佟曦然，郭豪杰，羅麗，張昭，齊耀東，張本剛

(中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 藥用植物研究所，中草藥物質(zhì)基礎(chǔ)與資源利用教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100193)

·基礎(chǔ)研究·

柬埔寨民間習(xí)用靈芝與伴生真菌拮抗特性評價(jià)△

佟曦然，郭豪杰，羅麗，張昭，齊耀東**，張本剛**

(中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 藥用植物研究所，中草藥物質(zhì)基礎(chǔ)與資源利用教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100193)

目的分離并鑒定柬埔寨野生靈芝菌株及伴生菌，通過拮抗試驗(yàn)初步評價(jià)伴生真菌對靈芝的影響。方法對64個(gè)分離自柬埔寨靈芝的真菌樣品進(jìn)行了ITS序列鑒定，對檢出的靈芝菌株與相同子實(shí)體中分離到的伴生真菌進(jìn)行了拮抗試驗(yàn)。結(jié)果檢出22株靈芝，占比34.4%，全部鑒定為Ganodermalingzhi；在非靈芝菌株中最常見的是炭角菌屬(Xylaria)及炭團(tuán)菌屬(Hypoxylon)，分別占比35.9%及15.6%，另檢出靈芝病原真菌1株，鑒定為靈芝腐敗木生紅曲霉Xylogoneganodermophthora；檢出藥用真菌1株，鑒定為白囊耙齒菌Irpexlacteus。實(shí)驗(yàn)證明靈芝菌株間的拮抗作用更為突出，而靈芝與伴生真菌之間能交織生長，這影響到靈芝的品質(zhì)。結(jié)論柬埔寨民間習(xí)用靈芝的藥用特性尚需專業(yè)而系統(tǒng)的研究，方可確立為藥用靈芝種質(zhì)與資源的一個(gè)新自然分布區(qū)與產(chǎn)地；當(dāng)?shù)靥拷蔷鷮僬婢约安珊髢Σ胤绞绞怯绊懠砥艺`芝品質(zhì)或用藥道地性的重要因素。

柬埔寨；野生靈芝菌株；ITS序列；伴生真菌；拮抗；品質(zhì)

1 材料

1.1 靈芝子實(shí)體

野生靈芝新鮮幼嫩子實(shí)體購自柬埔寨戈公省私人售賣攤位(見圖1)。挑選新鮮幼嫩未木質(zhì)化子實(shí)體，采用兩種儲藏方式：1)4 ℃封藏：塑料袋密封4 ℃冷藏(菌株采集編號首數(shù)字為2的樣品，2系列)；2)常溫陰干：塑料袋常溫封存,但每日取出陰干(菌株采集編號首數(shù)字為6的樣品，6系列)。對照菌株購自中國普通微生物菌種保藏管理中心，其中編號26為CGMCC5.26靈芝(紅芝，赤芝，G.lucidum)；編號69為CGMCC5.69中華靈芝(紫芝，G.sinense)。

注：1.野生靈芝售賣攤位；2～3.4 ℃封藏樣品(2系列)正反面；4～7.常溫陰干樣品(6系列)正反面。圖1 柬埔寨野生靈芝子實(shí)體

1.2 儀器試劑

植物基因組DNA提取試劑盒(Tiangen Biotech Co.，中國)，2×Tag PCR Master Mix(北京艾德萊生物科技有限公司，中國)，ITS通用引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。高通量組織研磨儀(Retsch MM400，Germany)，T100TMThermal Cycler PCR儀(BIORAD?，USA)，1-14K小型高速離心機(jī)(SIGMA，Germany)。

2 方法

2.1 培養(yǎng)基

菌種分離培養(yǎng)基PDA1、菌種活化培養(yǎng)基PZDA1、液體薄層培養(yǎng)基PDA2詳見表1。

表1 菌種分離鑒定用培養(yǎng)基 g

2.2 菌種分離

采用組織分離法，分別挑取菌柄內(nèi)組織(S)和菌蓋內(nèi)組織(P)，于PDA1平板24 ℃培養(yǎng)7～10 d后棄去可辨雜菌污染，挑取組織塊上萌生的白色或近白色菌絲轉(zhuǎn)接至PDA1斜面，于24 ℃培養(yǎng)2～3周后轉(zhuǎn)入4 ℃冷藏。

2.3 ITS序列鑒定樣品的準(zhǔn)備

4 ℃儲藏各菌株于PZDA1平板24 ℃活化培養(yǎng)10 d后，取菌落邊緣φ4.5 mm的菌片接種于PDA2液體薄層，每編號重復(fù)3瓶，每瓶5 mL。24 ℃培養(yǎng)25 d后，3瓶重復(fù)菌絲合并，于35 ℃烘干后轉(zhuǎn)入2 mL凍存管，-20℃封存。

2.4 DNA提取、擴(kuò)增及測序

稱取干燥樣品約30 mg，用高通量組織研磨儀研磨2 min(30 Hz)后，按照植物基因組DNA提取試劑盒說明書操作步驟提取總DNA。PCR擴(kuò)增引物、反應(yīng)體系和反應(yīng)程序參考《中國藥典中藥材DNA條形碼標(biāo)準(zhǔn)序列》[5]，ITS序列擴(kuò)增使用的正向引物為5F：5′-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3′，反向引物為4R：5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′。反應(yīng)體系為2×Tag PCR Master Mix 12.5 μL，正反向引物(2.5 μmol·L-1)各1.0 μL，DNA模板2.0 μL，加無菌ddH2O補(bǔ)至25 μL。反應(yīng)程序：94 ℃ 5 min；94 ℃ 1 min；50 ℃ 1 min；72 ℃ 1.5 min，每循環(huán)1次增加3 s，30個(gè)循環(huán)；72 ℃ 7 min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖電泳檢測后，由測序公司進(jìn)行雙向測序。

2.5 數(shù)據(jù)處理

將測序峰圖用Codon Code Aligner軟件進(jìn)行拼接，切除兩端引物及低質(zhì)量序列得到ITS序列。利用網(wǎng)絡(luò)版BLAST(https：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)，對得到的序列進(jìn)行鑒定。根據(jù)BLAST鑒定結(jié)果，從Genbank下載最相近序列。利用MEGA 6.0軟件[6]，對所得到的序列進(jìn)行序列比對，并基于K2P模型，利用鄰接(NJ)法構(gòu)建系統(tǒng)聚類樹(bootstrap：1000)。

2.6 靈芝與伴生真菌的拮抗現(xiàn)象觀察

選取分子鑒定后的各靈芝菌株之間、靈芝菌株與相同子實(shí)體分離得到的對應(yīng)半生真菌為拮抗對，經(jīng)PDA1活化后在PZDA1平板上進(jìn)行對峙培養(yǎng)，26 ℃培養(yǎng)5 d后觀察雙方菌絲間的拮抗情況，拍照并分析。分別采用田字、三叉接種法觀察2、3個(gè)菌株的相互拮抗關(guān)系，采用十字架接種法觀察1對3種菌株的相互拮抗關(guān)系；其中田字法并列接種相同菌株、三叉法和十字架法延徑向外側(cè)接種與內(nèi)側(cè)相同菌株，以相同菌株間的融合生長現(xiàn)象作為另側(cè)拮抗現(xiàn)象的直觀對照。

3 結(jié)果與分析

3.1 菌種分離

各菌株培養(yǎng)過程中的外觀性狀詳見表2。雖然在不同培養(yǎng)基上有差異，液體薄層中變化更大，但大多數(shù)菌株表現(xiàn)出與靈芝菌絲相似的特點(diǎn)，諸如新生菌絲白色，老熟菌絲顯現(xiàn)黃褐色，由于外觀性狀有較大重疊，且其后的拮抗試驗(yàn)顯示靈芝與非靈芝菌絲間可交織生長，造成混淆，須配合分子手段鑒別。

表2 各菌株在PZDA1及PDA2中的菌落性狀

3.2 ITS測序及鑒定結(jié)果

本實(shí)驗(yàn)共得到64株分離樣品及2株對照樣品26和69的ITS序列，ITS序列長度為475～647 bp，平均GC含量為47.8%。將所得序列進(jìn)行BLAST檢索，并下載最相近序列構(gòu)建NJ樹。結(jié)果顯示64株分離樣本中靈芝屬有22株，占比34.4%；其中19株與G.lingzhi的BLAST相似性最高，3株與G.sichuanense的BLAST相似性最高，1株與G.lucidum的BLAST相似性最高，在NJ樹中它們聚在一枝，且支持率為92%，因此本研究將三者歸并定為G.lingzhi。鑒于與對照株26(G.lucidum)之間≥99%的相似性，結(jié)合文獻(xiàn)研究與論證[2，7]，本研究認(rèn)為G.lingzhi、G.sichuanense與GenBank中諸多記錄為G.lucidum的中國栽培芝種之間顯著趨同，但柬埔寨靈芝的藥用特性仍需與諸多中國栽培靈芝菌株進(jìn)一步比較研究。對照株69已知為紫芝(G.sinense)，與GenBank發(fā)表的G.japonicum和G.sinense有較高的BLAST相似性，NJ樹聚成一個(gè)分枝，且支持率為100%，結(jié)果支持學(xué)界通常認(rèn)為G.sinensis與G.japonicum為同物異名的觀點(diǎn)。

在非靈芝菌株主要為炭角菌屬(Xylaria，23株)及炭團(tuán)菌屬(Hypoxylon，10株)，分別占比35.9%及15.6%。另有其他屬9株。23株炭角菌屬樣品中，有8株樣品鑒定為Xylariasp.，7株鑒定為斐濟(jì)炭角菌Xylariafeejeensis，4株鑒定為古巴炭角菌Xylariacubensis，2株鑒定為類陀螺炭角菌Xylariaapoda，1株鑒定為暗棕炭角菌Xylariabadia；10個(gè)炭團(tuán)菌屬樣本與芬德勒氏炭團(tuán)菌Hypoxylonfendleri)BLAST相似性較低(95%～97%)，但在NJ樹中與Hypoxylonfendleri構(gòu)成的分枝支持率為100%，因此這些樣本被暫定為Hypoxylonfendleri；在Phanerochaete屬的2個(gè)樣本中，1個(gè)樣本BLAST最相似的物種有兩個(gè)，另一個(gè)最相似物種為Phanerochaetesp.，并且兩者在NJ樹中聚在一枝，因此都被鑒定為Phanerochaetesp.。其他樣本BLAST結(jié)果與NJ樹結(jié)果一致，具有較高的可信度，具體鑒定結(jié)果見圖2。

3.3 樣品儲藏方式的影響

由兩種儲藏方式中靈芝的檢出情況可見，4 ℃封藏方式得到靈芝的比例僅為5.0%，遠(yuǎn)低于常溫陰干方式的47.7%，說明采后保存方式明顯影響靈芝的帶菌程度。另外，由菌柄組織(S)分離到靈芝14株(占63.6%)；顯著優(yōu)于菌蓋組織(P)(8株，占36.4%)。

將兩種儲藏方式中非靈芝菌株的檢出情況進(jìn)行整理，見表3。非靈芝菌株主要為炭角菌屬真菌，其次為炭團(tuán)菌屬。常溫陰干條件下，主要為炭角菌屬真菌污染，在菌蓋中更為嚴(yán)重(69.2%)；在4 ℃封藏條件下，低溫及飽和濕度明顯抑制了靈芝菌蓋中炭角菌屬真菌(16.7%)和子實(shí)體本身的活力，這時(shí)炭團(tuán)菌屬真菌在菌蓋中迅速增長，占據(jù)優(yōu)勢地位(83.3%)。因此，采收后的加工儲藏環(huán)節(jié)對保存柬埔寨靈芝原始品質(zhì)尤為關(guān)鍵。

表3 非靈芝菌株檢出情況

3.4 靈芝菌株之間以及靈芝與炭角菌和炭團(tuán)菌之間的拮抗特點(diǎn)

拮抗試驗(yàn)結(jié)果見表4。結(jié)果顯示各菌株之間出現(xiàn)相容、拮抗和交織并存3種情況。其中菌絲相容現(xiàn)象全部出現(xiàn)在某菌株與它自己之間(見圖3)，與對側(cè)接種的另類菌株形成鮮明對照；拮抗現(xiàn)象全部出現(xiàn)在任一靈芝菌株與其他靈芝菌株之間(見圖3)；而菌落交匯處菌絲交織并存現(xiàn)象全部出現(xiàn)在靈芝與同芝來源的伴生真菌之間(見圖3)。各靈芝菌株之間的拮抗現(xiàn)象說明體細(xì)胞不親和性的廣泛存在，這種菌株異質(zhì)性構(gòu)成了柬埔寨靈芝遺傳多樣性的物質(zhì)基礎(chǔ)，成為靈芝品種選育與發(fā)展種植產(chǎn)業(yè)的種源基礎(chǔ)。靈芝生活菌絲與伴生真菌之間未見顯著的排斥或相互免疫，而是在菌落交匯處菌絲交織并存，這反映出靈芝與當(dāng)?shù)啬承┐硇哉婢g存在較為親密的共存關(guān)系，雙方菌絲一定程度上扭結(jié)生長在一起，這必然影響到靈芝的品質(zhì)。

注：NJ樹各分枝中已知物種名和Genbank號的序列為Genbank下載的參考序列；分枝前的兩個(gè)數(shù)字，前者為分枝支持度，后者為該份樣品序列與參照序列的最小BLAST相似性；NJ樹右側(cè)的物種名，為對應(yīng)樣本推薦鑒定的物種名。圖2 柬埔寨靈芝樣品及最相近序列NJ樹

比較組合菌株編號中文名拉丁名培養(yǎng)6d后結(jié)果167S1靈芝Glingzhi交織生長67P1炭角菌屬Xylariasp2621S1靈芝Glingzhi弱交織生長?621P1古巴炭角菌Xylariacubensis3644S1靈芝Glingzhi交織生長644P1鐮刀菌屬Fusariumsp421S1靈芝Glingzhi交織生長28P2炭角菌屬Xylariasp212P1芬德勒氏炭團(tuán)菌Hypoxylonfendleri215S2暗棕炭角菌Xylariabadia與21S1弱交織生長?5619S1靈芝Glingzhi619S2斐濟(jì)炭角菌Xylariafeejeensis619P1靈芝Glingzhi交織生長6637S1靈芝Glingzhi637P1斐濟(jì)炭角菌Xylariafeejeensis637P2類陀螺炭角菌Xylariaapoda交織生長726靈芝Glingzhi各靈芝菌株間相互拮抗，其619P1靈芝Glingzhi中，21S1與26及67S1之間625S1靈芝Glingzhi為弱拮抗644S1靈芝Glingzhi826靈芝Glingzhi21S1靈芝Glingzhi67S1靈芝Glingzhi967S1靈芝Glingzhi619S1靈芝Glingzhi621S1靈芝Glingzhi637S1靈芝Glingzhi

注：*弱交織生長表現(xiàn)為僅在菌落接觸面有交織生長，不向?qū)Ψ骄淇v深發(fā)展。

注：1～9分別對應(yīng)表4比較組合1～9。圖3 靈芝菌株之間以及與炭角菌和炭團(tuán)菌之間的拮抗

4 討論

4.1 檢測結(jié)果中靈芝種類的單一性

分離到的靈芝菌種集中為G.lingzhi，與荳蔻山原始熱帶雨林中靈芝的生物多樣性不符，分析原因應(yīng)為選材時(shí)間和采集地點(diǎn)集中，而且僅選擇發(fā)育幼嫩程度較一致的子實(shí)體所致，許多外觀典型的假芝、喜熱靈芝、熱帶靈芝、擬熱帶靈芝的子實(shí)體因當(dāng)時(shí)已發(fā)育成熟并嚴(yán)重木質(zhì)化，不易分離菌種，因而未收集。張杰等[8]將G.sichuanense歸為亞熱帶分布的種類，而對于原生于豆蔻山熱帶雨林的G.sichuanense和G.lingzhi，需進(jìn)一步比較與中國常用栽培種的產(chǎn)量、品質(zhì)特性，才能更精確闡明其藥用特性。

4.2 對原生植被研究的重要性

除少數(shù)寄主專一性較強(qiáng)的種類外，通常靈芝可生長在多種硬木類闊葉樹的腐木上，大量研究顯示不同菌材顯著影響靈芝的質(zhì)量[9]。豆蔻山熱帶雨林水分及光熱資源充足、植被茂盛、群落結(jié)構(gòu)復(fù)雜，為木腐真菌提供了多樣化的生長基質(zhì)，從而導(dǎo)致當(dāng)?shù)仂`芝品質(zhì)存在變化。然而，對柬埔寨植物的研究幾乎處在空白狀態(tài)，對原生植被的研究是影響當(dāng)?shù)仂`芝產(chǎn)業(yè)科學(xué)并可持續(xù)發(fā)展的基礎(chǔ)。同時(shí)，特有的熱帶氣候環(huán)境為靈芝的品種選育提供了理想的試驗(yàn)田。

4.3 伴生菌對靈芝藥材的影響及采收加工的規(guī)范化

野生靈芝在自然環(huán)境中生長發(fā)育，子實(shí)體原基發(fā)生于枯立木、老樹樁或地表以下樹根上，因此菌柄容易夾帶更多土壤微生物，而菌蓋更多接觸地表以上山谷風(fēng)中的游離微生物。實(shí)驗(yàn)證實(shí)，分離自菌柄與菌蓋的非芝微生物種類有明顯差異(見表3)。研究顯示炭角菌屬、炭團(tuán)菌屬常常為植物內(nèi)生真菌并產(chǎn)生豐富的次生代謝物[10-12]，具有多種藥理活性，因此，以森林腐木為基料的野生靈芝其生長發(fā)育和品質(zhì)必定受到影響；同時(shí)，研究還證明共生的炭角菌能參與到寄主的代謝中，形成與寄主相同或相似的代謝產(chǎn)物[12-13]，最終影響藥材的道地性[14]。本研究結(jié)果顯示靈芝與伴生真菌菌絲間的交織生長現(xiàn)象提示了半生真菌影響靈芝品質(zhì)的可能性，需要更深入的研究。同時(shí)，特定氣候條件下的微生物環(huán)境顯然是促成柬埔寨靈芝道地性的原因之一。

藥材的微生物毒素污染引起各國政府的重視，越來越多內(nèi)容被列入到檢測條款中[15]。剛采摘的靈芝表面有糖性物質(zhì)，明顯粘手，很適合微生物生長。分析本研究結(jié)果可知，采摘后迅速脫水干燥是保持靈芝原初品質(zhì)最為簡單有效的方法，但這在柬埔寨當(dāng)?shù)卮址艞l件下很難做到；因此，因地制宜規(guī)范采收加工操作流程，是保證柬埔寨野生靈芝品質(zhì)的必要條件。

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EvaluationofAntagonisticEffectbetweenGanodermaIsolatesandCompanionFungifromCambodia

TONG Xiran，GUO Haojie，LUO Li，ZHANG Zhao，QI Yaodong*，ZHANG Bengang*

(InstituteofMedicinalPlantDevelopment，ChineseAcademyofMedicalSciences，PekingUnionMedicalCollege，KeyLaboratoryofBioactiveSubstanceandResourcesUtilizationofChineseHerbalMedicine，MinistryofEducation，Beijing100193，China)

Objective:To isolate and identify ferineGanodermaisolates in Cambodia and its companion fungi，and evaluate the influence of companion fungi by antagonistic test.Methods64 fungal strains from the folk usedGanodermain Cambodia were investigated by analysis of ITS sequences.The relationship ofGanodermaand companion fungus which came from the same fruiting body were judged by antagonistic effect.Results22 isolates wereGanoderma，in the proportion of 34.4%，including 19Ganodermalingzhiand 3Ganodermasichuanense.XylariaandHypoxylonwere most commonly in non-Ganoderma，in the proportion of 35.9% and 15.6%，respectively.In addition，aGanodermapathogen was isolated and identified asXylogoneganodermophthora，a medicinal fungus was isolated and identified asIrpexlacteus.It is proved that the antagonistic effect was more evident amongGanodermaisolates，but interwoven growth occurred betweenGanodermaand companion fungus，this will affect the quality of Ganoderma.ConclusionThe medicinal properties still need professional and systematic research of the folk used ferineGanodermain Cambodia，and then be able to established as a new natural distribution or producing area of medicinalGanodermagermplasm or resources.The nativeXylariaand storage mode are more important factors to affecting the quality or Geo-herbalism of CambodiaGanoderma.

Cambodia；ferineGanodermaisolates；ITS；companion fungus；antagonistic test；quality

10.13313/j.issn.1673-4890.2017.9.003

中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)與健康科技創(chuàng)新工程項(xiàng)目(2016-I2M-2-003)

*

齊耀東,博士,助理研究員,研究方向:中藥資源與瀕危藥用植物保護(hù)、分子系統(tǒng)學(xué)與分子地理學(xué)，Tel:(010)57833196,E-mail:ydQi@implad.ac.cn；張本剛,研究員，博士生導(dǎo)師，研究方向：中藥資源鑒定及保護(hù)利用,Tel：(010)62899725，E-mail：bgzhang@implad.ac.cn

2017-01-06)