王譯婕，王 潔，萬婉婷，杜嬋媛，白樂康，鄒 蕊

(1.西安交通大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院陜西省顱頜面精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 陜西 西安 710004；2.西安交通大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院口腔正畸科 陜西 西安 710004；3.陜西中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院 陜西 咸陽 712000；4.西安交通大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院口腔修復(fù)科 陜西 西安 710004)

聚羥基丁酸酯/聚乙二醇納米復(fù)合支架的生物相容性研究

王譯婕1,2，王 潔3，萬婉婷1,2，杜嬋媛1,2，白樂康4，鄒 蕊1,2

(1.西安交通大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院陜西省顱頜面精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 陜西 西安 710004；2.西安交通大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院口腔正畸科 陜西 西安 710004；3.陜西中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院 陜西 咸陽 712000；4.西安交通大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院口腔修復(fù)科 陜西 西安 710004)

目的：采用聚羥基丁酸酯(polyhydroxybutyrate,PHB)/聚乙二醇(polyethylene glycol,PEG)納米復(fù)合生物材料構(gòu)建三維培養(yǎng)支架并與大鼠髁突軟骨細(xì)胞(condylar chondrocytes)復(fù)合培養(yǎng)，評(píng)價(jià)其生物相容性。方法：應(yīng)用靜電紡絲法制備PHB/PEG納米復(fù)合生物支架，將大鼠髁突軟骨細(xì)胞接種于PHB/PEG支架上，分別于復(fù)合培養(yǎng)4h，72h時(shí)利用熒光顯微鏡及掃描電子顯微鏡觀察細(xì)胞在三維支架上的粘附、鋪展及生長(zhǎng)情況，并應(yīng)用MTT四甲基偶氮唑鹽微量酶反應(yīng)比色法檢測(cè)細(xì)胞的增殖活性，評(píng)價(jià)其生物相容性。結(jié)果：熒光顯微鏡及掃描電子顯微鏡觀察顯示復(fù)合培養(yǎng)4h時(shí)細(xì)胞已粘附于支架表面，部分細(xì)胞開始鋪展，培養(yǎng)72h細(xì)胞在支架表面增殖及生長(zhǎng)良好，MTT結(jié)果顯示PHB/PEG納米三維支架復(fù)合培養(yǎng)大鼠髁突軟骨細(xì)胞較對(duì)照組具有更高的增殖活性。結(jié)論：靜電紡絲法制備的PHB/PEG納米復(fù)合生物支架可以促進(jìn)大鼠髁突軟骨細(xì)胞的粘附、生長(zhǎng)和增殖，具有良好生物相容性，為組織工程軟骨再生奠定一定的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

髁突軟骨細(xì)胞；PHB/PEG納米支架；復(fù)合培養(yǎng)；生物相容性

髁突軟骨是口腔顳下頜關(guān)節(jié)的重要結(jié)構(gòu)，是一種特化的、具有負(fù)重功能的結(jié)締組織，也是下頜骨主要生長(zhǎng)中心之一，可承受機(jī)械振蕩刺激并將該刺激均勻傳遞至下方區(qū)域的骨組織[1]。正常范圍的力學(xué)刺激有助于維持關(guān)節(jié)軟骨結(jié)構(gòu)和功能的完整性，髁突軟骨作為一種繼發(fā)性軟骨，其發(fā)育后的繼續(xù)生長(zhǎng)與功能負(fù)荷密切相關(guān)，而這一生物學(xué)特性是口腔正畸功能矯形及修復(fù)咬合重建治療的基礎(chǔ)[2-3]。髁突軟骨細(xì)胞是關(guān)節(jié)軟骨的主要功能成分，為了維持體外培養(yǎng)細(xì)胞表型以及生物學(xué)特性穩(wěn)定，選擇合適的支架材料對(duì)其進(jìn)行三維培養(yǎng)成為目前國(guó)內(nèi)外的研究熱點(diǎn)。眾所周知，生理性應(yīng)力對(duì)細(xì)胞的作用是通過改變細(xì)胞生長(zhǎng)的三維微環(huán)境而實(shí)現(xiàn)的，細(xì)胞外基質(zhì)微環(huán)境的空間物理結(jié)構(gòu)顯著影響細(xì)胞增殖分化及功能表達(dá)[4-5]。傳統(tǒng)二維培養(yǎng)模式下細(xì)胞無重疊的分布方式在很大程度上簡(jiǎn)化和忽略了力學(xué)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中細(xì)胞間、細(xì)胞和細(xì)胞外基質(zhì)間的協(xié)同作用及相互依賴性，并不能在體外精準(zhǔn)模擬在體組織三維空間環(huán)境變化。隨著實(shí)驗(yàn)方法的改進(jìn)及研究?jī)?nèi)容的不斷深化，細(xì)胞力學(xué)實(shí)驗(yàn)已逐漸由早期二維細(xì)胞力學(xué)實(shí)驗(yàn)向生物支架復(fù)合細(xì)胞三維力學(xué)加載過渡[6-7]，從而獲得與在體情況更加接近的體外細(xì)胞力學(xué)實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?，以期更加接近臨床問題的力學(xué)實(shí)質(zhì)。本研究應(yīng)用靜電紡絲法構(gòu)建三維力學(xué)加載支架，并與大鼠髁突軟骨細(xì)胞復(fù)合培養(yǎng)，研究PHB/PEG三維支架的生物相容性，為最終揭示三維培養(yǎng)細(xì)胞的力學(xué)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制及構(gòu)建組織工程髁突軟骨提供數(shù)據(jù)支持。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：SD乳鼠12只，出生后3～5d，雌雄不限(西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院動(dòng)物醫(yī)學(xué)中心提供)。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑：高糖DMEM培養(yǎng)基(Gibco Co,USA)；胎牛血清(Gibco Co,USA)；青鏈霉素(Gibco Co,USA)，Ⅱ型膠原酶(Gibco Co,USA)；0.25％胰蛋白酶(Gibco Co,USA)；四甲基偶氮唑鹽(methyl thiazolyl tetrazolium,MTT)(Sigma,USA)；孔板(Coning,USA)；細(xì)胞培養(yǎng)皿(Coning,USA)；PBA液，PBS液等自行配制。

1.3 儀器和設(shè)備：掃描電子顯微鏡(Hitachi，TM-1000)；酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀(Bio-Rad公司)；倒置相差顯微鏡及照相系統(tǒng)(OLYMPUS FSX100)。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 PHB/PEG三維生物支架的制備：將2.7g PHB、0.3g PEG溶解于45ml三氯甲烷并磁力攪拌12h使其充分溶解，再與5ml二甲基甲酰胺(DMF)混合均勻制備PHB/PEG紡絲溶液。利用自組建的靜電紡絲設(shè)備，以15kV電壓將PHB/PEG紡絲溶液以1.2ml/h的流速噴射出形成紡絲纖維。噴絲頭方向垂直于接收屏，且噴絲頭和接收屏之間紡絲距離約15cm，靜電紡絲時(shí)間大約1h，從而制得薄膜狀的多孔三維立體的支架材料。

1.4.2 髁突軟骨細(xì)胞培養(yǎng)及生物學(xué)鑒定：選擇出生3～5d的大鼠乳鼠進(jìn)行髁突軟骨細(xì)胞的原代培養(yǎng)，取第三代髁突軟骨細(xì)胞行甲苯胺藍(lán)染色及Ⅱ型膠原蛋白免疫組織化學(xué)染色。

1.4.3 大鼠髁突軟骨細(xì)胞在PHB/PEG支架上的接種培養(yǎng)：取第三代大鼠髁突軟骨細(xì)胞加2ml 0.25％胰蛋白酶37℃消化2～3min，以生長(zhǎng)培養(yǎng)基終止消化，稀釋后反復(fù)吹打成細(xì)胞懸液，以l×l05/ml密度接種于24孔板內(nèi)的PHB/PEG支架上，每孔1ml，復(fù)合培養(yǎng)。

1.4.4 復(fù)合培養(yǎng)細(xì)胞熒光顯微鏡觀察：4h、72h后將上述復(fù)合培養(yǎng)的PHB膜從孔板中取出，置于載玻片上，滴加熒光染色劑，立即于熒光倒置相差顯微鏡下觀察。

1.4.5 復(fù)合培養(yǎng)細(xì)胞掃描電鏡觀察：4h、72h后將上述復(fù)合培養(yǎng)PHB膜從孔板中取出，固定，室溫過夜，送檢、制樣、觀察。

1.4.6 MTT比色法檢測(cè)大鼠髁突軟骨細(xì)胞的增殖生長(zhǎng)狀態(tài)：將上述復(fù)合培養(yǎng)細(xì)胞及相同條件下的細(xì)胞培養(yǎng)板上的髁突軟骨細(xì)胞，分別培養(yǎng)ld、3d、5d、7d后每孔加入MTT溶液(5mg/ml)100μl，37℃環(huán)境下孵育4h。將孔內(nèi)液體吸出，每孔加入600μl 二甲基亞砜(DMSO)，即出現(xiàn)藍(lán)紫色產(chǎn)物，振蕩10min，使甲瓚充分溶解。吸出藍(lán)紫色液體后，將其加入96孔板，實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組各選3孔，每孔200μl。在酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀上選擇490nm波長(zhǎng)，測(cè)定各孔吸收值，記錄結(jié)果，以時(shí)間(d)為橫軸，光吸收值(OD值)為縱軸繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線，設(shè)空白對(duì)照。

通過以上方法與普通單層方法培養(yǎng)細(xì)胞進(jìn)行對(duì)比，分析PHB/PEG復(fù)合納米纖維支架材料的細(xì)胞相容性。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析：采用SPSS 19.0軟件包，對(duì)MTT結(jié)果重復(fù)測(cè)量數(shù)據(jù)行方差分析。

2 結(jié)果

2.1 大鼠髁突軟骨細(xì)胞的生物學(xué)特性鑒定結(jié)果：第三代軟骨細(xì)胞甲苯胺藍(lán)染色觀察，絕大部分呈多角形，胞漿內(nèi)呈紫紅色異染顆粒，細(xì)胞周圍有少量異染顆粒出現(xiàn)(圖1A)；Ⅱ型膠原免疫組織化學(xué)染色呈陽性結(jié)果，胞漿被染成棕黃色(圖1B)。

2.2 熒光染色法觀察細(xì)胞在三維支架上的生長(zhǎng)：將大鼠髁突軟骨細(xì)胞與PHB/PEG三維生物支架復(fù)合培養(yǎng)4h熒光染色，熒光顯微鏡下清晰可見亮染細(xì)胞核分布于支架表面及支架之間，部分細(xì)胞已開始鋪展；72h鏡下可見細(xì)胞明顯鋪展生長(zhǎng)，細(xì)胞核亮染而且數(shù)目明顯增多，細(xì)胞開始分裂增殖(圖2)。

圖2 熒光顯微鏡下細(xì)胞支架復(fù)合培養(yǎng)結(jié)果

2.3 掃描電鏡(SEM)觀察細(xì)胞在支架復(fù)合體上的生長(zhǎng)狀態(tài)：大鼠髁突軟骨細(xì)胞與PHB/PEG三維生物支架復(fù)合培養(yǎng)4h，掃描鏡下觀察可見，PHB/PEG三維支架表面及支架內(nèi)上散在大量的髁突軟骨細(xì)胞(圖3A)，多數(shù)細(xì)胞開始粘附在支架表面呈球狀，有部分細(xì)胞開始伸出偽足(圖3B)。復(fù)合培養(yǎng)72h，整個(gè)PHB/PEG支架表面可見密集排列的細(xì)胞，與培養(yǎng)4h相比，細(xì)胞數(shù)量明顯增多，并已在支架表面增殖、鋪展，相互重疊(圖3C)。高倍鏡下可見細(xì)胞開始跨越多孔結(jié)構(gòu)的支架孔隙和間隔，覆蓋于支架材料表面。有些地方可見增生的髁突軟骨細(xì)胞幾乎完全包裹纖維支架，有部分細(xì)胞偽足伸入支架孔隙內(nèi)部生長(zhǎng)(圖3D)。

圖3 掃描電子顯微鏡下髁突軟骨細(xì)胞與PHB/PEG支架復(fù)合培養(yǎng)

2.4 細(xì)胞增殖活性檢測(cè)結(jié)果：MTT結(jié)果表明(圖4)：實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組的大鼠髁突軟骨細(xì)胞隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)而增殖。細(xì)胞接種第1天，可見兩組的髁突軟骨細(xì)胞OD值均較低，細(xì)胞逐步開始增殖生長(zhǎng)；細(xì)胞接種第3天，兩組的細(xì)胞數(shù)量均增高，OD值明顯高于第一天，但兩組之間未出現(xiàn)顯著性差異；細(xì)胞接種第5天，PHB/PEG支架復(fù)合培養(yǎng)細(xì)胞增殖活力明顯增高，對(duì)照組細(xì)胞增殖活力雖有增長(zhǎng)，但顯著低于實(shí)驗(yàn)組；細(xì)胞接種第7天，PHB/PEG支架組細(xì)胞增殖活力仍呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，對(duì)照組與第5天相比同樣有少量增加，可見增長(zhǎng)曲線放緩。PHB/PEG支架復(fù)合培養(yǎng)組細(xì)胞增殖活性顯著高于對(duì)照組。

圖4 細(xì)胞增殖活性檢測(cè)結(jié)果

3 討論

聚-β-羥基丁酸酯(PHB)作為聚羥基脂肪酸酯(PHAs)家族中的一員，由于其優(yōu)良的生物相容性和生物可降解性，在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域得到了廣泛應(yīng)用[8-9]。PHB材料制成的多孔支架材料，具有可支撐各種細(xì)胞存活的三維空間結(jié)構(gòu)，能夠嵌入或攜帶細(xì)胞，并提供良好的細(xì)胞生長(zhǎng)環(huán)境[10]。通過調(diào)整支架材料的孔隙率及孔徑大小，可適應(yīng)培養(yǎng)多種細(xì)胞的要求。但PHB材料表面呈現(xiàn)較高的疏水性和生物惰性，材料本身強(qiáng)度欠佳。聚乙二醇(PEG)是一種水溶性的高聚物，同時(shí)又是完全可降解材料，無毒、無刺激性，具有良好的水溶性，與許多有機(jī)物有良好的相容性[11-12]。聚乙二醇(PEG)的引入，可顯著促進(jìn)PHB材料的生物活性并提高其機(jī)械強(qiáng)度。

細(xì)胞外基質(zhì)的三維結(jié)構(gòu)是細(xì)胞的生長(zhǎng)和分化所依賴的微環(huán)境，同時(shí)也是細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳遞和化學(xué)反應(yīng)的起始者，可參與調(diào)控細(xì)胞分化及各種其他功能活動(dòng)。越來越多的實(shí)驗(yàn)證據(jù)證明，只有生長(zhǎng)在三維基質(zhì)微觀環(huán)境中，細(xì)胞形態(tài)才更接近在體細(xì)胞[13]。同時(shí)，細(xì)胞形態(tài)、細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)和細(xì)胞外基質(zhì)的相互作用與細(xì)胞的代謝過程密切相關(guān)[14]。近年來組織工程技術(shù)的飛快發(fā)展，為構(gòu)建細(xì)胞的體外三維生長(zhǎng)環(huán)境提供了可能。理想的組織工程支架材料應(yīng)具備高度仿生的微觀形態(tài)結(jié)構(gòu)，即具備適當(dāng)?shù)目紫堵?、充分的表面積和適宜的表面化學(xué)，從而促進(jìn)細(xì)胞的黏附、生長(zhǎng)、增殖和分化。目前，已有多種技術(shù)可用于制備滿足以上要求的支架材料，而靜電紡絲技術(shù)能夠制造出直徑達(dá)納米級(jí)的連續(xù)纖維[15]，引起了學(xué)者們的廣泛關(guān)注。因此本實(shí)驗(yàn)利用靜電紡絲技術(shù)，選用PHB/PEG復(fù)合生物材料制作髁突軟骨細(xì)胞類胞外基質(zhì)微環(huán)境支架，為研究力學(xué)刺激下髁突軟骨細(xì)胞的生物學(xué)行為變化奠定微觀結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。

良好的生物相容性是生物支架材料的重要性能之一。本實(shí)驗(yàn)將大鼠髁突軟骨細(xì)胞與PHB/PEG納米復(fù)合生物支架進(jìn)行復(fù)合培養(yǎng)，并進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察及細(xì)胞增殖活性檢測(cè)，初步證實(shí)了PHB/PEG纖維支架材料有利于細(xì)胞的粘附、生長(zhǎng)、增殖，具有良好的細(xì)胞生物相容性。熒光染色及掃描電鏡觀察從定性的角度表征了支架良好的生物相容性，細(xì)胞在接種4h粘附于支架表面并開始鋪展，而接種72h細(xì)胞的增殖顯著增加，并呈現(xiàn)出三維生長(zhǎng)。MTT結(jié)果從定量的角度評(píng)價(jià)了大鼠髁突軟骨細(xì)胞與PHB/PEG支架材料復(fù)合培養(yǎng)不同時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞的增殖情況。檢測(cè)結(jié)果顯示，培養(yǎng)前3d，與對(duì)照組相比，PHB/PEG支架上復(fù)合培養(yǎng)的大鼠髁突軟骨細(xì)胞數(shù)量雖略有增加，但二者未出現(xiàn)顯著差異；培養(yǎng)5～7d后，PHB/PEG復(fù)合纖維支架上復(fù)合培養(yǎng)的大鼠髁突軟骨細(xì)胞增殖活性明顯高于對(duì)照組。由此可見，靜電紡絲技術(shù)制備的PHB/PEG纖維支架材料對(duì)大鼠髁突軟骨細(xì)胞的粘附、生長(zhǎng)、增殖具有一定的促進(jìn)作用，具有良好的生物相容性，并可為細(xì)胞生長(zhǎng)提供良好的微觀結(jié)構(gòu)，可為進(jìn)一步研究力學(xué)刺激誘導(dǎo)髁突軟骨損傷修復(fù)及再生重建提供新的組織工程材料。

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The Biocompatibility Study on Polyhydroxybutyrate/Polyethylene Glycol Nanocomposite Scaffolds

WANG Yi-jie1,2,WANG Jie3,WAN Wan-ting1,2,DU Chan-yuan1,2,BAI Le-kang4,ZOU Rui1,2
(1.Key Laboratory of Shaanxi Province for Craniofacial Precision Medicine Research,Hospital of Stomatology,Xi'an Jiaotong University ,Xi'an 710004,Shaanxi,China;2.Department of Orthodontics,Hospital of Stomatology,Xi'an Jiaotong University,Xi'an 710004,Shaanxi,China;3.Af fi liated hospital of Shaanxi University of Traditional Chinese Medicine,Xianyang 712000,Shaanxi,China;4.Department of Prosthodontics,Hospital of Stomatology,Xi'an Jiaotong University,Xi'an 710004,Shaanxi,China)

Objective Three-dimensional nano composite biological scaffolds were prepared using polyhydroxybutyrate (PHB)/polyethylene glycol(PEG) and compound culture with rat condylar cartilages,to evaluate its biocompatibility.Methods The PHB/PEG nano composite biological scaffolds were prepared by electrospinning and the rat condylar cartilages were seeded in it. The adhesion,growth and spreading of cells were observed by fl uorescence microscope and scanning electron microscope after seeding 4h and 72h,and evaluated cells’ proliferation and scaffold biocompatibility using MTT.Results From the results of fl uorescence microscope and scanning electron microscope,cells adhere on the scaffolds completely and some cells began spreading after 4h,the proliferation and growth were better after 72h. The results of MTT showed that PHB/PEG nanocomposite scaffolds can promote proliferation of rat condylar cartilages.Conclusion The PHB/PEG nanocomposite biological scaffolds have good biocompatibility and can promote adhesion,growth and proliferation of rat condylar cartilages,which will establish on experimental basis for tissue engineering cartilage regeneration.

condylar cartilages; PHB/PEG nano scaffolds; compound culture; biocompatibility

R318.08

A

1008-6455(2017)11-0059-04

國(guó)家自然科學(xué)基金(81300915)；陜西省自然科學(xué)基礎(chǔ)研究計(jì)劃(2015JM8414)

鄒蕊，西安交通大學(xué)口腔醫(yī)院正畸科，副教授，副主任醫(yī)師，碩士生導(dǎo)師，科教科副科長(zhǎng)；長(zhǎng)期從事錯(cuò)牙合畸形的臨床矯治、頜面部組織再生與修復(fù)、口腔生物力學(xué)等臨床及科研工作； E-mail:rainy@mail.xjtu.edu.cn

2017-09-14

2017-10-13

編輯/朱婉蓉