張學(xué)婷，張 磊，周英奕，裴亞妮，薛衛(wèi)國

(北京中醫(yī)藥大學(xué)，北京 100029)

電針“百會”“涌泉”穴對APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠海馬β淀粉樣蛋白及載脂蛋白E水平的影響*

張學(xué)婷，張 磊，周英奕，裴亞妮，薛衛(wèi)國△

(北京中醫(yī)藥大學(xué)，北京 100029)

目的：觀察電針對4月齡APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠海馬載脂蛋白E(ApoE)及β淀粉樣蛋白(Aβ)水平的影響，探討針刺防治AD的機(jī)制。方法：將12只雄性4月齡APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因陽性小鼠隨機(jī)分為模型組和電針治療組，以6只同月齡背景小鼠C57BL/6設(shè)為正常對照組，電針“百會”“涌泉”或同等條件束縛作為干預(yù)手段，每次持續(xù)15 min，每日1次，療程為2周。以酶聯(lián)免疫吸附測定法(ELASA)測定海馬Aβ1-42的含量、ApoE2、ApoE4以及膽固醇-24S-羥化酶(CYP46)的含量。結(jié)果：模型組海馬Aβ1-42的含量高于正常對照組(P<0.01)；電針治療組Aβ1-42的含量低于模型組(P<0.01)。模型組海馬ApoE2、ApoE4的含量與正常對照組相比，差異無統(tǒng)計學(xué)意義，電針治療組ApoE2、ApoE4的含量均高于模型組(P<0.05)。電針治療組和模型組的CYP46含量均高于正常對照組，但其差異無統(tǒng)計學(xué)意義。結(jié)論：電針可降低APP/PS1小鼠海馬Aβ1-42水平，其機(jī)制有可能是通過影響海馬ApoE的水平從而實現(xiàn)的。

電針；阿爾茨海默??；β淀粉樣蛋白；載脂蛋白E；膽固醇代謝

阿爾茨海默病(Alzheimer’s diseases,AD)是一種漸進(jìn)性的中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，目前尚未發(fā)現(xiàn)有效的治療手段。中醫(yī)針灸治療腦病已有數(shù)千年的歷史。β淀粉樣蛋白(beta amyloid protein,Aβ)級聯(lián)學(xué)說是當(dāng)今比較公認(rèn)的AD發(fā)病機(jī)制學(xué)說 。此學(xué)說認(rèn)為AD發(fā)病的關(guān)鍵點是腦內(nèi)Aβ水平的升高[1]。Aβ是由淀粉樣前體蛋白(Amyloid protein precursor,APP) 水解產(chǎn)生的，病理狀態(tài)下產(chǎn)生過量的Aβ，形成以Aβ沉積為核心的老年斑而致病，不僅如此，它的寡聚體和纖絲體形式還直接或間接的對神經(jīng)元產(chǎn)生毒性作用[2]，其中Aβ1～42是構(gòu)成淀粉樣斑塊的核心蛋白[3]。

ApoE是1973年由Shore等[4]首先發(fā)現(xiàn)的一種富含精氨酸的堿性蛋白，人類ApoE基因位于19號染色體，含有299個氨基酸，分為3個亞型，即ε2、ε3和ε4[5]。流行病學(xué)和遺傳學(xué)研究發(fā)現(xiàn)[6]ApoE4等位基因是目前公認(rèn)的晚發(fā)性和散發(fā)性AD發(fā)病的重要危險因子[7]。目前大量研究表明，人體內(nèi)淀粉樣前體蛋白的分解與代謝即Aβ的產(chǎn)生受到ApoE基因多態(tài)性的影響，但ApoE作為一種可以在腦內(nèi)合成的重要的載脂蛋白，它的一項重要的功能就是參與腦內(nèi)膽固醇的轉(zhuǎn)運，在腦內(nèi)膽固醇代謝和神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育及損傷修復(fù)過程中起著重要作用[8]。

腦是ApoE的第二大合成器官，ApoE在腦內(nèi)負(fù)責(zé)腦內(nèi)膽固醇和脂質(zhì)蛋白的轉(zhuǎn)運，實現(xiàn)細(xì)胞間的物質(zhì)交換[9]。有研究表明ApoE結(jié)合脂質(zhì)的部位與ApoE結(jié)合Aβ的部位相同，二者存在競爭關(guān)系[10]。實際上，大腦清除Aβ主要依靠的是腦實質(zhì)細(xì)胞即星型膠質(zhì)細(xì)胞和神經(jīng)元細(xì)胞上的受體介導(dǎo)，因為腦內(nèi)的Aβ大多數(shù)都是先與ApoE的受體相結(jié)合，然后再轉(zhuǎn)運至細(xì)胞溶酶體內(nèi)由蛋白水解酶進(jìn)行降解，最后通過血腦屏障或細(xì)胞間液排出[11]。

對于正常人來說，24S-羥膽固醇可以穿過血腦屏障進(jìn)入外周循環(huán)，是腦內(nèi)膽固醇分解代謝的主要代謝產(chǎn)物[12]，腦內(nèi)膽固醇主要經(jīng)膽固醇-24S-羥化酶(CYP46)轉(zhuǎn)化為24S-羥膽固醇的形式轉(zhuǎn)移至肝臟代謝排出體外，所以觀察海馬CYP46的水平可以反映海馬的膽固醇的降解代謝[13]。

本課題組前期研究表明電針“百會”“涌泉”可以降低APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因鼠海馬Aβ水平，ApoE可以影響Aβ水平,所以猜測電針干預(yù)有效降低Aβ水平是通過影響海馬ApoE的水平、調(diào)節(jié)膽固醇代謝、增加海馬內(nèi)Aβ的清除從而降低了Aβ的水平。因此本實驗將觀察電針“百會”“涌泉”對學(xué)習(xí)記憶中心-海馬的ApoE、Aβ以及膽固醇的水平，探討電針防治阿爾茨海默病的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物模型及分組 本實驗以SPF級APPswe/PS1dE9雄性4月齡小鼠為動物模型，在滿4月齡時稱重排序，運用隨機(jī)數(shù)字表進(jìn)行完全隨機(jī)分組，將12只雄性APPswe/PS1dE9小鼠分為兩組：電針組和模型組，每組6只，6只同月齡C57BL/6雄性小鼠為正常對照組。本實驗通過北京中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物倫理委員會批準(zhǔn)。

1.1.2 試劑和儀器 人Aβ42 ELASA試劑盒(美國，invitrogen,KHB3544);CYP46 試劑盒(MM-0667M1，酶免公司);ApoE2試劑盒(MM-0675M1，酶免公司);ApoE4試劑盒(MM-0676M1酶免公司);韓氏(HANs)LH202H型穴位神經(jīng)刺激儀(北京華衛(wèi)產(chǎn)業(yè)開發(fā)公司);一次性使用無菌針灸針(0.25 mm×13 mm,北京中研太和醫(yī)藥有限公司)。

1.2 治療方法

電針組：以自制鼠袋將小鼠固定于實驗操作臺，按照小鼠標(biāo)準(zhǔn)針灸穴位圖譜及動物解剖學(xué)方法，在小鼠頂骨正中取“百會”穴，在小鼠兩足足底前、中1/3交界處取“涌泉”穴。本實驗針具選用由北京中研太和醫(yī)藥公司生產(chǎn)的一次性針灸針，規(guī)格為0.25 mm×13 mm，穴位與針具進(jìn)行常規(guī)消毒，進(jìn)行針刺，針刺深度為2～3 mm，“百會” 穴運用手針，雙“涌泉” 穴在小幅度捻轉(zhuǎn)后接HANs電針儀，采用頻率為1/50 Hz，強度0.5 mA的疏密波，以小鼠保持安靜不掙扎嘶叫，針柄震顫為度。每次針刺持續(xù)15 min，每日1次，共治療2周。

模型組以及正常對照組：以相同方法用自制鼠袋束縛15 min，每日1次，共束縛2周。

1.3 腦組織取材及相關(guān)指標(biāo)ELISA檢測

1.3.1 腦組織取材及ELISA樣品制備 將每只小鼠予0.3%戊巴比妥鈉(30 mg/kg)麻醉，脫頸后斷頭。開顱后，在冰上取海馬，分別稱取各組實驗動物腦組織后放入各自的勻漿器中并進(jìn)行編號，放置于冰上；按比例配制蛋白提取液：RIPA：PMSF=100∶1，按照10 mg組織加入100 μL提取液的比例進(jìn)行配制，每次配制1 500 mL提取液；每個樣品中需加入500 μL的蛋白提取液到勻漿器中；Aβ1-42ELASA樣品制備需要在PMSF中加入8倍體積的5 mol鹽酸胍、50 mmol Tris鹽酸(pH 8.0)。在冰上進(jìn)行勻漿器操作，將腦組織徹底研磨，在冰上孵育30 min，使組織細(xì)胞徹底裂解；4℃低溫下離心5 min，轉(zhuǎn)速為16000 rpm，離心后取上清液即所提取的蛋白轉(zhuǎn)移至-80℃的冰箱保存。

1.3.2 ELASA檢測 Aβ1～42檢測：采用ELISA實驗方法，用人Aβ1～42ELISA超敏試劑盒(96T,美國，invitrogen,KHB3544)對海馬組織樣品的Aβ1～42含量進(jìn)行檢測，具體操作步驟按照說明書操作，最后在450 mm處檢測吸光度。將標(biāo)準(zhǔn)品按試劑盒的要求用標(biāo)準(zhǔn)稀釋液稀釋，制備標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品。標(biāo)準(zhǔn)品稀釋后，立即置于冰上，待實驗使用。根據(jù)樣品稀釋濃度計算小鼠海馬組織的Aβ1～42濃度。

ApoE2水平的檢測：采用ELISA雙抗體夾心法，用小鼠ApoE2試劑盒(MM-0675M1酶免公司),具體操作步驟按照說明書操作，設(shè)置樣品孔和標(biāo)本孔。最后在450 mm處檢測吸光度，根據(jù)樣品稀釋濃度計算小鼠海馬組織ApoE2的濃度。

ApoE4水平的檢測：采用ELISA雙抗體夾心法，用小鼠ApoE4試劑盒(MM-0676M1酶免公司),具體操作步驟按照說明書操作，設(shè)置樣品孔和標(biāo)本孔。最后在450 mm處檢測吸光度，根據(jù)樣品稀釋濃度計算小鼠海馬組織的ApoE4的濃度。

CYP46水平的檢測:采用ELISA雙抗體夾心法，用小鼠CYP46試劑盒(MM-0667M1，酶免公司),具體操作步驟按照說明書操作，設(shè)置樣品孔和標(biāo)本孔。最后在450 mm處檢測吸光度，根據(jù)樣品稀釋濃度計算小鼠海馬組織的CYP46的濃度。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 電針對4月齡APP/PS1小鼠海馬Aβ1～42水平的影響

見圖1和表1。模型組海馬Aβ1～42的含量顯著高于正常對照組(P<0.01)；電針組Aβ1～42的含量顯著低于模型組(P<0.01)。

圖1 電針對4月齡APP/PS1小鼠海馬Aβ1～42水平的影響只小鼠/組)注：與模型組比較,▲▲P<0.01;與正常對照組比較,**P<0.01

組別nCYP46Aβ1～42正常對照組(C)6623.63±107.0611.93±5.02模型組(M)6567.65±130.7974.62±12.01▲▲電針組(EA)6583.11±145.5141.12±2.76**

注：與正常對照組比較，▲▲P<0.01；與模型組比較，**P<0.01

2.2 電針對4月齡APP/PS1小鼠海馬ApoE2水平的影響

見圖2和表2。模型組海馬ApoE2的含量與正常對照組相比無統(tǒng)計學(xué)差異。電針組ApoE2的含量顯著高于模型組(P<0.01)，電針組ApoE2的含量顯著高于正常對照組(P<0.01)。

圖2 電針對4月齡APP/PS1小鼠海馬ApoE2水平的影響只小鼠/組)注：與正常對照組比較，**P<0.01；與電針組比較，▲▲P<0.01

組別nApoE2ApoE4正常對照組(C)6144.37±12.75116.66±33.06模型組(M)6136.26±28.56▲▲94.96±38.19▲▲電針組(EA)6208.16±31.86**161.26±19.01*

注：與電針組比較，▲▲P<0.01；與正常對照組比較，**P<0.01，*P<0.05

2.3 電針對4月齡APP/PS1小鼠海馬ApoE4水平比較

如圖3和表2所示，模型組的ApoE4的含量低于正常對照組，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05),電針組ApoE4的含量高于模型組的含量(P<0.01),電針組ApoE4的含量高于正常對照組(P<0.05)。

圖3 電針對4月齡APP/PS1小鼠海馬ApoE4水平的比較只小鼠/組)注：與電針組比較，**P<0.01;與正常對照組比較,▲P<0.05

2.4 4月齡APP/PS1小鼠海馬CYP46水平的比較

如圖4和表1所示，3組的CYP46水平，3組對比差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

圖4 4月齡APP/PS1小鼠海馬CYP46水平的比較只小鼠/組)

3 討論

Aβ級聯(lián)學(xué)說認(rèn)為Aβ的神經(jīng)毒性以及沉積是AD發(fā)病的重要事件，正常情況下，Aβ在腦內(nèi)的產(chǎn)生和清除存在動態(tài)平衡[14]。體外研究表明ApoE可以與Aβ結(jié)合，且結(jié)合具有型差異性：E2>E3>E4,并且Aβ的沉積量與ApoE成劑量依賴關(guān)系，在apoE(-/-)的老年性癡呆小鼠中轉(zhuǎn)入人的apoE后，腦內(nèi) Aβ的沉積量減少，其機(jī)制可能是在LRP-1的參與下與ApoE結(jié)合的Aβ由于構(gòu)型的改變，毒性下降，攝取和降解增多[15]。關(guān)于ApoE影響Aβ水平的機(jī)制， ApoE可以和Aβ結(jié)合成可溶性的復(fù)合物，從而調(diào)節(jié)Aβ的代謝、聚集和沉淀[16]，ApoE在Aβ形成與清除過程中充當(dāng)載體或分子伴侶，ApoE在細(xì)胞外與Aβ相互作用，從而導(dǎo)致Aβ的清除[17，18]。本研究結(jié)果電針能夠增加APP/PS1小鼠海馬組織內(nèi)ApoE的水平，ApoE2和ApoE4相比都有提高，提高的含量沒有體現(xiàn)分型差異；電針降低Aβ水平，提示電針能夠促進(jìn)ApoE和Aβ結(jié)合成可溶性復(fù)合物，從而促進(jìn)Aβ的清除，減少其沉積。模型組ApoE和CYP46的水平與正常對照組相比沒有統(tǒng)計學(xué)差異，提示該模型在進(jìn)行基因雙轉(zhuǎn)后，暫時沒有發(fā)現(xiàn)對4月齡小鼠ApoE和腦內(nèi)膽固醇的水平造成影響。

近年研究提示腦內(nèi)膽固醇的水平與Aβ水平密切相關(guān)，神經(jīng)元膜膽固醇水平的改變和膽固醇在亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)中的分布被認(rèn)為與Aβ的形成、異常聚集、神經(jīng)毒性以及降解有著潛在聯(lián)系[19-20]。最近的研究表明AD病人腦內(nèi)出現(xiàn)膽固醇代謝紊亂，ApoE在脂蛋白顆粒和膽固醇代謝中起重要的作用，由于完美的血腦屏障阻止外周的膽固醇進(jìn)入腦內(nèi)，絕大多數(shù)腦內(nèi)的膽固醇都是自身合成的[21]。大多數(shù)突觸生成需要的膽固醇來自星形膠質(zhì)細(xì)胞的大量合成，并且由含ApoE的脂蛋白運輸?shù)缴窠?jīng)元，由ApoE介導(dǎo)的膽固醇回收功能受損會導(dǎo)致膽固醇在溶酶體的積累和降低質(zhì)膜膽固醇的回收效率[22]。有研究表明[23]腦內(nèi)膽固醇水平的增加提高了β和γ分泌酶的活性，促進(jìn)Aβ的生成以及沉積。腦組織中如果膽固醇代謝出現(xiàn)紊亂，膽固醇會在組織內(nèi)堆積，從而刺激β-分泌酶、γ-分泌酶活性以至于β-淀粉樣蛋白的大量產(chǎn)生[24]。本研究結(jié)果并未體現(xiàn)電針對APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠海馬組織內(nèi)膽固醇含量及代謝水平的影響，造成的原因可能是樣本量小或者電針不能影響海馬膽固醇水平。

ApoE在神經(jīng)元修復(fù)和再生中起重要作用，于是越來越多的專家學(xué)者開始致力于研究ApoE蛋白亞型與ApoE受體的聯(lián)合作用對淀粉樣前體蛋白分解過程產(chǎn)生的影響[25]。有實驗證明ApoE與APP的代謝有直接關(guān)系，培養(yǎng)基加入ApoE后，可引起Aβ分泌的減少[15]。ApoE通過競爭性結(jié)合Aβ，與LRP1、其他受體/轉(zhuǎn)運體的結(jié)合，阻斷Aβ的細(xì)胞攝取和轉(zhuǎn)運的過程，從而降低腦內(nèi)Aβ的水平[26]。近年針灸治療老年癡呆的臨床報告均顯示出了針灸療法對于防治AD的肯定療效，本課題組研究阿爾茨海默病在以腎精虧虛為本，瘀血、毒邪、痰濁三濁互結(jié)為標(biāo)的病理機(jī)制指導(dǎo)下，以“益腎、醒腦、祛濁”為治療準(zhǔn)則，運用電針治療，取“百會”“涌泉”穴，兩穴合用，既可補腎益髓，又可行氣活血、化瘀祛濁通絡(luò)、開竅醒神[27]。

本課題組自2012年起對電針干預(yù)APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠，APPswe/PS1dE9雙轉(zhuǎn)基因小鼠是目前國際公認(rèn)的影響Aβ水平的有效評價動物模型[28]，現(xiàn)階段該動物模型廣泛運用于AD的治療藥物以及治療方式的科學(xué)研究[29]。對改善小鼠學(xué)習(xí)記憶能力的淀粉樣蛋白途徑作用機(jī)制進(jìn)行研究，初步肯定電針“百會、涌泉”穴對APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠腦組織內(nèi)Aβ整體水平的降低具有調(diào)節(jié)趨勢。本次研究選用4月齡APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠，進(jìn)行為期2周的電針治療，電針干預(yù)的介入時間選擇未出現(xiàn)老年斑的AD早期，在小鼠4月齡時，早期電針干預(yù)可以降低海馬內(nèi)Aβ1～42的水平，同時提高了海馬內(nèi)ApoE2和ApoE4的水平，但CYP46的水平?jīng)]有發(fā)生改變。綜上所述在AD早期，Aβ生成增多，這時通過電針針刺“百會”“涌泉”使得小鼠海馬ApoE的水平升高。ApoE的水平升高可以增加腦內(nèi)Aβ的清除，從而降低Aβ的含量。所以提高腦內(nèi)ApoE的水平，調(diào)節(jié)ApoE受體和轉(zhuǎn)運體的水平和活性可能成為AD的防治手段。故ApoE可能為電針防治AD的一個靶點，本實驗為針刺“益腎祛濁法”防治AD提供科學(xué)實驗依據(jù)。

本研究下一步將擴(kuò)大實驗樣本量，繼續(xù)探討不同的ApoE分型在AD中發(fā)揮的不同作用以及電針是否會對海馬膽固醇代謝水平產(chǎn)生影響，并且測定CYP46的同時直接測定海馬的總膽固醇水平。

4 結(jié)論

電針可降低4月齡APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠海馬Aβ水平，其機(jī)制可能是通過影響腦內(nèi)ApoE的水平從而實現(xiàn)的，但電針是否影響了海馬內(nèi)的膽固醇代謝水平，還需進(jìn)一步的實驗研究。

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EffectofElectro-acupunctureStimulationofGV20andKI1onExpressoinsofHippocampalAβandApoEinAPP/PS1TransgenicMice

ZHANG Xue-ting, ZHANG Lei, ZHOU Ying-yi, PEI Ya-ni, XUE Wei-guo△

(BeijingUniversityofChineseMedicine,Beijing100029,China)

Objective：To observe the effect of electro-acupuncture on the levels of apolipoprotein E(ApoE) and Amyloid-β(Aβ) of hippocampus in 4-month-old APP/PS1 transgenic mice, and to explore the mechanism of acupuncture in the prevention of AD.Methods12 APP/PS1 transgenic mice (male, 4-month-old) were randomly divided into the model group and the electro-acupuncture group.Six C57BL/6 mice with same age were used as the blank control. In the electro-acupuncture group, the intervention was needling points of GV20 and KI1; whereas, in the control group, the mice were given equivalent constraint; the intervention was 15min per day for two weeks. The levels of Aβ1-42, ApoE2, ApoE4 and cholesterol-24S-hydroxylase(CYP46) in hippocampus were measured with ELASA method.ResultsIn terms of the content of Aβ1-42, it was higher in the model group than that in the blank control group(P<0.01); it was lower in the electro-acupuncture group than that in the model group(P<0.01). In terms of the the content of ApoE2 and ApoE4, there was no significant difference between the model group and the blank control group; they were highly increased in the electro-acupuncture group compared to those in the model group(P<0.05). In terms of the content of CYP46, it was higher both in the electro-acupuncture group and in the model group, compared to the blank control group; but the difference was not statistically significant.ConclusionElectro-acupuncture can reduce the level of hippocampal Aβ1-42 in APP/PS1 mice, and its mechanism may be associated with affecting the level of hippocampal ApoE.

Electro-acupuncture; Alzheimer’s diseases; Amyloid-β; ApoE; Cholesterol metabolism

R246.6

A

1005-0779(2017)12-0073-04

國家自然科學(xué)基金項目,編號：81273826;北京中醫(yī)藥大學(xué)研究生自主課題，編號：2017-JYB-XS-O49。

張學(xué)婷(1989-)，女，2015級針灸推拿學(xué)專業(yè)碩士研究生。

△通訊作者：薛衛(wèi)國(1968-)，男，教授，主任醫(yī)師，博士研究生導(dǎo)師，主要從事阿爾茨海默病機(jī)制研究。

2017-08-03