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(1.南華大學附屬第二醫(yī)院急診科，湖南 衡陽 421001；2.南華大學附屬第二醫(yī)院超聲醫(yī)學科)

·基礎醫(yī)學·

穿心蓮內酯對乙醇誘導肝細胞氧化應激損傷的作用及機制

李旎1，李晶1，周定耕1，王彪1，曹衡玉2*

(1.南華大學附屬第二醫(yī)院急診科，湖南 衡陽 421001；2.南華大學附屬第二醫(yī)院超聲醫(yī)學科)

目的研究穿心蓮內酯(AD)對乙醇誘導肝細胞氧化應激損傷的保護作用，并探討其作用機制。方法體外培養(yǎng)肝細胞L-02，用0～30 μmol/L AD孵育1 h后，采用酶學方法測定處理前后谷胱甘肽巰基轉移酶(GST)及其過氧化物酶(GPx)和還原酶(GR)活性變化，實時定量PCR檢測其mRNA表達；同時采用Western blot分析絲裂原活化蛋白激酶家族(MAPKs)中p38，JNK和ERK以及Akt的磷酸化變化，并采用PI3K/Akt和ERK抑制劑LY294002和PD98059處理細胞，觀察其在介導核轉錄因子Nrf2轉位和GST、GPx和GR表達中的作用；MTT檢測細胞活性變化。結果0～30 μmol/L AD處理L-02細胞后，GST、GPx和GR的酶活性顯著增高，同時其mRNA表達也明顯增多。AD也能誘導ERK和Akt磷酸化，但對p38和JNK無明顯影響。采用LY294002或PD98059處理細胞后，可抑制AD誘導Nrf2核轉位及Akt和ERK磷酸化，同時也能明顯消除AD對乙醇處理后L-02細胞毒性的保護作用。結論AD經PI3K/Akt和ERK上調抗氧化蛋白GST、GPx和GR的表達而發(fā)揮對乙醇毒性的保護作用。

穿心蓮內酯； 肝細胞； 乙醇

長期過量飲酒是導致酒精性肝病(alcoholic liver disease,ALD)的主要因素，也是引起肝硬化和肝功能衰竭的重要原因[1]。ALD是一種慢性病理過程，其特征是進行性肝功能損害，隨后導致肝脂肪變性、脂肪肝及纖維化，最后可引起肝硬化，部分患者可能進一步發(fā)展為肝失代償和肝細胞癌[2]。ALD的發(fā)病機制復雜，目前認為乙醇攝入所導致的脂質過氧化以及炎癥反應是導致肝細胞損傷的重要因素[3]。在ALD的早期，臨床治療目標是逆轉肝脂肪變性。但從長遠角度來看，戒酒后再配合飲食調節(jié)是防治ALD的重要途徑。研究表明多種來源于自然界的天然植物提取物對乙醇所致的肝細胞損傷具有保護作用。穿心蓮內酯(Andrographolide,AD)是從中藥穿心蓮中提取出來的一種二萜類化合物?，F(xiàn)代藥理學研究表明，AD具有多種生物學活性，包括抗氧化應激、抗炎癥以及抗病毒、抗血小板活性，并對多種毒性物質所致的肝損傷具有保護作用[4-5]。本課題組的前期研究表明，AD可能通過激活Nrf2上調HO-1表達而拮抗乙醇所致肝細胞損傷[6]。但除此之外是否還具有其他保護機制目前仍不明確。本研究旨在進一步探討穿心蓮內酯對乙醇誘導肝細胞氧化應激損傷的機制。

1 材料與方法

1.1實驗材料穿心蓮內酯(AD，貨號90281)、LY294002、PD98059購自Sigma (St.Louis,CA)。Anti-AKT 及磷酸化-AKT (p-AKT),anti-ERK1/2及磷酸化-ERK1/2 (p-ERK),anti-JNK1/2及磷酸化JNK1/2 (p-JNK),anti-p38及磷酸化p38抗體購自Cell Signaling Technology。Anti-GPx,anti-GR,抗多聚ADP多聚酶 (anti-PARP)及抗生長因子受體結合蛋白2(anti- GRB2)購自Santa Cruz。RNA提取試劑盒購自Qiagen，實時定量PCR所用引物由上海生工合成,dNTPs 及逆轉錄酶購自Promega，Taq酶購自Roche。

1.2細胞培養(yǎng)與處理人肝細胞細胞株L-02(ATCC,Manassas,VA)采用含有10%胎牛血清，1%葡萄糖，1%谷氨酰胺，100 U/mL青霉素和100 μg/mL鏈霉素的RPMI-1640基中，置于含5% CO2的恒溫培養(yǎng)箱中37 ℃條件下培養(yǎng)。

1.3谷胱甘肽巰基轉移酶(GST)及其過氧化物酶(GPx)、還原酶(GR)活性測定細胞處理結束后用PBS漂洗并于800 rpm離心5 min獲取細胞沉淀，隨后加入懸浮緩沖液(含20 mmol/L Tris，5 mmol/L EDTA和0.5 mmol/L 巰基乙醇)2 mL，經超聲并于3 000 rpm條件下離心15 min，獲取上清用于GPx和GR活性測定。GPx和GR活性測定參照參考文獻提供的方法進行[7- 8]。GSH的測定按照Biovision公司提供的試劑盒進行(GST Fluorometric Activity Assay Kit，CA)。在該試劑盒中提供了一種染料monochlorobimane(MCB)，它能與谷胱甘肽特異結合，非結合狀態(tài)的MCB不發(fā)出任何熒光，當其與氧化或還原狀態(tài)的GSH結合后，在380 nm激發(fā)波長下可發(fā)藍色熒光，通過測定熒光強度間接測定GSH活性。

1.4 RNA提取與實時定量PCR 采用TRIzol試劑提取細胞總RNA，并將其逆轉錄為cDNA。加入10 mmol/L 正向和反向引物以及SYBR后(Invitrogen,Carlsbad,CA)，實時定量PCR于ABI 7500上進行擴增。擴增條件：94 ℃預變性1 min，隨后進入以下40個循環(huán)：94 ℃ 1 min，58 ℃ 1min，72 ℃ 2 min。本研究所用的引物如下：GPx,forward 5′-CCTCAAGTACGTCCGACCTG-3′,reverse 5′-TAGGAGTTGCCAGACTGCTG-3′;GR，forward 5′-CAGTGGGACTCACGGAAGAT-3′,reverse 5′- TTCACTGCAACAGCAAAACC GST-3′;β-actin,forward 5′-ACC CAC ACT GTG CCC ATC TA-3′,reverse 5′-CGG AAC CGCTCA TTG CC-3′。結果以2-ΔΔCt表示。

1.5蛋白提取與Western blot分析細胞處理結束后，無菌PBS洗滌，采用Pierce提供的試劑盒提取細胞核與細胞漿蛋白。測定其蛋白濃度后，將加入等體積的2×SDS上樣緩沖液煮沸5 min，取20 μL蛋白用于SDS-PAGE。電泳結束后，將其電轉印到硝酸纖維素膜上。用5%脫脂奶粉室溫封閉2 h，后，加入相應一抗4 ℃孵育過夜，并采用ECL發(fā)光(Millipore,Billerica,MA)、顯影(VL Chemi-Smart 3000,Viogene BiotekSunnyvale,CA)。并采用Quantitative One軟件進行灰度掃描。

1.6 MTT檢測細胞活性采用MTT法分析細胞活性。即，培養(yǎng)于96孔板中的L-02細胞(1×105/mL)，經0～30 μmol/L AD和10～500 mmol/L 乙醇作用24 h后，棄培養(yǎng)上清，加入100 μL MTT溶液(將10 μL 10 μg/mL MTT用90 μL培養(yǎng)基稀釋)，37 ℃繼續(xù)孵育2 h。孵育結束后加入100 μL DMSO溶液，充分震蕩以溶解甲瓚，并于570 nm波長處測定其吸光度(μQuant,Bio-Tek)，并計算細胞相對活性(相對活性=處理組吸光度/對照組吸光度×100%)。

1.7統(tǒng)計學分析采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件進行數據分析，計量數據用均數±標準差表示，多組間比較采用方差分析，組間比較采用LSD-t檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 AD上調乙醇處理后肝細胞中GPx,GR和GST活性在前期研究當中已經證實AD處理能增強乙醇處理后肝細胞的活性，并能下調細胞內ROS的水平[6]。考慮到氧化應激是ALD發(fā)生的重要因素，因此對肝細胞內抗氧化/解毒功能的相關酶類的活性進行了檢測。結果如圖1所示，給予5 μmol/L、10 μmol/L和30 μmol/L AD孵育24 h后，隨著AD濃度的增強，GPx、GR和GST的酶活性逐漸增高。

圖1 不同濃度AD上調GPx、GR和GST的酶活性A：不同濃度AD對GPx和GST酶活性的影響；B：不同濃度AD對GR酶活性的影響 與對照組(0 μmol/L)比較，*P<0.05

2.2 AD促進肝細胞中GPx,GR和GST mRNA表達采用實時定量PCR檢測了其表達水平。結果顯示， AD處理后，GPx,GR和GST mRNA表達水平隨之增高(圖2)。以上結果示5 μmol/L、10 μmol/L和30 μmol/L AD能影響GPx,GR和GST mRNA和蛋白表達。

圖2 不同濃度AD上調GPx、GR和GST mRNA表達與對照組(0μmol/L)相比，*P<0.05

2.3 AD促進L-02細胞中Akt和ERK磷酸化Western blot結果顯示，不同濃度AD處理1 h后，細胞內Akt和ERK的磷酸化水平隨著AD濃度的遞增而增加，而p38和JNK的磷酸化水平無明顯變化(圖3)。

圖3 不同濃度AD誘導Akt和ERK磷酸化

2.4 AD經PI3K/Akt和ERK途徑誘導Nrf2核轉位

采用LY294002或PD 98059預處理細胞1 h后，細胞核內Nrf2含量明顯低于未處理組，而內參PARP保持恒定(圖4)。

2.5 AD經PI3K/Akt和ERK促進GPx,GR和GST表達實時定量PCR結果也顯示，LY294002和PD98059預處理細胞1 h后，可明顯逆轉AD對GPx,

圖4 PI3K/Akt和ERK抑制劑對Nrf2核轉位的影響

GR和GST的誘導效應(圖5A)。此外，LY294002和PD98059處理也能明顯削弱AD對GPx,GR和GST活性的影響(圖5B、C)。

2.6 AD激活PI3K/Akt和ERK發(fā)揮對乙醇所致細胞毒性MTT結果顯示，AD可明顯改善乙醇處理后的細胞毒性作用。而在AD處理前先將細胞用LY294002或PD98059預處理1 h后，結果顯示均可逆轉AD的保護效應(圖6)。

圖5 PI3K/Akt和ERK抑制劑對GPx,GR和GST表達的影響與對照組(0μmol/L AD)比較，*:P<0.05；與30 μmol/L AD比較，#:P<0.05

圖6 PI3K/Akt和ERK抑制劑抑制AD對乙醇所致毒性的保護作用與對照組(0 μmol/L AD)比較，*:P<0.05；與100 mmol/L 乙醇比較，#:P<0.05；與30 μmol/L AD+乙醇比較，§:P<0.05

3 討 論

AD是從中草藥植物穿心蓮中提取出來的一種二萜類化合物，現(xiàn)有的研究證實AD具有抗氧化應激損傷的作用，其機制可能與清除自由基有關。本文作者前期研究也發(fā)現(xiàn)，AD可能通過激活Nrf2上調HO-1表達而發(fā)揮對乙醇所致肝細胞損傷的保護作用[6]。在本研究中，對AD參與細胞保護作用的抗氧化相關酶類的表達進行了探討。細胞內源性抗氧化谷胱甘肽及其相關酶類如GR、GPx和GST在拮抗各種氧自由基損傷中發(fā)揮重要作用。GST和GPx主要參與清除過氧化物[9-10]，而GR主要參與氧化型谷胱甘肽的再生[11]。因此谷胱甘肽相關酶類在氧化應激損傷中發(fā)揮重要作用。本研究也發(fā)現(xiàn)，AD處理后細胞內GPx、GR以及GST的酶活性、mRNA及蛋白表達水平明顯增高，這表明AD能調節(jié)GSH相關酶基因的表達，這也意味著AD處理后可能同時誘導這些抗氧化相關基因而拮抗氧化應激損傷。

前期研究表明AD可激活核轉錄因子Nrf2而誘導HO-1表達?？紤]到Nrf2的激活受上游信號通路如MAPKs和Akt的調控，并與其絲氨酸/酪氨酸殘基的磷酸化有關[12-13]，因此隨后對這些激酶進行了觀察。結果發(fā)現(xiàn)AD處理可明顯誘導Akt和ERKs的磷酸化，而對JNK，p38無明顯影響。隨后通過采用ERK和PI3K特異性抑制劑PD98059和LY294002處理后，細胞核內Nrf2水平明顯減少，表明Nrf2的激活有賴于ERK和PI3K。此外，PD98059和LY294002處理后，GPx，GR和GST的表達及活性，這表明Nrf2和GPx，GR和GST之間可能存在某種關聯(lián)。

考慮到細胞內具有保護性的酶類能拮抗氧化應激損傷，因此隨后對AD的細胞保護作用進行了探討。細胞毒性實驗結果顯示，AD處理后能明顯上調乙醇的細胞毒性。同時采用ERK或PI3K抑制劑處理后，AD對細胞的保護效應消失，這表明AD抗乙醇所致的毒性與ERK和PI3K的激活有關。

總之，本研究證實AD能增強肝細胞的抗氧化功能，從而發(fā)揮對乙醇所致的氧化應激保護作用，這種保護作用有賴于PI3K/Akt和ERK通路的激活，隨后誘導Nrf2核轉位，后者可能通過某種未知的機制上調GPx，GR和GST的表達，最終改善乙醇對肝細胞的毒性作用。因此，AD除了自身的自由基清除效應外，它本身也具有調控細胞內信號通路的作用，從而具有拮抗乙醇所致肝細胞毒性的潛能。

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EffectofAndrographolideonethanol-induceddamageinhumanlivercells

LI Ni,LI Jing,ZHOU Dinggeng,et al

(DepartmentofEmergency,theSecondAffiliatedHospitalofUniversityofSouthChina,Hengyang421001，Hunan,China)

ObjectiveTo investigate the molecular mechanism involved in the protection exerted by Andrographolide (AD) on ethanol-induced damage in human L-02 liver cells.MethodsThe human L-02 liver cells were cultured in vitro and were treated with 0～30 μmol/L AD,the activity of glutathione-related enzymes such as glutathione peroxidase (GPx),glutathione reductase (GR) and glutathione S-transferase (GST) were measured by enzymic methods,the expression of mRNA were detected by real-time PCR.Phosphotylation of the mitogen-activated protein kinase family member of p38,JNK,ERK,and Akt were detected by Western blot.The cell viability was measured by MTT.ResultsTreatment of L-02 cells with Andrographolide increased the expression of mRNA and the activity of glutathione-related enzymes such as GPx,GR and GST.Andrographolide also induced the phosphorylation of Akt and ERK,but there was no difference in the phosphorylated levels of p38 and JNK.Further studies with PI3K and ERK specific inhibitors LY294002 and PD98059 confirmed that both molecular pathways are critical for the nuclear translocation of Nrf2,the increased enzyme expression and activity and the beneficial effect against oxidative stress induced by Andrographolide.ConclusionAndrographolide prevents ethanol-induced damage through the modulation of PI3K/Akt and ERK pathways involved in antioxidant enzymes GST,Gpx and GR regulation.

Andrographolide; Hepatic cell; Ethanol

10.15972/j.cnki.43-1509/r.2017.04.006

2017-04-23；

2017-06-10

湖南省衛(wèi)生廳科研基金(B2014-054)

*通訊作者，E-mail:caohengyuhengyang@163.com.

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蔣湘蓮)