王小龍，葉坤，王志勇，韓芳

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大黃魚脾酪氨酸激酶的克隆與表達(dá)分析

王小龍，葉坤，王志勇，韓芳*

(集美大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院/農(nóng)業(yè)部東海海水健康養(yǎng)殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建 廈門 361021)

克隆大黃魚脾酪氨酸激酶基因(spleen tyrosine kinase，)并分析其結(jié)構(gòu)，通過熒光定量PCR技術(shù)分析該基因的組織表達(dá)譜以及受LPS、PolyI:C和滅活副溶血弧菌()免疫刺激后的表達(dá)變化規(guī)律。結(jié)果顯示：基因cDNA全長(zhǎng)2 761 bp，其中開放閱讀框?yàn)? 851 bp，編碼616個(gè)氨基酸，預(yù)測(cè)相對(duì)分子質(zhì)量為70 527，理論等電點(diǎn)為8.13；在所檢測(cè)到的大黃魚組織(心臟、肝臟、脾臟、頭腎、中腎、鰓、腸、胃、腦)中均有表達(dá)，屬廣譜型表達(dá)；不同組織間的表達(dá)量存在差異，其中在頭腎中的表達(dá)量最高，在中腎和脾臟中的次之，在胃中的表達(dá)量最低；大黃魚受到LPS、Poly I:C和滅活副溶血弧菌免疫刺激后，脾臟、頭腎和肝臟中基因的表達(dá)水平明顯上調(diào)，表明在大黃魚抵御病毒和細(xì)菌病原的免疫機(jī)制中發(fā)揮了重要作用。

大黃魚；脾酪氨酸激酶；組織表達(dá)譜；副溶血弧菌；免疫刺激

大黃魚()為石首魚科(Sciaenidae)黃魚屬()代表性魚類，是中國(guó)四大海水經(jīng)濟(jì)魚類之一。中國(guó)大黃魚養(yǎng)殖主要集中在東南沿海，其中以福建、浙江等地較多，近年來已經(jīng)形成了年產(chǎn)量近15萬t的養(yǎng)殖規(guī)模[1]。目前，大黃魚養(yǎng)殖病害主要由細(xì)菌、病毒和寄生蟲等引起，隨之出現(xiàn)了亂用藥、濫用藥所導(dǎo)致的養(yǎng)殖水域水質(zhì)惡化、種質(zhì)資源退化等問題。小G蛋白R(shí)ab5A作為重要的分子開關(guān)在大黃魚抵御病毒、細(xì)菌和寄生蟲的先天性免疫過程中發(fā)揮了重要作用[2]。脾酪氨酸激酶(spleen tyrosine kinase, Syk)與Rab5A存在蛋白質(zhì)互作。當(dāng)前關(guān)于酪氨酸激酶特別是脾酪氨酸激酶的研究主要是針對(duì)哺乳動(dòng)物。脾酪氨酸激酶是蛋白酪氨酸激酶家族中的一類非受體型酪氨酸激酶，在信號(hào)傳遞過程中，由于能量需求的增加，脾酪氨酸激酶通過催化ATP的γ磷酸基，將磷酸基轉(zhuǎn)移到下游蛋白質(zhì)的酪氨酸殘基上，使其磷酸化，促進(jìn)信號(hào)傳遞，進(jìn)而調(diào)控細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖和分化等[3]。目前已有關(guān)于鯉魚()、斑馬魚()[4]、大西洋鮭()、大菱鲆()[5]、斑點(diǎn)叉尾鮰()[6]以及七鰓鰻()[7]中脾酪氨酸基因序列研究的報(bào)道，但鮮有關(guān)于其基因表達(dá)特征和功能等的研究。筆者對(duì)大黃魚脾酪氨酸激酶的克隆與表達(dá)特征以及病毒和細(xì)菌免疫刺激后基因表達(dá)的變化進(jìn)行研究，以期揭示在大黃魚中的免疫分子機(jī)制，為大黃魚養(yǎng)殖病害防治及抗病育種提供參考。

1　材料與方法

1.1　材料

健康大黃魚取自福建省寧德市金鈴水產(chǎn)科技有限公司，體長(zhǎng)為(15±2) cm，體質(zhì)量為(130±10) g。試驗(yàn)前在溫度為23~26 ℃、鹽度為27~28 psu的充氣海水中馴養(yǎng)2周。

脂多糖(lipopolysaccharides，LPS)、聚肌苷酸胞嘧啶核苷酸(PolyI:C)購自Sigma公司；副溶血弧菌()由集美大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院鄢慶枇教授惠贈(zèng)。

從暫養(yǎng)群體中選取6尾正常大黃魚，剖取心臟、肝、脾、頭腎、中腎、鰓、腸、胃和腦組織，于液態(tài)氮中冷凍，存放于–80 ℃冰箱。

從暫養(yǎng)群體中選取240尾大黃魚，平均分成4組(1個(gè)對(duì)照組，3個(gè)試驗(yàn)組)，用丁香酚麻醉后，試驗(yàn)組分別腹腔注射0.25 mL Poly I:C(1 g/L)、0.25 mL LPS(1 g/L)和0.25 mL的副溶血弧菌(，1×108cfu/mL)進(jìn)行攻毒；對(duì)照組腹腔注射0.25 mL PBS。試驗(yàn)期間的飼養(yǎng)溫度、pH和鹽度等與馴養(yǎng)條件一致。試驗(yàn)組與對(duì)照組分別于刺激前以及刺激后3、6、12、24、48、72 h取樣，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)取5尾魚的肝臟、脾臟和頭腎。試驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2　方法

1.2.1總RNA的提取及cDNA的合成

大黃魚組織樣品RNA的提取采用Trizol Reagent Kit (Invetrogeon，USA)，并用RNase–free Dnase (Promega, USA)除去其中的DNA雜質(zhì)，產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳。cDNA第一條鏈的合成采用GoScript? Reverse Transcription kit (Promega, USA)進(jìn)行。以合成的cDNA為模板擴(kuò)增大黃魚管家基因–，用以對(duì)cDNA合成質(zhì)量進(jìn)行檢測(cè)。將質(zhì)量較好的cDNA于–20 ℃保存，備用。

1.2.2基因的克隆

大黃魚基因cDNA具體數(shù)據(jù)源自GenBank數(shù)據(jù)庫(登錄號(hào)：XM_010751528.2)，并參考其序列信息，設(shè)計(jì)1對(duì)引物F 和–R (表1)，通過RT–PCR擴(kuò)增其ORF。擴(kuò)增程序：94 ℃ 預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s， 56 ℃退火30 s，72 ℃延伸2 min，30個(gè)循環(huán)；最后再72 ℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物純化后連接pMD–19T vector (TaKaRa, 大連，中國(guó))，送華大基因(上海)科技有限公司測(cè)序。

表1　LcSyk基因擴(kuò)增的引物序列和退火溫度

1.2.3生物信息學(xué)分析

序列同源性比對(duì)采用在線BLAST((http://blast. ncbi.nlm.nih/.govBlast.cgi)；通過ExPASy(http://web. expasy.org/compute_pi/)預(yù)測(cè)大黃魚脾酪氨酸激酶蛋白等電點(diǎn)及其相對(duì)分子質(zhì)量；分別采用Signal IP Server 4.1(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)和NetPhos 3.1 Server(http://www.cbs.dtu.dk/services/ NetPhos/)預(yù)測(cè)該蛋白質(zhì)的信號(hào)肽和磷酸化位點(diǎn)；通過SMART (http://smart.embl–heidelberg.de/)預(yù)測(cè)大黃魚脾酪氨酸激酶的結(jié)構(gòu)功能域；采用SWISS– MODEL(https://swissmodel.expasy.org/)并結(jié)合Swiss PDB Viewer預(yù)測(cè)該蛋白的三級(jí)空間結(jié)構(gòu)；將大黃魚脾酪氨酸氨基酸序列與其他物種該蛋白進(jìn)行多重比對(duì)后，用MEGA 5.02構(gòu)建脾酪氨酸激酶的系統(tǒng)進(jìn)化樹。

1.2.4實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析

根據(jù)大黃魚管家基因–設(shè)計(jì)內(nèi)參引物––F和––R (表1，=2.01，2=0.995 5)，產(chǎn)物長(zhǎng)度為107 bp[8]。在測(cè)序所得的基因ORF序列內(nèi)設(shè)計(jì)試驗(yàn)引物–QF和–QR(表1，=1.93,2=0.999 6)，產(chǎn)物長(zhǎng)度為132 bp。反應(yīng)體系(20 μL)為：10 μL TransStart Top Gree qPCR SuperMix (2×)，0.4 μLQF(10 μmol/L)，0.4 μLQR (10 μmol/L)，0.4 μL Passive Reference Dye(50×)，5 μLcDNA模板及3.8 μL ddH2O。擴(kuò)增程序：94 ℃預(yù)變性30 s；94 ℃變性5 s，60 ℃退火15 s，72 ℃延伸10 s，共40個(gè)循環(huán)。試驗(yàn)設(shè)置3個(gè)生物學(xué)重復(fù)，每個(gè)樣品進(jìn)行3個(gè)技術(shù)性重復(fù)。采用2–ΔΔCt法結(jié)合SPSS19.0中的One–Way ANOVA和LSD Multiple Comparison Test分析各樣品間基因表達(dá)的差異。

2　結(jié)果與分析

2.1　LcSyk基因的cDNA序列

基因cDNA全長(zhǎng)2 761 bp，包括246 bp的5′端和664 bp的3′端非編碼區(qū)，其開放閱讀框(ORF)為1 851 bp，編碼616個(gè)氨基酸(圖1)。通過ExPasy預(yù)測(cè)其蛋白相對(duì)分子質(zhì)量為70 527，理論等電點(diǎn)為8.13；采用TMHMM Server和Signal IP Server預(yù)測(cè)其沒有跨膜區(qū)和信號(hào)肽，表明該蛋白可能是游離的非分泌蛋白；通過NetPhos 3.1 Server預(yù)測(cè)其存在18個(gè)絲氨酸(Ser)、6個(gè)酪氨酸(Tyr)及6個(gè)蘇氨酸(Thr)磷酸化位點(diǎn)，推測(cè)大黃魚脾酪氨酸激酶蛋白自身可能受磷酸化激酶的調(diào)控。由SMART進(jìn)行分析的結(jié)果表明，該蛋白主要存在Src同源結(jié)構(gòu)域(8–93 aa及161–245 aa，SH2 domain)和酪氨酸激酶催化結(jié)構(gòu)域(352–607 aa，TyrKc domain)2種保守結(jié)構(gòu)域。

起始和終止密碼子用黑色方框標(biāo)出；潛在的磷酸化位點(diǎn)(T為蘇氨酸；Y為酪氨酸磷酸；S為絲氨酸磷)用黑色陰影突出顯示；灰色陰影部分依次為SH2–N、SH2–C及TyrKc結(jié)構(gòu)域。

2.2　LcSyk基因系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建

BLASTp比對(duì)分析結(jié)果(圖2)顯示：大黃魚LcSyk蛋白氨基酸序列與較多物種具有較高的一致性(63%~89%)，從低到高分別為非洲爪蟾(，XP_002937073.2)，原鴿(，XP_013222534.1)，褐家鼠(，NP_036890.1)，家兔(，XP_002708308.1)，人(，NP_003168.2)，原雞(，NP_001026601.1)，狨猴(，XP_008990899.1)，鯉魚(，AAK49117.1)，斑馬魚(，NP_998008.2)，大西洋鮭(，NP_001167144.1)，斜帶石斑魚(，ALG38206.1)。采用MEGA5.02軟件并以鄰接法(NJ)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(圖3)，結(jié)果顯示大黃魚基因與斜帶石斑魚最近，并與其他魚類(大西洋鮭、斑馬魚、鯉魚)聚為一支，其余物種的基因分別以鳥類、哺乳類及兩棲類為單位各自形成一個(gè)分支。

Syk蛋白的SH–N和SH–C及結(jié)構(gòu)域分別用下劃線和波浪線標(biāo)出；TyrKc結(jié)構(gòu)域用黑色陰影標(biāo)出。

圖3　根據(jù)LcSyk基因編碼氨基酸繪制的N–J系統(tǒng)發(fā)育樹

2.3　LcSyk蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)分析

如圖4所示，LcSyk蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)中的SH2–N、SH2–C及TyrKc結(jié)構(gòu)域分別以綠色、藍(lán)色和紫色標(biāo)示出來。此外，以上結(jié)構(gòu)域間還存在黃色標(biāo)示的Inter SH2(A)及淺灰色標(biāo)示的Interdomain linker(B)2個(gè)域間連接。LcSyk蛋白的N末端的前半部分包含2個(gè)SH2結(jié)構(gòu)域緊密耦聯(lián)的模塊，由1個(gè)螺旋線圈狀的域間連接A串聯(lián)起來。SH2結(jié)構(gòu)域與酪氨酸激酶催化結(jié)構(gòu)域之間也有一段較長(zhǎng)的域間連接B，結(jié)合大黃魚基因和其他物種氨基酸序列的多重比對(duì)結(jié)果(圖2)分析，發(fā)現(xiàn)該部分是不同Syk蛋白出現(xiàn)遺傳分化的主要區(qū)域。

LcSyk蛋白不同的結(jié)構(gòu)域分別以各自的顏色顯示，其中A為Inter SH2；B為Interdomain linker。

2.4　大黃魚LcSyk基因的組織表達(dá)分析

熒光定量PCR檢測(cè)大黃魚組織表達(dá)譜的結(jié)果(圖5)顯示，在所檢測(cè)的大黃魚9個(gè)組織或器官中均有脾酪氨酸激酶的表達(dá)，表明脾酪氨酸激酶在大黃魚體內(nèi)是廣譜型表達(dá)。盡管基因mRNA在大黃魚體內(nèi)廣泛表達(dá)，但其表達(dá)量存在明顯差異(圖5)：頭腎組織中的表達(dá)量最高(表達(dá)量從高到低依次為頭腎、中腎、脾臟、鰓、肝臟、腸、腦、心臟、胃)。

“*”示P<0.05水平差異；“**”示P<0.01水平差異。

2.5　大黃魚LcSyk基因免疫刺激后的表達(dá)變化

在脾臟中，大黃魚經(jīng)LPS、Poly I:C和副溶血弧菌刺激后，表達(dá)量在前6 h相對(duì)于對(duì)照組無明顯變化，之后逐漸升高，并在24 h時(shí)達(dá)到最高峰，分別為對(duì)照組的6.9、7.8、6.0倍，此后逐漸下降，其中副溶血弧菌刺激后72 h時(shí)仍明顯高于對(duì)照組(圖6)。

“*”示P<0.05水平差異。

在肝臟中，經(jīng)LPS、Poly I:C和副溶血弧菌刺激后，大黃魚脾酪氨酸激酶表達(dá)量均明顯上調(diào)(圖7)，其中LPS免疫刺激組在刺激后12 h的表達(dá)量最高，約為對(duì)照組的4.5倍，之后表達(dá)量雖稍有下降，但免疫刺激后72 h仍明顯高于對(duì)照組；副溶血弧菌刺激組在刺激后48 h的表達(dá)量最高，約為對(duì)照組的5.5倍。病毒類似物Poly I：C刺激組刺激后24 h脾酪氨酸激酶的表達(dá)量最高，約為對(duì)照組的4.0倍。

“*”示P<0.05水平差異。

在頭腎中，大黃魚經(jīng)LPS和副溶血弧菌刺激后，表達(dá)量迅速升高(圖8)，并在刺激后3 h達(dá)到峰值，分別約為對(duì)照組的2.5倍和3.2倍，而病毒類似物Poly I:C免疫刺激組基因表達(dá)量的上調(diào)相對(duì)滯后，最終于刺激后48 h達(dá)到峰值，約為對(duì)照組的3倍。

“*”示P<0.05水平差異。

此外，腹腔注射PBS對(duì)照組的表達(dá)量在脾臟、頭腎和肝臟中各時(shí)相(刺激后0、3、6、12、24、48、72 h)的相對(duì)表達(dá)量均無明顯升高或降低。

3　結(jié)論與討論

酪氨酸激酶作為分子開關(guān)，調(diào)節(jié)B淋巴細(xì)胞的多種生理學(xué)功能[9–10]。Rab5A蛋白也是作為分子開關(guān)發(fā)揮生物學(xué)功能。一旦酪氨酸激酶發(fā)生突變，當(dāng)其一直處于分子開關(guān)中“開”的狀態(tài)時(shí)會(huì)導(dǎo)致許多癌癥發(fā)生[11]。酪氨酸激酶功能失調(diào)也會(huì)造成許多炎性疾病，比如全身性炎癥、某些慢性炎癥、動(dòng)脈粥樣硬化等[12]。通過對(duì)酪氨酸激酶活性進(jìn)行干預(yù)，可為有機(jī)體炎性疾病及自身免疫病治療提供思路[13]。這一途徑也可能為大黃魚病害防治研究提供參考。

LcSyk蛋白含有酪氨酸激酶家族典型的Src同源結(jié)構(gòu)域(SH2 domain)和酪氨酸激酶催化結(jié)構(gòu)域(TyrKc domain)。Src同源結(jié)構(gòu)域與受體酪氨酸激酶磷酸化殘基具有很高的親和力，它協(xié)助磷酸化反應(yīng)完成，從而促進(jìn)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)[14–15]。SH2與TyrKc結(jié)構(gòu)域間還存在2個(gè)域間連接，它們賦予了LcSyk蛋白結(jié)構(gòu)的靈活性和SH2結(jié)構(gòu)域的獨(dú)立性[16]，可能為參與的多種信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路提供較好的分子基礎(chǔ)。本研究中通過對(duì)大黃魚脾酪氨酸激酶基因表達(dá)譜的分析，發(fā)現(xiàn)是一個(gè)可以在多種組織中表達(dá)的基因，表明其在這些組織中具有重要的生理功能。基因在所檢測(cè)的9個(gè)大黃魚器官或組織中均有表達(dá)，屬廣譜型表達(dá)。這與對(duì)七鰓鰻的研究結(jié)果[7]一致。在不同組織中表達(dá)量的差異明顯，在頭腎組織中的表達(dá)量最高，在中腎和脾臟中也有高表達(dá)。硬骨魚類的免疫器官主要包括胸腺、頭腎、脾臟及黏膜淋巴組織[17]。胸腺在魚苗早期發(fā)揮主要免疫作用。頭腎相當(dāng)于一種二級(jí)淋巴器官，在幼魚和成魚時(shí)期發(fā)揮免疫作用，是免疫細(xì)胞發(fā)生、增殖、分化的主要場(chǎng)所，同時(shí)也擔(dān)負(fù)著捕獲抗原和產(chǎn)生抗體的重任[18]。虹鱒魚在注射有放射性物質(zhì)標(biāo)記的細(xì)菌后，70%以上被注射細(xì)菌駐留在頭腎，說明頭腎是捕獲抗原與免疫應(yīng)答啟動(dòng)的主要部位[19–20]。脾臟是魚類機(jī)體中各種中性粒細(xì)胞、紅細(xì)胞等產(chǎn)生、儲(chǔ)存和成熟的主要場(chǎng)所，不僅具有各種免疫細(xì)胞的功能，還具有造血功能[18]。在大黃魚腎臟和脾臟組織中的高表達(dá)，表明脾酪氨酸激酶在大黃魚免疫應(yīng)答中扮演著重要角色。

在大黃魚中，經(jīng)LPS、Poly I：C和副溶血弧菌刺激后，基因表達(dá)量不同程度上調(diào)。

本研究結(jié)果表明，基因在大黃魚不同組織中的表達(dá)差異較明顯，其中在頭腎中的表達(dá)量最高，在胃中的表達(dá)量最低。不同物種的Syk蛋白在進(jìn)化上較為保守，都包含Src同源結(jié)構(gòu)域和酪氨酸激酶催化結(jié)構(gòu)域。大黃魚經(jīng)Poly I:C、和LPS免疫刺激后，與基因的表達(dá)變化類似，均明顯上調(diào)。推測(cè)與可能在其信號(hào)級(jí)聯(lián)中通過炎癥及吞噬作用共同在大黃魚免疫機(jī)制中發(fā)揮著重要作用，但其具體作用機(jī)制還有待研究。

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責(zé)任編輯：王賽群

英文編輯：王庫

Cloning and expression analysis of spleen tyrosine kinase gene in

WANG Xiaolong，YE Kun，WANG Zhiyong，HAN Fang*

(Fisheries College, Jimei University/Key Laboratory of Healthy Mariculture for the East China Sea, Ministry of Agriculture, Xiamen 361021, China)

The structure of spleen tyrosine kinase gene in()was analyzed from cloned samples, the expression ofmRNA in different tissues was analyzed by quantitative real–time PCR (qRT–PCR), and their expression levels were investigated after stimulated with LPS, polyinosinic polycytidynic acid and. The results showed that the full length cDNA ofwas 2 761 bp, including an ORF of 1 851 bp, encoding with 616 amino acids. The predicted molecular weight and theoretical isoelectric point was 70 527 and 8.13, respectively. The qRT–PCRexpression profiles ofshowed that it could express in all 9 examined tissues, including heart, liver, spleen, head–kidney, kidney, gill, intestine, stomach and brain, but the expression levels were different. The dominant expression level was detected in head–kidney, followed by kidney and spleen, but it was the lowest in stomach. Moreover, it was significantly up–regulated after stimulated with Poly I:C,and LPS. This suggested thatmight play an important role in enhancing immunity against bacteria and virus.

; spleen tyrosine kinase; tissue expression profile;; immune stimulation

Q953.3

A

1007-1032(2017)06-0662-07

2017–05–11

2017–11–01

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31402339)；福建省高校杰出青年科研人才計(jì)劃項(xiàng)目(20152018)；農(nóng)業(yè)部南海漁業(yè)資源開發(fā)利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開放課題(FREU2016–05)

王小龍(1992—)，男，湖北咸寧人，碩士研究生，主要從事水產(chǎn)動(dòng)物免疫學(xué)研究，466198152@qq.com；

通信作者，韓芳，女，副教授，主要從事水產(chǎn)動(dòng)物免疫學(xué)研究，hanfangyc@jmu.edu.cn

投稿網(wǎng)址：http://xb.hunau.edu.cn