central nervous system outcomes in children with complex congenital heart disease[J]. Curr Opin Cardiol, 2005, 20(2): 94-99.

[4]McQuillen PS, Barkovich AJ, Hamrick SE,etal. Temporal and anatomic risk profile of brain injury with neonatal repair of congenital heart defects[J]. Stroke, 2007, 38(2 Suppl): 736-741.

[5]Sanganalmath SK, Gopal P, Parker JR,etal. Global cerebral ischemia due to circulatory arrest: insights into cellular pathophysiology and diagnostic modalities[J]. Mol Cell Biochem, 2017, 426(1-2): 111-127.

[6]Xu Z, Xu RX, Liu BS,etal. Time window characteristics of cultured rat hippocampal neurons subjected to ischemia and reperfusion[J]. Chin J Traumatol, 2005, 8(3): 179-182.

[7]Jahr S, Hentze H, Englisch S,etal. DNA fragments in the blood plasma of cancer patients: quantitations and evidence for their origin from apoptotic and necrotic cells[J]. Cancer Res, 2001, 61(4): 1659-1665.

[8]von Kockritz-Blickwede M, Goldmann O, Thulin P,etal. Phagocytosis-independent antimicrobial activity of mast cells by means of extracellular trap formation[J]. Blood, 2008, 111(6): 3070-3080.

[9]Perez-Cremades D, Bueno-Beti C, Garcia-Gimenez JL,etal. Extracellular histones disarrange vasoactive mediators release through a COX-NOS interaction in human endothelial cells[J]. J Cell Mol Med, 2017, 21(8):1584-1592.

[10]張迺璞, 于新迪, 莫茜，等. 細(xì)胞外組蛋白與腦缺血再灌注損傷關(guān)系的初探[J]. 中國(guó)體外循環(huán)雜志, 2015,(03): 178-180.

[11]De Meyer SF, Suidan GL, Fuchs TA,etal. Extracellular chromatin is an important mediator of ischemic stroke in mice[J]. Arterioscler Thromb Vasc Biol, 2012, 32(8): 1884-1891.

[12]Longa EZ, Weinstein PR, Carlson S,etal. Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats[J]. Stroke, 1989, 20(1): 84-91.

[13]Meberg PJ, Miller MW. Culturing hippocampal and cortical neurons[J]. Methods Cell Biol, 2003, 71: 111-127.

[14]Xu SY, Wu YM, Ji Z,etal. A modified technique for culturing primary fetal rat cortical neurons[J]. J Biomed Biotechnol, 2012, 2012: 803930.

[15]Xu J, Zhang X, Pelayo R,etal. Extracellular histones are major mediators of death in sepsis[J]. Nat Med, 2009, 15(11): 1318-1321.

[16]Yang X, Li L, Liu J,etal. Extracellular histones induce tissue factor expression in vascular endothelial cells via TLR and activation of NF-kappaB and AP-1[J]. Thromb Res, 2016, 137: 211-218.

[17]Yu Y, Koehn CD, Yue Y,etal. Celastrol inhibits inflammatory stimuli-induced neutrophil extracellular trap formation[J]. Curr Mol Med, 2015, 15(4): 401-410.

[18]Allam R, Kumar SV, Darisipudi MN,etal. Extracellular histones in tissue injury and inflammation[J]. J Mol Med(Berl), 2014, 92(5): 465-472.

[19]Lam FW, Cruz MA, Leung HC,etal. Histone induced platelet aggregation is inhibited by normal albumin[J]. Thromb Res, 2013, 132(1): 69-76.

[20]Huang H, Tohme S, Al-Khafaji AB,etal. Damage-associated molecular pattern-activated neutrophil extracellular trap exacerbates sterile inflammatory liver injury[J]. Hepatology, 2015, 62(2): 600-614.

[21]Allam R, Scherbaum CR, Darisipudi MN,etal. Histones from dying renal cells aggravate kidney injury via TLR2 and TLR4[J]. J Am Soc Nephrol, 2012, 23(8): 1375-1388.

[22]Semeraro F, Ammollo CT, Morrissey JH,etal. Extracellular histones promote thrombin generation through platelet-dependent mechanisms: involvement of platelet TLR2 and TLR4[J]. Blood, 2011, 118(7): 1952-1961.

[23]Liu S, Su X, Pan P,etal. Neutrophil extracellular traps are indirectly triggered by lipopolysaccharide and contribute to acute lung injury[J]. Sci Rep, 2016, 6: 37252.

Theresearchoftheroleofextracellularhistoneincerebralischemia-reperfusioninjury

Lu Fang-fang, Shen Nan, Gao Hong-xiang, Mo Xi, Wang Wei

ThoracicandCardiovascularSurgeryDepartment,ShanghaiChildren'sMedicalCenter,SchoolofMedicine,ShanghaiJiaoTongUniversity,Shanghai, 200127

WangWei,Email:wangwei@scmc.com.cn

ObjectiveTo study the effects of extracellular histone on cerebral ischemic reperfusion (I/R) injury and the source of histone.MethodsRat I/R model was established according to Longa method, and H3fluorescent staining was operated with sliced brain tissue to observe the level of histone in brain tissue. SD fetal rats cortex neurons of 18 days were cultured with the method of enzyme digestion, and different concentrations of calf thymus histone (μg/ml)(50, 100, 200, 400, 800) were added to neurons. Cell survival was tested after 1 hour. Neurons were cultured in 2% O2incubator for 0 hour, 24 hours, 48 hours, then the H3fluorescent staining was operated to observe the release of nucleus histone.ResultsThe level of H3in infarction side was higher than that in the non-infarction side. The cell survival rate was 45.69% when histone was 50 μg/ml(P<0.01). Histone was distributed in the nucleus and cytoplasm when neurons were cultured 24 hours in the hypoxia incubator, and it was outside the cells at 48 hours.ConclusionHistone actively released outside the nucleus by neurons in cerebral I/R injury damaged neurons directly and aggravated the brain damage.

Brain ischemia/reperfusion; Extracellular histone; Neurons

10.13498/j.cnki.chin.j.ecc.2017.04.12

200127 上海，上海交通大學(xué)附屬上海兒童醫(yī)學(xué)中心心胸外科(魯芳芳、高鴻翔、王 偉)，中心轉(zhuǎn)化所(沈 楠、莫 茜)

王 偉，Email: wangwei@scmc.com.cn

2017-05-25)

2017-08-18)