張 軍 劉旭新 徐立生 吐爾遜娜依 李 疆

(1.新疆農(nóng)業(yè)職業(yè)技術(shù)學院園林科技學院，昌吉 831100； 2.新疆喀什質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督局，喀什 844000； 3.新疆農(nóng)業(yè)大學林學與園藝學院，烏魯木齊 830052)

庫爾勒香梨PsLOX基因克隆及生物信息學分析

張 軍1劉旭新1徐立生2吐爾遜娜依1李 疆3*

(1.新疆農(nóng)業(yè)職業(yè)技術(shù)學院園林科技學院，昌吉 831100；2.新疆喀什質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督局，喀什 844000；3.新疆農(nóng)業(yè)大學林學與園藝學院，烏魯木齊 830052)

克隆了庫爾勒香梨(PyrussinkiangensisYü)脂氧合酶(lipoxygenase,LOX)基因PsLOX，了解其在香梨果實不同發(fā)育時期的表達差異，為香梨果實香氣代謝機理研究提供理論依據(jù)。以庫爾勒香梨嫩葉及不同時期果實表皮為試材，利用兩種不同的方法提取總RNA，通過RT-PCR技術(shù)得到目的基因PsLOX的cDNA序列，以生物信息學方法對其進行分析和功能預(yù)測。運用半定量RT-PCR(SqRT-PCR)技術(shù)，分析PsLOX基因在香梨嫩葉及果實生長發(fā)育及貨架期的表達特性和差異。結(jié)果：試劑盒提取總RNA質(zhì)量較高，PsLOX基因CDS序列為912 bp，編碼303個氨基酸，屬于脂氧合酶家族基因，與其他植物LOX基因編碼的氨基酸序列有較高的同源性，與南果梨相似性最高，達到99%；PsLOX基因在香梨果實中發(fā)育過程中表達差異明顯，即生長發(fā)育前期表達量很低，成熟至完熟時期表達量最高，然后開始減少。推測克隆獲得PsLOX基因在香梨果實香氣代謝過程中起到重要作用。

庫爾勒香梨；PsLOX基因；半定量RT-PCR；香氣

果實香氣是一類由大量揮發(fā)性芳香物質(zhì)組成的復雜混合物，能夠反映出果實的風味特點，是評價果實品質(zhì)的重要指標[1～2]。庫爾勒香梨(PyrussinkiangensisYü. cv.‘Kuerle xiangli’)屬于新疆特有梨種，果實以獨特而濃郁的芳香氣味而著稱[3]。栽培區(qū)域僅限新疆巴州和阿克蘇地區(qū)，正常年份總產(chǎn)量約7.0×105噸[4]，其規(guī)模效益和特色優(yōu)勢效益日益顯著。隨著產(chǎn)業(yè)的發(fā)展，香梨品質(zhì)提升日益凸顯。果實香氣是構(gòu)成和影響果實品質(zhì)以及經(jīng)濟價值的重要因素之一[5]。怡人的果實香氣可以吸引消費者并增強果品的市場競爭力。目前，香梨由于栽培管理不當、采摘期過早等原因致使其濃郁的香氣在貯藏、運輸及銷售過程中喪失程度明顯，這一問題降低了其商品價值和市場競爭力。研究香梨果實發(fā)育成熟過程中香氣動態(tài)變化和代謝機理，對確定庫爾勒香梨商品果的適貯采收時間和品質(zhì)評價標準，厘清果實香氣變化規(guī)律與調(diào)控的途徑，研究果實香氣調(diào)控應(yīng)用技術(shù)等具有重要的理論和實踐意義。

在蘋果、桃等果實中直鏈芳香物質(zhì)的生物合成物質(zhì)己經(jīng)被證實主要源于以亞油酸(linoleic acid,LA)和亞麻酸(linolenic acid，LeA)等為前體的脂氧合酶(lipoxygenase,LOX)途徑[6]。目前，普遍認為脂氧合酶LOXs作為LOX途徑的初始關(guān)鍵酶，通過斷裂多不飽和脂肪酸(PUFAs)來形成C6醛類物質(zhì)，然后通過醇脫氫酶將醛類物質(zhì)轉(zhuǎn)化成醇，繼而通過醇酰基轉(zhuǎn)移酶生成脂類物質(zhì)[7]。研究表明，在成熟的蘋果、草莓、甜瓜、番茄等果實香氣中超過80%以上的成分都是脂類物質(zhì)[8～9]。目前已在桃[10～12]、梨[13～15]中克隆得到了LOX基因并且進行了序列分析和表達特性的研究，盡管已有學者開始關(guān)注香梨的香氣，但主要集中在果實香氣成分等次生代謝產(chǎn)物分析方面[16～18]，在調(diào)控香梨果實香氣的分子機制，尤其是主效基因方面卻從未涉及。本研究以庫爾勒香梨為試材，通過RNA提取、RT-PCR等，獲得一個完整的LOX基因cDNA的CDS序列，通過生物信息學技術(shù)對該基因CDS進行了序列和結(jié)構(gòu)分析。并利用半定量PCR方法分析香梨在不同時期特異LOX基因的表達情況，以期為香梨LOX基因鑒定、調(diào)控方式、功能分析等提供基礎(chǔ)信息，并為揭示庫爾勒香梨香氣代謝分子機制的提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

供試材料為庫爾勒市沙依東園藝場梨園健康植株(樹齡15年左右)，采集嫩葉、果實等組織后立即進行液氮處理，運至實驗室放置-80℃冰箱超低溫保存?zhèn)溆谩Ｒ镂猩ど锕こ?上海)股份有限公司合成。

DEPC、Pfu DNA聚合酶、dNTPs、ddH2O、10×PCR buffer(含Mg2+)，日本Takara生物公司；RNAprep Pure植物總RNA提取試劑盒(DP441 TIANGEN)，感受態(tài)大腸桿菌DH5α菌株，零背景PLB-Vector載體等，北京天根生物科技公司；DNA Marker DL5000、Gelview、6×Loading Buffer，北京百泰克生物技術(shù)有限公司；AP-MN-P-250質(zhì)粒小量DNA提取試劑盒，北京科恩堡生物科技有限公司；K1622反轉(zhuǎn)錄試劑盒，賽默飛世爾科技(Thermo)公司；MEGA-bead?DNA凝膠回收試劑盒，美國Invitrogen公司；TRIzol試劑，美國Life Technologies公司；瓊脂糖，Biowest Agarose西班牙公司；其余試劑為國產(chǎn)分析純或化學純。

1.2 儀器與設(shè)備

5417R臺式高速冷凍離心機，BioSpectrometer微量紫外可見光度計等德國Eppendorf有限公司；BioDoc-It凝膠成像系統(tǒng)，美國UVP公司；ABI2720型PCR擴增儀，美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司；Cubis?MSA225P-100-DI天平德國賽多利斯公司等。

1.3 方法

1.3.1 庫爾勒香梨總RNA提取及cDNA的合成

試驗按照TRIzol Reagent(Ambion)提供方法提取庫爾勒香梨嫩葉、嫩枝等總RNA，選擇植物總RNA提取試劑盒(DP441)提供的方法對比，用紫外分光光度計檢測總RNA濃度，電泳檢測總RNA的完整性。提取較好的總RNA用K1622反轉(zhuǎn)錄試劑盒指導手冊進行RT-PCR，反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA用于下列試驗，其余放置-25℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2庫爾勒香梨PsLOX基因引物設(shè)計和PCR擴增

根據(jù)NCBI(www.ncbi.nlm.nih.gov)的GenBank核酸庫根據(jù)已公布的砂梨LOX基因片段(Ge Bank Accession No.EF215448.1)，經(jīng)Blast比對后在脂氧合酶基因(LOX)mRNA序列同源性較高的區(qū)域，采用Primer Premier 6.0軟件設(shè)計引物，引物序列為F：5′ACGATGAATGCAAACGCAT3′，R：5′TTAGATGTTGATACTGGTGGGAACT3′。該引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

PCR總反應(yīng)體系為20 μL，其中DNA模板2 μL、引物2 μL、Pfu DNA聚合酶0.3 μL、dNTPs 2 μL、10×PCR buffer(含Mg2+)4 μL ddH2O 17.7 μL混勻后于96℃的條件下預(yù)變性5 min，96℃的條件下變性30 s，56℃條件下復性30 s，72℃的條件下延伸1 min，PCR反應(yīng)共設(shè)置30個循環(huán)，最后在72℃的條件下延伸7 min，反應(yīng)終止于14℃。

1.3.3 PCR產(chǎn)物回收、克隆及測序

PCR產(chǎn)物經(jīng)過1.0%的瓊脂糖電泳之后，檢測到一條在1 kB大小的條帶，用凝膠回收試劑盒純化回收，克隆至無背景PLB-Vector載體，42℃條件下90 s熱擊轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌DH5α后，在羧芐青霉素抗性篩選條件下，挑取單菌落經(jīng)PCR鑒定后于LB培養(yǎng)基中搖菌12 h培養(yǎng)，用試劑盒提取質(zhì)粒，送生工生物工程(上海)股份有限公司進行測序。

1.3.4 目的片段的序列比對、分析

測序結(jié)果使用Mega 6.0進行拼接對照，通過GENEDOC軟件對部分已經(jīng)公布的LOX開放閱讀框進行比較，與植物LOX基因序列進行Blast比對，檢測所克隆的片斷是否為LOX基因序列，確認測序結(jié)果的正確性。

1.3.5 庫爾勒香梨psLOX基因生物信息學分析

對擴增得到的基因序列使用Lasergene 7.1的EditSeq軟件將PsLOX基因翻譯成氨基酸序列，并與NCBI的Nr數(shù)據(jù)庫進行BLASTp分析，獲得相似度最高的序列，預(yù)測編碼蛋白質(zhì)；使用GENEDOC軟件對預(yù)測的氨基酸序列與相似度最高的5條序列進行保守序列分析；使用MEGA 6.0軟件將預(yù)測的氨基酸序列與GenBank上的其他序列進行系統(tǒng)進化分析，構(gòu)建系統(tǒng)進化樹；ExPASy在線服務(wù)器的ProtParam(http://web.expasy.org/protparam/)預(yù)測蛋白質(zhì)的基本理化性質(zhì)；PSORT服務(wù)器http://wolfpsort.org/)預(yù)測蛋白質(zhì)的亞細胞定位；SOPMA軟件http://npsa-pbil.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page]=/NPSA/npsa_sopma.html)進行蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)分析；使用SWISS-MODEL(http://swissmodel.expasy.org/)進行三維結(jié)構(gòu)預(yù)測。

1.3.6半定量RT-PCR檢測庫爾勒香梨psLOX基因表達

對香梨嫩葉(4月中旬)、不同時期果實的果皮(5月15日、6月16日、7月18日、8月20日，9月16日、10月17日、11月21日)進行RNA提取以及cDNA第一鏈反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA用內(nèi)標基因Actin-7進行擴增驗證，內(nèi)標引物序列為Actin-7F：5′TGGTGTCATGGTTGGTATGG3′，Actin-7R：5′CAGGAGCAACACGAAGTTCA3′。擴增表達引物分別為F：5′CTATCTCGGACAGCGTGACA3′，R：5′TACTGGTGGGAACTCCCTTG3′。

半定量RT-PCR之前，使用紫外檢測儀檢測RNA濃度，將其調(diào)成一致?？偡磻?yīng)體系為20 μL，其中cDNA模板2 μL、引物2 μL、DNA聚合酶0.3 μL、dNTPs 2 μL、10×PCR buffer(含Mg2+)4 μL ddH2O 17.7 μL混勻后于96℃的條件下預(yù)變性5 min，96℃的條件下變性30 s，56℃條件下復性30 s，72℃的條件下延伸0.5 min，PCR反應(yīng)共設(shè)置30個循環(huán)，最后在72℃的條件下延伸7 min，反應(yīng)終止于14℃。產(chǎn)物取5 μL與緩沖液經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳，Gelview染色，紫外觀察照相。

2 結(jié)果與分析

2.1 試劑盒法提取庫爾勒香梨總RNA質(zhì)量較好

傳統(tǒng)TRIzol法獲得香梨組織總RNA溶液呈棕褐色并有粘稠狀不溶物存在，試劑盒法獲得的RNA溶液呈現(xiàn)乳白色。用兩種方法提取香梨組織的總RNA，其BioSpectrometer紫外檢測濃度和純度結(jié)果差異較大：用傳統(tǒng)TRIzol法提取香梨幼嫩組織的總RNA的到濃度185.1 μg·mL-1，純度A260/A280為1.04，用RNAprep Pure試劑盒提取得在總RNA濃度為1 245 μg·mL-1，純度A260/A280為1.96，A260/A230值為2.213，說明RNA純度較高，質(zhì)量較好，可滿足后續(xù)工作的需要(圖1)。

圖1 紫外檢測總RNA質(zhì)量A.試劑盒法；B.傳統(tǒng)TRIzol法Fig.1 Total RNA quality by UV detectionA. Kit method; B. Traditional TRIzol method

由于果樹幼嫩組織中富含多糖、多酚[19]，由圖1可見，傳統(tǒng)TRIzol法不適合該種類型。造成RNA提取質(zhì)量較差的原因是果樹幼嫩組織中的多糖理化性質(zhì)與RNA相似，用乙醇或異丙醇沉淀RNA時，往往產(chǎn)生多糖的凝膠狀沉淀，這種沉淀難溶于水[20]，造成包裹部分RNA使其很難分離，多酚化合物與RNA形成不溶性復合物，造成提取總RNA的丟失[21]。A260/A280是核酸純度的指示值，一般RNA樣品的A260/A280的比值應(yīng)為1.8～2.0。當A260/A280小于1.8時，表明有蛋白質(zhì)、酚類等污染；當A260/A230值小于2.0時表明樣品被糖類、鹽類或者有機溶劑污染，RNA質(zhì)量較差[22]。傳統(tǒng)TRIzol法獲得香梨組織總RNA溶液A260/A230值為0.465，小于2.0說明RNA被污染。

瓊脂糖凝膠電泳檢驗總RNA完整性圖譜由圖2顯示，試劑盒法提取的總RNA質(zhì)量較好，呈現(xiàn)典型的28S、18S、5S三種帶型，其條帶清晰明亮、穩(wěn)定，并且沒有降解，基本可以滿足實驗的要求。而傳統(tǒng)TRIzol法提取的總RNA沒有任何條帶顯示，只是在5S條帶下有模糊的核苷二聚體。

2.2 庫爾勒香梨PsLOX基因的獲得與序列分析

采用特異引物PCR擴增獲得了與預(yù)期大小相符的特異條帶，約為1 000 bp(圖3A)。將PCR產(chǎn)物過大孔瓊脂糖電泳，然后切膠用試劑盒處理得到濃度相對較高的目的基因(圖3B)。將目的基因連接導入PLB-Vector載體，將轉(zhuǎn)化的DH5α大腸桿菌平皿培養(yǎng)后，選擇平板培養(yǎng)基上的24個單克隆菌落，利用特異引物對菌落進行PCR擴增。

結(jié)果表明，菌落單克隆2和8中的目標片段已經(jīng)插入(圖3C)，將2和8單克隆菌落用液態(tài)LB培養(yǎng)過夜，提取重組質(zhì)粒PCR鑒定電泳結(jié)果(圖3D)。

質(zhì)粒提取的結(jié)果符合預(yù)期，測序結(jié)果顯示PsLOX基因區(qū)域全長1 256 bp，測序如圖4。

測序結(jié)果使用primer premier 6.0進行拼接對照，結(jié)果顯示該基因有912 bp的開放閱讀框ORF(CDS)，編碼303個氨基酸，該基因開放閱讀框序列如下圖5所示。DNAman9.0預(yù)測結(jié)果為，分子重量34.446 8 kDa，等電點PI為4.83。

圖2 電泳檢測總RNA質(zhì)量A.試劑盒法；B.傳統(tǒng)TRIzol法Fig.2 Gel electrophoresis of Total RNAA. Kit method; B. Traditional TRIzol method

圖3 庫爾勒香梨PsLOX基因電泳 M. DNA Marker DL5000；2,8. 目標片段已經(jīng)插入的單克隆菌落Fig.3 Electrophoresis to PsLOX gene of Korla pear M. DNA Marker DL5000；2, 8. Target fragments inserted into the monoclonal colonies

2.3 庫爾勒香梨PsLOX基因氨基酸序列相似性與同源性分析

通過NCBI數(shù)據(jù)庫BlasntX比對，該基因核苷酸與砂梨LOX基因的相似性為99%，且在LOX基因的CDS區(qū)段，有5個單核苷酸多態(tài)性(Single Nucleotide Polymorphisms SNP)位點，這為以后利用分子手段鑒定庫爾勒香梨的提供重要依據(jù)。與南果梨、蘋果、桃等LOX基因有較高的一致性，同源性80%～98%，因此認定該基因為庫爾勒香梨特有LOX基因，命名為PsLOX基因。PsLOX基因核苷酸CDS序列對應(yīng)氨基酸與其他植物LOX基因?qū)?yīng)的氨基酸序列同源比對(圖6)。

圖4 庫爾勒香梨PsLOX基因測序Fig.4 Sequencing to Korla pear PsLOX gene

圖5 庫爾勒香梨PsLOX基因CDS序列Fig.5 CDS sequence of Korla pear PsLOX gene

圖6 庫爾勒香梨PyLOX氨基酸序列與其它植物LOX氨基酸序列同源比對 庫爾勒香梨PyLOX；梨XP009376684，XP018507432.1，XP009376681.1[Pyrus×bretschneideri]；南果梨AJD18612.1[Pyrus ussuriensis]；蘋果AGI16416.1，GI16415.1，AGI16414.1，AGI16413.1[Malus domestica]；杏ABZ05753.1[Prunus armeniaca]；桃EMJ09301.1，ABV32552.1，ACH91370.1，[Prunus persica]；扁桃CAB94852.1[Prunus dulcis]；草莓CAE17327.1[Fragaria×ananassa]；酸梅XP008246451.1，XP008245950.1[Prunus mume]；獼猴桃ABF60001.1[Actinidia deliciosa]；葡萄AGU28274.1[Vitis vinifera]Fig.6 homologous sequences comparison of Korla pear PsLOX amino acid and other plant’s Korla pear PyLOX ;pear XP009376684，XP018507432.1，XP009376681.1[Pyrus×bretschneideri];Nanguo Pear AJD18612.1[Pyrus ussuriensis];Apple AGI16416.1，GI16415.1，AGI16414.1，AGI16413.1[Malus domestica];Apricot ABZ05753.1[Prunus armeniaca];Peach EMJ09301.1，ABV32552.1，ACH91370.1，[Prunus persica];Almond CAB94852.1[Prunus dulcis];Strawberry CAE17327.1[Fragaria×ananassa];Dark plum XP008246451.1，XP008245950.1[Prunus mume];Kiwifruit ABF60001.1[Actinidia deliciosa];Grape AGU28274.1[Vitis vinifera]

利用MEGA6.0軟件的最大似然法，將PyLOX基因氨基酸序列與GenBank上登錄的不同物種的LOX酶氨基酸序列進行分子進化樹分析，結(jié)果(圖7)表明，庫爾勒香梨PyLOX基因氨基酸序列與沙梨、南果梨親緣關(guān)系相對最近，聚為一類，與蘋果親緣關(guān)系bootstrap值能到達100，單獨聚為一簇。由此推測，PyLOX在表達、功能等方面與砂梨、南國梨等LOX家族成員類似。

2.4 庫爾勒香梨PsLOX蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能預(yù)測

通過ExPASy平臺http://web.expasy.org/protparam/對PsLOX基因編碼蛋白質(zhì)進行理化性質(zhì)分析，蛋白質(zhì)分子式C1545H2366N406O469S10，氨基酸構(gòu)成及其含量見下表1。

圖7 庫爾勒香梨PyLOX氨基酸序列與其它植物LOX氨基酸序列系統(tǒng)進化樹Fig.7 Phylogenetic trees on LOX amino acids of Korla pear PsLOX and other plant’s

表1 PsLOX蛋白質(zhì)氨基酸構(gòu)成

該蛋白質(zhì)總負電荷殘基數(shù)(D+E)為45，總正電荷殘基數(shù)(R+K)為33，PI為4.83，因此，為PsLOX基因編碼蛋白質(zhì)酸性蛋白質(zhì)。估計半衰期在體外哺乳動物網(wǎng)織紅細胞為30 h，在酵母體內(nèi)大于20 h，在大腸桿菌體內(nèi)大于10 h。不穩(wěn)定系數(shù)為52.14，為不穩(wěn)定蛋白。

氨基酸序列決定了蛋白質(zhì)的立體結(jié)構(gòu)，即肽鏈的折疊方式，因此研究肽鏈的構(gòu)象有利于探索蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)和功能。利用C.Geourjon，G.Deléage已經(jīng)發(fā)表的蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)預(yù)測方法SOPMA[23]，在線(https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/secpred_sopm.pl)對PsLOX編碼的蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)進行分析，結(jié)果如下圖，該二級結(jié)構(gòu)主要由4種形式組成，其中α-螺旋(Alpha-helix)占38.61%，無規(guī)則卷曲(Random coil)占37.62%，延伸鏈(Extended strand)占11.88%，β-轉(zhuǎn)角(β-turn)占11.88%，α-螺旋和延伸鏈分別分布于蛋白的N端和C端各一個，N末端以α-螺旋的形式存在，C-末端以延伸鏈形式存在(圖8)。

疏水/親水平衡特征是維持蛋白質(zhì)立體結(jié)構(gòu)的重要因素，影響著蛋白質(zhì)的諸多功能。因此，參照Kyte J.,Doolittle R.F.方法[24]，利用ProtScale在線http://web.expasy.org/cgi-bin/protscale/protscale.pl對PsLOX進行了親水性/疏水性分析，如圖3所示，橫坐標表示氨基酸殘基的序號，縱坐標表示殘基的疏水、親水特性，正直為疏水，負值為親水。發(fā)現(xiàn)PsLOX編碼的氨基酸序列中，具有多個明顯的親水區(qū)域，其中269位親水值為最大，達到3，而214，215位疏水性達到最大，均為1.711。大部分屬于親水性氨基酸，占整個比例的71.28%。因此，PsLOX基因翻譯產(chǎn)物屬于親水性蛋白。

圖8 庫爾勒香梨PsLOX編碼蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)預(yù)測 MNA等是氨基酸縮寫；h.螺旋；e.延伸鏈；t.轉(zhuǎn)角；c.卷曲Fig.8 The predicated secondary structure of Korla pear PyLOX encoding protein MNA etc. is the abbreviation for amino acids; hetc. Helix; e. Extended strand; t. Turn; c. Coil

圖9 PsLOX氨基酸親水性/疏水性分析Fig.9 Distributing in hydropathy of the PsLOX amino acid

圖10 PsLOX蛋白信號肽預(yù)測圖Fig.10 Prediction to signal peptide of PsLOX protein

利用SignalP 4.1 Server軟件，Petersen TN.等的方法[25]在線對PsLOX的蛋白質(zhì)信號肽進行預(yù)測(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP)，選擇神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)法NN和隱馬可夫模型HMM兩種方式聯(lián)合，可預(yù)測是否含有信號肽以及信號肽位點。信號肽辨別率D-score是S-mean和Y-max的平均值，是區(qū)分是否含有信號肽的重要指標。由圖所示，D-score為0.109，小于臨界值0.45，所以沒有信號肽存在(圖10)。

通過TMHMM Server2.0在線軟件http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM分析(圖11)，曲線的縱坐標是概率，橫坐標是序列，一共203個氨基酸,紅色表示跨膜區(qū),幾乎都在5%概率下，藍色在膜內(nèi)部，概率極低，相反紫色細線表示在膜外的概率，幾乎100%。在線給出結(jié)論是：1到203氨基酸全部位于膜外，該蛋白質(zhì)無跨膜區(qū)域，說明它可能位于胞質(zhì)或核(胞漿)中。又通過http://www.csbio.sjtu.edu.cn/cgi-bin/PlantPLoc.cgi在線軟件亞細胞定位[26]，結(jié)果顯示該蛋白在細胞質(zhì)中(Cytoplasm)。

利用https://swissmodel.expasy.org/interactive/z6yrUY/models/同源建模得出PsLOX基因編碼蛋白質(zhì)的三維結(jié)構(gòu)見圖12。

圖11 PyLOX蛋白的跨膜區(qū)分析Fig.11 Transmembrane analysis of PyLOX protein

圖12 PyLOX蛋白的三級結(jié)構(gòu)Fig.12 The model of tertiary structure by PyLOX protein

2.5 庫爾勒香梨PsLOX基因表達

以庫爾勒香梨嫩葉、花后30天的果實8個時期的cDNA為模板，利用Actin-7基因為的引物進行半定量RT-PCR檢測，瓊脂糖電泳均能檢測到符合預(yù)期大小的Actin-7基因片段，亮度基本一致，條帶清晰，無非特異性擴增帶出現(xiàn)(圖13)。說明RT-PCR得到的模板cDNA濃度基本一致。從圖13中可以看出，香梨PsLOX基因在庫爾勒香梨成熟期(條帶5～7)表現(xiàn)為的表達量大于成長期(條帶2～4)，而當香梨摘后常溫貯藏至第二個月(條帶8)，psLOX表達明顯減弱，條帶變得模糊，由于PsLOX基因是脂類等次生代謝物的一個主要調(diào)控基因，故可初步得出：香梨PsLOX基因可能在成熟期時香梨香氣合成代謝起到非常重要的作用。

圖13 PsLOX基因在不同時期的半定量RT-PCR表達 條帶上方為試驗材料序號：1.香梨果樹嫩葉(4月中旬)；2～8.香梨果實不同時期的果實(5月15日，6月16日，7月18日，8月20日，9月16日，10月17日，11月21日)Fig.13 Expression on semi-quantitative RT-PCR of PsLOX gene in different periods The test data number is above the strip: 1. Above as experimental materials for pear fruit leaves(mid April); 2-8. Fruit of Korla pear in different periods(May 15th,June 16th,July 18th,August 20th,September 16th,October 17th,November 21st)

3 討論

提取得到純度高、完整性好總RNA是進行RT-PCR分析和構(gòu)建cDNA的決定性因素。目前，提取植物總RNA經(jīng)典的方法有報道的多見于CTAB法、SDS-苯酚法、異硫氫酸胍法等，TRIzol法由于具有步驟簡單、配制試劑少等優(yōu)點[27]使用日益廣泛，本文證明TRIzol法不適合提取庫爾勒香梨材料總RNA，這與王其海[28]、尹珍珍[29]等對果樹組織提取總RNA結(jié)論結(jié)果一致。

脂氧合酶(lipoxygenase,LOX)不但參與果實發(fā)育成熟，也是果實香氣合成過程中關(guān)鍵酶，是果實香氣(脂香型)代謝第一步，決定著果實香型和香氣的質(zhì)量。研究表明在草莓[30]、葡萄[31]、蘋果[32]、桃[12]上都有LOX基因家族成員的報道，然而在中國特色水果庫爾勒香梨果實上LOX基因卻鮮有報道，只有李萌(音譯)等[15]一篇關(guān)于白梨LOX基因家族與其他5種薔薇科基因家族的對比，至于在龐大的LOX基因家族中哪個是和香氣有直接關(guān)系的即主效基因未見報道。所以鑒于前人的研究成果，利用生物信息學對PyLOX對應(yīng)的編碼蛋白進行序列分析，與蘋果、梨、桃等多個物種的LOX轉(zhuǎn)錄因子的保守結(jié)構(gòu)域相似性較高，與已知功能的LOX轉(zhuǎn)錄因子聚在同類，據(jù)此推測它與該類基因可能具有相似的功能，即和果實香氣代謝有關(guān)。

單核苷酸多態(tài)性(SNP)作為一種能夠提供豐富信息的具有高穩(wěn)定性的分子標記，已開始被應(yīng)用于農(nóng)作物育種領(lǐng)域研究[33]。通過PyLOX基因的同源性分析發(fā)現(xiàn)，在該基因的CDS區(qū)段，有5個SNP位點，這為以后利用分子手段鑒定庫爾勒香梨的種資資源、性狀關(guān)聯(lián)等提供重要依據(jù)。

利用半定量RT-PCR技術(shù)分析基因的表達量，進而推斷基因在不同生育時期的作用，已在很多研究上應(yīng)用。由于不同組織或細胞等來源的目的基因表達量不同，在同一個PCR體系條件下擴增得到的產(chǎn)物(目的基因和管家基因)不同，而管家基因的表達則相同[33]。本試驗采用Actin-7作為內(nèi)參基因，研究香梨香氣次生代謝物合成關(guān)鍵酶LOX基因，結(jié)果證明確實可行。同時，條帶對比說明，LOX基因作為脂類次生代謝物的調(diào)控基因與庫爾勒香梨香氣代謝關(guān)系緊密。

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Xinjiang Uygur Autonomous Region Natural Science Foundation(2016D01A053)

introduction：ZHANG Jun(1978—),Male,associate professor,Ph.D.Candidate,research on germplasm resources of fruit trees.

date:2017-05-08

CloningandBioinformaticsAnalysisofPsLOXGeneinPyrussinkiangensisYü. ‘Korlaxiangli’

ZHANG Jun1LIU Xu-Xin1XU Li-Sheng2Tuerxunayi1LI Jiang3*

(1.Garden Science & Technology College,Xinjiang Agricultural Vocational Technical College,Changji 831100； 2.Xinjiang Kashgar Supervisory Bureau for Quality and Technology,Kashgar 844000； 3.College of Forestry and Horticulture,Xinjiang Agricultural University,Urumqi 830088)

In order to provide a rationale and study for the aroma metabolism mechanism of pear fruit, which wasPsLOX, the lipoxygenase gene of Korla pear(PyrussinkiangensisYü. ‘Korla xiangli’) was cloned, the expression profiles ofPsLOXwere monitored in different periods of fruit development. As materials in leaves and fruit of Korla pear at different periods, total RNA was extracted by using the reagent kit, cDNA sequence of target genePsLOXwas obtained by RT-PCR. The function ofPsLOXwas predicted by bioinformatics, the expression characteristics and differences of this gene were analyzed using semi quantitative RT-PCR(SqRT-PCR) technology with leaves and peel of Korla pear in period of growth and shelf-life. The CDS sequence ofPsLOXgene was 912 bp length, coded a predicted protein of 303 amino acids. By bioinformatics,PsLOXgene belongs to the lipoxygenase family. We compared with other plant LOX genes, the amino acid sequence had high homology, and the highest homology with Nanguo pear reached 99%. There was significant difference in the expression ofPsLOXgene in development period of pear fruit, which was very low level in the expression quantity at growth development prophase of young fruit, and was the highest value in mature to ripe period, then expression quantity began to decrease. ThePsLOXgene was homologously cloned, which were speculated to play a crucial role in aroma metabolism process of Korla pear fruit.

PyrussinkiangensisYü. ‘Korla xiangli’;PsLOXgene;semi quantitative RT-PCR;aroma

新疆維吾爾自治區(qū)自然科學基金項目(2016D01A053)

張軍(1978—)，男，副教授，博士研究生，主要從事果樹種質(zhì)資源方面的研究。

* 通信作者：E-mail:lijiangxj@163.com

2017-05-08

* Corresponding author：E-mail:lijiangxj@163.com

S661.2

A

10.7525/j.issn.1673-5102.2017.06.011