劉春麗，張 潔，齊志偉，梁 媛，黃躍雁，張淑君

(承德醫(yī)學院附屬醫(yī)院 耳鼻喉科， 河北 承德067000)

miR-130a-3p通過抑制CXCL12抑制鼻咽癌細胞增殖與侵襲

劉春麗，張 潔，齊志偉，梁 媛，黃躍雁，張淑君*

(承德醫(yī)學院附屬醫(yī)院 耳鼻喉科， 河北 承德067000)

目的探討miR-130a-3p 對人鼻咽癌細胞CNE-1功能的影響及其可能的靶向基因。方法采用脂質(zhì)體介導方法將miR-130a-3p 模擬物(實驗組)或?qū)φ漳M物(對照組)轉(zhuǎn)染CNE-1細胞，分別用CCK-8 法和Transwell 試驗檢測細胞增殖侵襲和遷移能力變化，Western Blot檢測趨化因子CXCL12蛋白表達。結(jié)果相較對照組，實驗組CNE-1 細胞的增殖,侵襲和遷移能力增強(P<0.05)，細胞中CXCL12蛋白表達水平明顯下調(diào)(P<0.05)。結(jié)論miR-130a-3p 可能通過調(diào)節(jié)CXCL12蛋白表達抑制人鼻咽癌細胞CNE-1細胞的增殖、侵襲和遷移。

鼻咽癌；趨化因子；CXCL12； miR-130a-3p； CNE-1 細胞

(ChinJLabDiagn,2017,21:2168)

鼻咽癌原發(fā)于鼻咽黏膜上皮，常發(fā)于咽隱窩和頂前壁，常常起病隱蔽，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移早。目前鼻咽癌治療以放療為主要手段，但因腫瘤容易復發(fā)和早期轉(zhuǎn)移，預后往往不佳。因此，特異性分子標記物及基因治療靶位的發(fā)現(xiàn)及相關作用機制的研究，對降低鼻咽癌患者死亡率，提高預后具有重大意義。

本研究借助細胞轉(zhuǎn)染技術，采用脂質(zhì)2000介導使得miRNA-130a-3p 模擬物轉(zhuǎn)染入鼻咽癌CNE-1細胞中，從而觀察并檢測其對CNE-1細胞增殖、侵襲以及CXCL12蛋白的表達情況的影響，對其在人鼻咽癌中可能的調(diào)節(jié)機制進行初步的探究。

1 材料與方法

1.1細胞培養(yǎng)人鼻咽癌細胞株 CNE-1,從中國科學院上海生命科學研究院細胞資源中心獲得。CNE-1細胞接種于含10%FBS的 H1640 培養(yǎng)基中，置于37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細胞貼壁生長后胰酶消化處理后傳代培養(yǎng)，選擇對數(shù)生長期的細胞進行后續(xù)實驗。

1.2miR-130a-3p轉(zhuǎn)染鼻咽癌細胞miR-130a-3p 模擬物(miR-130a-3p mimics)和陰性對照模擬物miRNA-NC，miR-130a-3p NC inhibitor均由上海吉瑪制藥技術有限公司合成。當培養(yǎng)瓶中的CNE-1細胞密度增長到80%-90% 時，用胰酶消化后收集細胞以2.5×105個細胞/孔接種到6 孔板中，繼續(xù)培養(yǎng)至細胞單層密度達40%-50% 時，分別將miR-130a-3p摸擬物(實驗組)或miRNA-NC及miR-130a-3p NC inhibitor(對照組)轉(zhuǎn)染入CNE-1細胞。

1.3CCK-8法檢測細胞增殖將miR-130a-3p mimics和miRNA-NC兩組轉(zhuǎn)染后的CNE-1細胞經(jīng)胰酶消化并收集細胞吹散稀釋，調(diào)節(jié)濃度至3×105/ml，以3 000/孔均勻接種在96 孔板，每板2組，每組4個復孔。將孔板放置在培養(yǎng)箱中孵育，培養(yǎng)條件為37℃，5%CO2，分別于24，48，72 h取出孔板，加入CCK-8 溶液10 μl/孔37℃，5%CO2溫箱中繼續(xù)孵育 2 h。用酶標儀測定每孔細胞溶液在450 nm 波長處的光吸收值。重復3次。

1.4Transwell試驗檢測細胞的侵襲能力預先將Matrigel放置在4℃冰箱中24 h。 用H1640 培養(yǎng)基按 3:1 稀釋Matrigel膠，加入Transwell 小室上室(30 μl/孔)，37℃、5%CO2下培養(yǎng)箱內(nèi)孵育5 h。吸出小室中殘留的液體，加入無血清H1640 培養(yǎng)基(50 μl/孔)后在37℃下孵育 30 min ，棄去培養(yǎng)基。向每個Transwell小室中接種200 μl 5×105/ml的細胞懸液，小室下方加入600 μl 含 20%血清的 H1640 培養(yǎng)基，將小室置于孔板中，37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)箱中孵育36 h，棄培養(yǎng)液， PBS洗滌3次，吸出殘留液，固定，染色，再次PBS洗滌。拭去上室面細胞后使用倒置顯微鏡下進行拍照計數(shù)，每次隨機選取5個視野，每組進行3 次實驗。

1.5預測miR-130a-3p的靶基因利用 Target Scan、Pic Tar、mi Randa 生物信息學分析工具，預測hsa-miR-130a-3p可能的靶基因。預測結(jié)果顯示，hsa-miR-130a-3p 可以靶向結(jié)合CXCL12 -3'UTR。

1.6WesternBlot檢測CXCL12蛋白表達在冰上用預冷的PBS對轉(zhuǎn)染后的細胞洗滌2 次，離心，取上清液，裂解細胞。取少量蛋白樣用BCA 法測定蛋白濃度。將蛋白溶液以30 μg/孔加樣到孔板中， 10% SDS-PAGE上電泳分離，轉(zhuǎn)膜； 5% 脫脂奶粉溶液封閉孵育1 h，加入一抗PBST稀釋液4℃孵育過夜； 再次PBST洗膜3次，每次10 min。加入二抗PBST稀釋液，密封，室溫下?lián)u床緩慢震蕩孵育2 h ； PBST洗膜3 次，每次10 min。在暗室中應用雙色紅外激光成像系統(tǒng)檢測蛋白條帶。實驗重復3 次。

2 結(jié)果

2.1miR-130a-3p可抑制鼻咽癌細胞增殖相較對照組，CNE-1 細胞株轉(zhuǎn)染miR-130a-3p mimics后，細胞增殖減慢，而轉(zhuǎn)染 miR-130a-3p inhibitor后的細胞增殖加快。說明miR-130a-3p mimics可以抑制鼻咽癌細胞增殖，見圖1。

圖1 miR-130a-3p抑制CNE-1細胞增殖(P<0.001)

2.2miR-130a-3p抑制鼻咽癌細胞的侵襲能力相較對照組，CNE-1 細胞株轉(zhuǎn)染miR-130a-3p mimics后，穿膜細胞數(shù)減少，而轉(zhuǎn)染miR-130a-3p inhibitor后細胞穿膜數(shù)增加，見圖2。證明miR-130a-3p抑制CNE-1細胞的侵襲能力。

2.3miR-130a-3p抑制鼻咽癌細胞上CXCL12蛋白的表達相較對照組，CNE-1 細胞株轉(zhuǎn)染miR-130a-3p mimics后，細胞的CXCL12表達水平下降，說明miR-130a-3p可下調(diào)CXCL12蛋白的表達水平(t=4.256，P<0.05)，見圖3。

圖2 Transwell實驗提示： miR-130a-3p mimics可明顯減少CNE-1的侵襲細胞數(shù)(P<0.001)

圖3 miR-130a-3p 對CNE-1細胞CXCL12 蛋白表達的影響

3 討論

鼻咽癌是耳鼻喉科常見的頭頸部惡性腫瘤，其治療失敗的因素常常歸結(jié)為腫瘤復發(fā)和轉(zhuǎn)移。Micro RNA 是一類僅占基因組序列1%-3%的進化上高度保守的非編碼小分子單鏈RNA，可通過與特定的mRNA完全或不完全堿基互補引導沉默體降解靶mRNA或阻礙其翻譯，在轉(zhuǎn)錄水平上對基因活動的各個層面進行調(diào)節(jié)，并調(diào)控靶基因的蛋白表達。近年研究發(fā)現(xiàn)，多數(shù)miRNA處于染色體上與腫瘤相關的區(qū)域，越來越多的研究證實，在惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展的各個階段都有miRNA的參與，可在各種腫瘤中發(fā)揮抑制腫瘤或引起腫瘤的生物學作用[6]。目前，已有研究顯示miR-130a-3p 在肝胰島素敏感性和肝脂肪變中發(fā)揮重要作用，并且在尿道膀胱癌中與腫瘤的發(fā)生和發(fā)展也密切相關[1]。Chen HC等[2]研究顯示，miR-130a-3p在鼻咽癌中低度表達，但其與鼻咽癌侵襲和轉(zhuǎn)移的關系及作用機制尚未完全闡明。

趨化因子(CXCL12)是一類在多種腫瘤中高度表達的控制免疫細胞向炎癥定向遷移的細胞因子，與腫瘤的生長，侵襲和轉(zhuǎn)移相關[3-5]。已有研究顯示CXCL12的表達在鼻咽癌組織中存在與該腫瘤TNM分期呈正相關的現(xiàn)象，提示CXCL12可能與鼻咽癌細胞的生長、侵襲和轉(zhuǎn)移有關聯(lián)[5]。

在我們的實驗中，采用CCK-8 法檢測觀察到過表達miR-130a-3p后鼻咽癌細胞增殖能力降低，說明miR-130a-3p在鼻咽癌中可有效抑制鼻咽癌細胞增殖，應用Transwell 試驗表明過表達miR-130a-3p 對鼻咽癌細胞的侵襲和遷移具有顯著抑制作用。綜合我們的實驗結(jié)果證明了 miR-130a-3p可在鼻咽癌中作為一種抑癌基因發(fā)揮抑制腫瘤的作用。 很多研究證實miR-130a-3p經(jīng)多種生物信息學軟件可以預測 microRNA靶位點[7-9]，因此我們在上百種靶基因中選取與腫瘤細胞侵襲轉(zhuǎn)移密切相關的CXCL12進行后續(xù)實驗。在本研究中，miR-130a-3p模擬物轉(zhuǎn)染的鼻咽癌細胞CXCL12蛋白的表達量明顯地下降，提示過表達miR-130a-3p后可以下調(diào)CXCL12蛋白的表達水平，所以CXCL12是miR-130a-3p發(fā)揮抑制鼻咽癌細胞增殖、侵襲和遷移的作用的相關因子。本研究仍需要后續(xù)實驗證實，miR-130a-3p與CXCL12間具體關聯(lián)機制有待進一步研究，為增加鼻咽癌生物學標記物及鼻咽癌的診治提供新思路。

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TheeffectofmiR-130a-3ponfunctionofhumannasopharyngealcarcinomacells

CNE-1bydown-regulatingtheexpressionofCXCL12LIUChun-li,ZHANGJie,QIZhi-wei,etal.

(AffiliatedHospitalofChengdeMedicalCollege,Chengde067000,China)

Objectiveto investigate the effect of miR-130a-3p on the function of human nasopharyngeal carcinoma cell CNE-1 and its possible target genes.Methodsusing liposome mediated method,analogue of miR-130a-3p (experimental group) or analogue control (control group) were transfected into CNE-1 cells,respectively using CCK-8 method and Transwell test for cell proliferation migration and invasion changes,Western Blot detection of chemokine CXCL12 protein expression.Resultscompared with the control group,the proliferation,invasion and migration ability of CNE-1 cells in the experimental group were increased (P<0.05),and the expression level of CXCL12 protein in the cells was significantly lower(P<0.05).ConclusionmiR-130a-3p may inhibit the proliferation,invasion and migration of human nasopharyngeal carcinoma cell line CNE-1 by regulating the expression of CXCL12 protein.

nasopharyngeal carcinoma;chemokines;CXCL12;miR-130a-3p;CNE-1 cells

*通訊作者

1007-4287(2017)12-2168-03

R739.6

A

2017-01-12)