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(1.南華大學(xué)附屬第一醫(yī)院急診科，衡陽 421001；2.南華大學(xué)附屬第二醫(yī)院急診科)

·基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)·

不可分型流感嗜血桿菌脂肽P4誘導(dǎo)氣道上皮細(xì)胞分泌黏蛋白的機(jī)制

王劍1，李旎2*，李晶2，周定耕2，王彪2

(1.南華大學(xué)附屬第一醫(yī)院急診科，衡陽 421001；2.南華大學(xué)附屬第二醫(yī)院急診科)

目的研究不可分型流感嗜血桿菌脂肽P4誘導(dǎo)氣道上皮細(xì)胞分泌黏蛋白MUC5AC的作用及機(jī)制。方法培養(yǎng)人氣道上皮細(xì)胞NCI-H292，用不同濃度的P4孵育細(xì)胞，檢測(cè)粘蛋白5AC(MUC5AC)的分泌及mRNA表達(dá)、ROS的產(chǎn)生及腫瘤壞死因子α轉(zhuǎn)化酶(TACE)的活性；分析Duox1 p47phox和P67phox亞基亞細(xì)胞轉(zhuǎn)位和表皮生長因子受體(EGFR)的磷酸化。結(jié)果0、30、50和100 ng/mL P4作用NCI-H292細(xì)胞24 h后，可誘導(dǎo)其分泌MUC5AC并表達(dá)其mRNA，并促進(jìn)p47phox和P67phox亞基轉(zhuǎn)位至細(xì)胞膜、增高細(xì)胞內(nèi)ROS的含量，同時(shí)可上調(diào)TACE的酶活性及誘導(dǎo)EGFR磷酸化。NADPH氧化酶抑制劑可抑制ROS產(chǎn)生；而ROS抑制劑處理則可降低TACE的酶活性；沉默TACE表達(dá)后可抑制EGFR磷酸化，而EGFR抑制劑處理可降低MUC5AC分泌。結(jié)論P(yáng)4經(jīng)Duox1/ROS/TACE/ EGFR誘導(dǎo)人NCI-H292細(xì)胞分泌MUC5AC。

不可分型流感嗜血桿菌； 脂肽P4； 表皮生長因子受體； 腫瘤壞死因子α轉(zhuǎn)化酶； 粘蛋白5AC

不可分型流感嗜血桿菌(nontypeableHaemophilus，NTHi)是定植于鼻咽和后口咽上呼吸道的一種無莢膜革蘭陰性多形桿菌，當(dāng)機(jī)體免疫力降低時(shí)，寄居于兒童鼻咽部的NTHi可通過咽鼓管到達(dá)中耳，導(dǎo)致急性中耳炎[1]。而成人則可引起慢性支氣管炎以及COPD急性發(fā)作[2]。因此，開展NTHi的致病機(jī)制研究，對(duì)防治NTHi的相關(guān)疾病或并發(fā)癥具有重要意義。NTHi缺乏莢膜，細(xì)菌的脂蛋白在NTHi的致病過程中發(fā)揮重要作用。P4蛋白是幾乎存在于所有流感嗜血桿菌菌株中(含NTHi)高度保守的一種外膜蛋白。研究表明，P4蛋白錨定于外膜上，并在NTHi的致病過程中發(fā)揮重要作用[3]。NTHi感染后，最顯著的特征是誘導(dǎo)呼吸道上皮細(xì)胞過度分泌黏液。在氣道黏液中，黏蛋白5AC (MUC5AC)是主要的分泌型黏蛋白，由杯狀細(xì)胞分泌，它主要存在于氣道表面上皮細(xì)胞層，在器官與主支氣管中表達(dá)較多，而在細(xì)支氣管(<1mm)以及肺上皮細(xì)胞中無表達(dá)[4]。黏蛋白作為固有免疫系統(tǒng)的一道非特異性屏障，在維持氣道功能等方面發(fā)揮重要作用[5]。但在某些病理?xiàng)l件，黏液的過度分泌可引起呼吸道管腔阻塞、引發(fā)嚴(yán)重的氣流受限，從而導(dǎo)致呼吸道反復(fù)感染[6]。研究證實(shí)，NTHi感染機(jī)體后可上調(diào)氣道上皮細(xì)胞分泌MUC5AC，從而參與與支氣管哮喘和COPD急性發(fā)作。但這些研究多局限于以NTHi為整體作為研究對(duì)象，而對(duì)于NTHi菌體上的外膜蛋白在MUC5AC的分泌中發(fā)揮何種作用目前尚不明確。本研究旨在觀察NTHi膜脂蛋白P4對(duì)MUC5AC分泌有無影響，并初步探討其機(jī)制。

1 材料與方法

1.1主要實(shí)驗(yàn)材料NTHi脂肽P4購自德國Microcollections ，MUC5AC ELISA檢測(cè)試劑盒購自R&D Systems。鼠抗人表皮生長因子受體(EGFR)抗體(磷酸化及非磷酸化)購自Cell signaling。Apocynin、AG1478購自Calbiochem。二亞苯基碘(DPI)、N-乙酰-半胱氨酸(NAC)、2′,7′-二氯二氫熒光黃二乙酸酯(H2DCFDA)以及腫瘤壞死因子α轉(zhuǎn)化酶(TACE)抑制劑TAPI購自Sigma-Adrich。TACE活性檢測(cè)試劑盒購自Anaspec。鼠抗人p47phox及兔抗人p67phox抗體，鼠抗人β-actin抗體以及HRP標(biāo)記兔抗鼠IgG抗體購自Santa Cruz，Duox1和TACE siRNA由廣州RiboBio Co.Ltd合成。

1.2細(xì)胞培養(yǎng)人氣道上皮細(xì)胞NCI-H292 (ATCC,Manassas,VA)采用含有10%胎牛血清，1%葡萄糖，1%谷氨酰胺，100 U/mL青霉素和100 μg/mL鏈霉素的RPMI-1640基中，置于含5% CO2的恒溫培養(yǎng)箱中37℃條件下培養(yǎng)。

1.3實(shí)時(shí)定量PCR 采用GE公司提供的試劑盒提取細(xì)胞總RNA(RNA Spin Mini RNAisolation kits，Buckkinghamshire，UK)，隨后獲取1μg RNA將其逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。將cDNA、SYBR Green Master Mix、引物等反應(yīng)體系置于實(shí)時(shí)定量PCR儀(Chromo4，Bio-Rad)上對(duì)基因進(jìn)行擴(kuò)增。擴(kuò)增條件為：95 ℃ 5 min，隨后進(jìn)入40個(gè)循環(huán)：95 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s。本文所用的引物為：5′-CCTTCGACGGACAGAGCTAC-3′(正向)和5′-TCTCGGTGACAACACGAAAG -3′(反向)；GAPDH：5′-CAATGACCCCTTCATTGACC-3′ (正向)和5′-GATCTCGCT CCTGGAAGATG-3′。根據(jù)靶基因與內(nèi)參GAPDH的ΔCt值計(jì)算MUC5AC的相對(duì)表達(dá)倍數(shù)。

1.4 ELISA 細(xì)胞處理結(jié)束后，獲取NCI-H292細(xì)胞測(cè)定其分泌至培養(yǎng)上清中的MUC5AC濃度，其檢測(cè)方法按照試劑盒提供的雙抗體夾心法進(jìn)行，最后根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算MUC5AC的總量。

1.5 Western blot 按照參考文獻(xiàn)提供的方法提取細(xì)胞膜蛋白[7]，即，將細(xì)胞重懸浮于含有蛋白酶抑制劑的relaxation buffer 中(100 mM KCl、3 mM NaCl、3.5 mM MgCl2、1 mM EGTA、10 mM Hepes、0.5 mM phenylmethylsulfonyl fluoride)。經(jīng)超聲破碎后，4 ℃ 600×g 離心10 min以去除細(xì)胞核即未破碎細(xì)胞.獲取上清液后4 ℃100,000×g超速離心30 min，繼續(xù)用relaxation buffer 重懸浮沉淀并充分震蕩后再次4 ℃100,000×g超速離心30 min，上清即為細(xì)胞膜成分。細(xì)胞總蛋白的提取按參考文獻(xiàn)提供的方法進(jìn)行[8]。所獲取的膜蛋白或總蛋白通過測(cè)定其濃度后，獲取50 μg蛋白在12%濃度的分離膠中進(jìn)行SDS-PAGE，電泳結(jié)束后將其轉(zhuǎn)印至硝酸纖維素膜上，并用5%牛血清白蛋白室溫封閉2 h，最后分別加入相應(yīng)一抗以及二抗，化學(xué)發(fā)光、顯影(Amersham Bioscience，NJ，USA)。

1.6分子探針檢測(cè)ROS產(chǎn)生NCI-H292細(xì)胞處理完畢后，PBS洗滌1次，隨后加入H2DCFDA染液(5 μmol/L)室溫下避光孵育30min，每隔10min輕微震蕩1次，使探針和細(xì)胞充分作用。孵育結(jié)束后800 rpm離心洗滌3次以去除未結(jié)合的殘余的探針。在熒光酶標(biāo)儀(Synergy HT,Bio-Tec)下測(cè)定細(xì)胞內(nèi)的熒光強(qiáng)度，并計(jì)算其熒光相對(duì)強(qiáng)度(激發(fā)波長485 nm，發(fā)射波長530 nm)。

1.7轉(zhuǎn)染與RNA干擾將約105個(gè)NCI-H292細(xì)胞接種于6孔板中過夜培養(yǎng)。隨后按照廠家提供的實(shí)驗(yàn)步驟加入終濃度為10nmol/L的Lipofectamine RNAiMax (Invitrogen) 試劑將siRNA轉(zhuǎn)染至細(xì)胞中。本研究所用的siRNA按照參考文獻(xiàn)提供的序列合成[7]，其中Duox1的干擾序列為：5′-GGACUUAUCCUGGCUAGAGTT-3′(正義鏈)和5′-CUCUAGCCAGGAUAAGUCCTG-3′(反義鏈)；TACE的干擾序列為：5′-GGUUUUAAAGGCUAUGGAATT-3′(正義鏈)和5′-UUCCAUAGCCUUUAAAACCTG-3′(反義鏈)。

1.8 TACE活性分析采用熒光共振能量轉(zhuǎn)移法間接測(cè)定TACE的酶活性，其步驟按照試劑盒的方法進(jìn)行。在該試劑盒中提供了一種底物QXLTM520/ 5-FAM，TACE能特異性切割該底物，從而使熒光分子5-FAM無法被QXLTM520淬滅，其熒光強(qiáng)度與TACE的活性成正比，通過測(cè)定器熒光強(qiáng)度間接測(cè)定TACE的活性(激發(fā)波長490nm，發(fā)射波長520nm)，結(jié)果以相對(duì)活性表示。

1.9統(tǒng)計(jì)學(xué)方法所有計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，并使用GraphPad Prizm 6.0統(tǒng)計(jì)軟件(San Diego,CA)分析數(shù)據(jù)，組間比較采用單因素方差分析，P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 NTHi P4對(duì)NCI-H292細(xì)胞分泌表達(dá)MUC5AC的影響ELISA結(jié)果顯示，陽性對(duì)照組采用5 ng/mL LPS處理后，MUC5AC分泌水平較高。而用不同濃度脂肽P4處理后，隨著P4濃度的遞增，MUC5AC分泌水平逐漸增多，當(dāng)P4濃度為100 ng/mL時(shí)，MUC5AC高達(dá)(439.65±18.57)ng/mL(圖1A)。實(shí)時(shí)定量PCR也顯示：不同濃度的P4脂肽處理細(xì)胞后，對(duì)MUC5AC mRNA的誘導(dǎo)情況有所不同，隨著P4濃度的遞增，MUC5AC mRNA的表達(dá)水平逐漸增多(圖1B)。

圖1 不同濃度P4誘導(dǎo)NCI-H292細(xì)胞表達(dá)分泌MUC5AC的影響A：細(xì)胞分泌MUC5AC蛋白；B：細(xì)胞表達(dá)mRNA。與陰性對(duì)照組(0 ng/mL)相比，*P<0.05，**:P<0.01。

2.2 Duox1/ROS參與MUC5AC分泌圖2A所示，30～50 ng/mL P4處理后可顯著誘導(dǎo)提高細(xì)胞內(nèi)ROS水平(圖2A)，也可明顯促進(jìn)NOX酶體(催化ROS產(chǎn)生的關(guān)鍵酶)的p47phox和p67phox亞基從細(xì)胞漿轉(zhuǎn)位至細(xì)胞膜(圖2B)，表明P4可激活NOX。而采用1mmol/L NOX抑制劑(抑制NOX酶體組裝)Apocynin處理后，可顯著抑制p47phox和p67phox的轉(zhuǎn)位以及ROS的產(chǎn)生(圖2A、B)。而采用siRNA干擾Duox1(NOX亞型)表達(dá)后，NCI-H292細(xì)胞中ROS的水平明顯減少(圖2C)，同時(shí)伴有MUC5AC的降低(圖2D)，表明P4誘導(dǎo)ROS產(chǎn)生以及MUC5AC分泌與激活NOX家族中Duox1有關(guān)。此外，采用ROS抑制劑NAC預(yù)處理細(xì)胞后，發(fā)現(xiàn)MUC5AC的分泌顯著降低(圖2E)，表明MUC5AC分泌受ROS調(diào)控。

2.3 P4經(jīng)ROS增強(qiáng)TACE活性用不同濃度P4處理NCI-H292細(xì)胞30 min后，結(jié)果顯示，隨著P4濃度的遞增，TACE的酶活性逐漸增高，當(dāng)P4濃度為100 ng/mL時(shí)，TACE的酶活性增加了2.51倍(圖3A)。而采用siRNA干擾Duox1表達(dá)后，TACE的酶活性明顯降低(圖3B)。此外，采用不同濃度ROS抑制劑NAC預(yù)處后也得到了類似的結(jié)果(圖3C)。而采用TACE siRNA處理后，可明顯抑制P4誘導(dǎo)MUC5AC的分泌(圖3D)。

圖2 Duox1/ROS通路在介導(dǎo)MUC5AC分泌中的影響A：Apocynin對(duì)P4處理后ROS含量的影響。與0 ng/mL P4組相比，*:P<0.05，與100 ng/mL P4組相比，#:P<0.05；B：P4對(duì)NCI-H292細(xì)胞膜上p47phox和P67phox表達(dá)的影響，同時(shí)采用Gα蛋白(Gαs)作為內(nèi)參；C：干擾Duox1表達(dá)后對(duì)ROS或MUC5AC分泌的影響，與對(duì)照siRNA(scrambled siRNA,scrb)組相比，*:P<0.05，**:P<0.01；Duoxi siRNA(D)或ROS抑制劑NAC(E)對(duì)MUC5AC分泌的影響。與0 ng/mL P4組相比，**:P<0.01，與100 ng/mL P4組相比，#:P<0.05。

圖3 P4經(jīng)ROS/TACE誘導(dǎo)MUC5AC分泌A：不同濃度P4對(duì)細(xì)胞上清中TACE酶活性的影響。與陰性對(duì)照組(0 ng/mL)相比，*:P<0.05；B：NCI-H292細(xì)胞轉(zhuǎn)染Duox1 siRNA后對(duì)TACE酶活性變化的影響。與scrb組相比，*:P<0.05，與100 ng/mL P4+scrb組相比，#:P<0.05；C：不同濃度ROS抑制劑NAC對(duì)TACE的酶活性的影響，與陰性對(duì)照組(0 ng/mL)相比，*:P<0.05；與100 ng/mL P4組相比，#:P<0.05。D：轉(zhuǎn)染TACE siRNA后對(duì)TACE酶活性變化的影響。與scrb組相比，**:P<0.01，與100 ng/mL P4+scrb組相比，#:P<0.05。

2.4 P4誘導(dǎo)MUC5AC分泌與EGFR激活有關(guān)不同濃度P4刺激鼻黏膜細(xì)胞0～1 h，細(xì)胞內(nèi)磷酸化EGFR含量顯著增多，30～60 min后達(dá)到峰值。而采用10 μmol/L TACE抑制劑TAPI處理后，EGFR磷酸化水平明顯受到抑制(圖4A)，而采用5 μg/mL EGFR中和抗體預(yù)處理細(xì)胞30 min后，結(jié)果發(fā)現(xiàn)可顯著下調(diào)MUC5AC的水平(圖4B)，此外，EGFR 抑制劑AG-1478處理(10 μmol/L)也得到了類似結(jié)果(圖4C)，以上結(jié)果表明EGFR的激活與MUC5AC分泌有關(guān)。

圖4 P4誘導(dǎo)MUC5AC分泌與EGFR激活有關(guān)A：P4刺激對(duì)EGFR的磷酸化的影響；B：EGFR中和抗體對(duì)細(xì)胞上清中MUC5AC含量的影響。與0 ng/mL P4組相比，**:P<0.01，與100 ng/mL P4組相比，#:P<0.05。C：EGFR抑制劑AG-1478對(duì)MUC5AC分泌的影響。與0 ng/mL P4組相比，**:P<0.01，與100 ng/mL P4組相比，#:P<0.05。

3 討 論

研究NTHi與宿主免疫系統(tǒng)相互作用，直接采用活菌感染細(xì)胞或提取其細(xì)胞膜成分作用于細(xì)胞更真實(shí)接近體內(nèi)的實(shí)際情況，而本研究采用P4脂肽代替，其主要原因有兩方面：第一，NTHi在細(xì)胞培養(yǎng)基內(nèi)生長速度和細(xì)胞生長速度不一致，難以控制感染復(fù)數(shù)。第二，提取細(xì)胞膜成分時(shí)，涉及到NTHi的培養(yǎng)和去垢劑使用等多個(gè)環(huán)節(jié)，大大增加了內(nèi)毒素污染的幾率[9]。而氣道上皮細(xì)胞本身對(duì)內(nèi)毒素非常敏感，一旦膜脂蛋白中混有內(nèi)毒素，很難用常規(guī)手段去除[9]。由于細(xì)菌膜脂蛋白發(fā)揮免疫刺激活性主要取決于其N末端的Pam3-Cys結(jié)構(gòu)而非氨基酸序列，而基于其N端通用結(jié)構(gòu)人工合成的P4具有幾乎所有膜脂蛋白的致炎活性[10]，因此可作為NTHi膜脂蛋白的替代品而被本研究所采用。

調(diào)控MUC5AC分泌的分子眾多，但不同的刺激因素所激活的信號(hào)通路有所不同。EGFR是一種跨膜型酪氨酸激酶，分子量170 KD。其胞外區(qū)可與多種配體結(jié)合，隨后可由單體轉(zhuǎn)化為二聚體，其胞內(nèi)區(qū)具有激酶活性，可誘導(dǎo)下游多種底物磷酸化。本研究也證實(shí)，NCI-H292細(xì)胞在靜息狀態(tài)下，EGFR磷酸化水平極低，而給予100 ng/mL P4作用30 min后即可誘導(dǎo)EGFR磷酸化，并持續(xù)至2h以上。隨后采用EGFR激酶抑制劑AG1478處理，或者采用EGFR特異性中和抗體封閉其受體表位后，MUC5AC的產(chǎn)生均受到明顯抑制。這說明EGFR信號(hào)通路參與了P4作用后MUC5AC的表達(dá)，且該過程依賴于配體和EGFR的結(jié)合。

EGFR與相應(yīng)的配體(如TGF-α)結(jié)合后，可活化其胞內(nèi)區(qū)域促進(jìn)MUC5AC分泌。研究表明，香煙提取物、革蘭陰性細(xì)菌的LPS都是通過這種機(jī)制激活EGFR誘導(dǎo)黏蛋白MUC5AC表達(dá)上調(diào)[11]。EGFR常見的配體分子包括雙向調(diào)節(jié)蛋白、表皮調(diào)節(jié)素、肝素結(jié)合生長因子和TGF-α等。在這一過程中，TACE發(fā)揮了關(guān)鍵作用。TACE屬于金屬水解蛋白家族的膜結(jié)合型整合素樣金屬蛋白酶，它可促進(jìn)前體TGF-α分子的成熟，后者隨后可與EGFR通過配體—受體相互作用而誘導(dǎo)EGFR磷酸化[12]。本研究當(dāng)中，我們也發(fā)現(xiàn)P4作用NCI-H292細(xì)胞30min后即可增高TACE的酶活性，而采用TACE siRNA處理后，可明顯抑制P4誘導(dǎo)MUC5AC的分泌，此外，TACE抑制劑TAPI處理后也能抑制EGFR的磷酸化，這表明P4通過TACE/EGFR促進(jìn)MUC5AC的分泌。

本研究證實(shí)，P4處理后30min后，即可顯著上調(diào)細(xì)胞內(nèi)ROS的水平，采用ROS抑制劑處理后，TACE活性明顯降低，這表明TACE上游的激活有賴于ROS的產(chǎn)生。而ROS的產(chǎn)生又受NOX家族蛋白Duox的調(diào)控。Duox由一個(gè)膜結(jié)合細(xì)胞色素b558，gp91phox和p22phox以及4個(gè)胞漿成分p47phox，p67phox，p40phox和Rac1/2組成，其中g(shù)p91phox是其催化核心部分，有研究表明，Duox1在LPS誘導(dǎo)的MUC5AC分泌中發(fā)揮重要作用[13]。本研究也發(fā)現(xiàn)，P4處理NCI-H292細(xì)胞后可促進(jìn)Duox1的裝配，即p47phox和p67phox轉(zhuǎn)位至細(xì)胞膜上，從與gp91phox等而形成具有催化功能的酶復(fù)合體。而采用siRNA沉默其表達(dá)，或采用抑制NOX酶體組裝的抑制劑Apocynin處理后，ROS的分泌以及MUC5AC的產(chǎn)生明顯減少，以上結(jié)果表明P4誘導(dǎo)MUC5AC的分泌受Duox1/ROS/TACE通路的調(diào)控。

總之，本研究證實(shí)P4可誘導(dǎo)氣道上皮細(xì)胞分泌MUC5AC。這表明NTHi感染后，可能通過促進(jìn)MUC5AC的過度分泌而加重某些阻塞性疾病的病情。若氣道內(nèi)炎癥狀態(tài)持續(xù)存在，黏液合成進(jìn)一步增多，隨后又有利于病原菌定植，從而形成惡性循環(huán)，加速病情惡化[14]。既然P4脂肽在NTHi中發(fā)揮重要作用，同時(shí)P4也具備了良好的免疫原性與抗原性，并且在疫苗的研制當(dāng)中體現(xiàn)出了良好的效果[15]，從這種意義上講，以P4為分子靶標(biāo)的藥物開發(fā)，有望為NTHi感染后的防控提供新的思路。

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NontypeableHaemophiluslipopeptideP4inducesthesecretionofMUC5ACinairwayepithelialcells

WANG Jian,LI Ni,LI Jing,et al

(DepartmentofEmergencySurgery,TheFirstAffiliatedHospital，UniversityofSouthChina，Hengyang421001,HunanChina)

ObjectiveTo underly the mechanism of the effect ofNontypeableHaemophiluslipopeptideP4 on the secretion of MUC5AC in airway epithelial cells.MethodsHuman airway epithelial cell line NCI-H292 was incubated with different concentration of P4.The concentrations of secreted MUC5AC and the expression of MUC5AC mRNA,the production of reactive oxygen species (ROS) and the enzymatic activity of tumor necrosis factor-α converting enzyme (TACE) were tested.The cell membrane localization of p47phoxand P67phoxsubunits of Duox1 and the phosphorylation of epidermal growth factor receptor (EGFR) were anylized.Results30,50 and 100 ng/mL of P4 increased the expression and secretion of MUC5AC after 24 h of incubation In addition,P4 could induce the p47phox和P67phoxtranslocation from cytosol to plasma membrane and upregulate the intracellular ROS lever.Moreover,P4 could also promote the enzymatic activity of TACE and phosphorylation of EGFR.Pretreatment of the NADPH oxidase inhibitor significantly abrogated the ROS level,and ROS inhibitor could further decrease the enzymic activity of TACE,while silence of TACE could inhibit P4-induced EGFR phosphorylation.Furthermore,the EGFR inhibitor treatment could decrese the MUC5AC secretion.ConclusionP4 induces the expression and secretion of MUC5AC via Duox1/ROS/TACE/ EGFR signaling pathway in NCI-H292 cells.

nontypeable haemophilus; P4; epithelial growth factor receptor; tumor necrosis factor-α converting enzyme; MUC5AC

10.15972/j.cnki.43-1509/r.2017.04.003

2017-03-23；

2017-06-12

國家自然科學(xué)基金(編號(hào)：31500156)；湖南省衛(wèi)生廳科研基金(B2014-054).

*通訊作者，E-mail:lini1283@163.com.

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秦旭平)